L’oxydase de l’acide 1-AminoCyclopropane Carboxylique (ACC Oxydase, ACCO) catalyse la formation de l’éthylène, hormone essentielle à la vie des plantes. L’ACCO catalyse l’oxydation de l’ACC en éthylène en présence de dioxygène et de deux électrons (fournis in vitro par l’ascorbate). L'activité de l'enzyme requière également, pour des raisons encore incomprises, la présence de CO2 sous la forme d'ions bicarbonates. Il s’agit d’une enzyme qui contient un ion fer(II) dans un environnement non-hémique au site actif. Etant donné l’importance de l’éthylène chez les plantes, l’ACCO, ainsi que les autres enzymes impliquées dans sa biosynthèse, ont été très étudiées durant les vingt dernières années. Cependant, peu d’études ont porté sur le rôle de l’ion métallique et le mécanisme d’action ou sur les surprenants processus d’inactivation subis par l’enzyme. L’ACCO est en effet une enzyme connue pour son instabilité. Nous avons tout d’abord entrepris une caractérisation physicochimique et biochimique de l’enzyme. Le matériel protéique utilisé a tout d’abord été analysé une coupure entre les résidus Ala 290 et Gly 291 a été observée au cours de la purification de l'enzyme. Puis, grâce à l'utilisation de techniques spectroscopiques, nous avons cherché à obtenir plus d'informations sur la fixation des substrats/cofacteurs au site actif. Enfin l’étude des mutants et des complexes modèles de l’ACCO a été réalisée afin de mieux comprendre le mécanisme catalytique et de rechercher de nouvelles activités. Nous nous sommes aussi intéressés aux mécanismes d’inactivation de l’ACCO. En présence des effecteurs en excès, cette inactivation se traduit par une fragmentation et une modification de charge. Lorsque la concentration en fer est limitée, aucune modification physique de l’enzyme inactive n’est observée et l'enzyme garde un contenu global en aminoacide et une conformation tridimensionnelle intègres. Des processus oxydatifs se déroulant directement au site actif de l’enzyme sont susceptibles d’engendrer une telle perte d’activité par l'oxydation d'un nombre limité d'acides aminés. Des études en spectrométrie de masse ont été entreprises et sont toujours en cours afin d'identifier les modifications responsables de la perte d'activité de l'enzyme.Enfin nous avons recherché d’éventuelles partenaires protéiques qui pourraient conférer à l’ACCO une meilleure stabilité. Des études préliminaires ont été entreprises et des données de microscopie suggèrent que l'ACCO est localisée près des membranes de la vacuole. / The 1-AminoCyclopropane Carboxylic acid oxidase (ACC Oxidase, ACCO) catalyzes the last step of the biosynthesis of the plant hormone, ethylene. ACCO catalyzes the oxidation of ACC into ethylene in the presence of dioxygen and two electrons (provided in vitro by ascorbate). Carbon dioxide (or bicarbonate ions) are also required for optimum activity. ACCO is an non-heme iron(II) containing enzyme. Given the importance of ethylene in plants, studies on ACCO, as well as on the other enzymes involved in its biosynthesis, have attracted much attention in the past two decades. However, few studies focus on the role of the metal ion and on the catalytic mechanism or the intriguing inactivation processes. ACCO is indeed known for its instability. We first purified and characterised the enzyme. During the purification, a cleavage between residues Ala 290 and Gly 291 was observed. Then, using spectroscopic techniques, we intended to get more information on cofactor's binding in the active site. Finally studies of mutants and model complexes of ACCO were performed in order to get a better understanding of the catalytic mechanism and to look for new activities.We were also interested in the inactivation processes of ACCO. In the presence of an excess of effectors, this inactivation resulted in fragmentation and in pI modification. When the concentration of iron is limited, no modifications of the inactive enzyme were observed. The inactive enzyme maintained its amino acid content and three-dimensional conformation. The loss of activity is therefore likely to derive from oxidative processes directly at the active site. Mass spectrometry experiments were initiated and are still under progress. Finally we were interested in identifying possible protein partners of ACCO that could provide a better stability. Preliminary studies were thus initiated and from microscopy results, ACCO was found located close to the vacuole membrane.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

La canne à sucre est une plante sucrière dont le jus contient des molécules naturelles pouvant être valorisées comme l’acide aconitique. Cet acide, présent en grande quantité dans le jus de canne, se retrouve tout au long du procédé sucrier et dans les co-produits issus de cette industrie. Dans le cadre du projet V2ARUN, il a été envisagé d’extraire l’acide aconitique à partir d’un des co-produits issus de l’industrie de sucrière de La Réunion. La précipitation, l’extraction liquide-liquide et les résines échangeuses d’ions sont les trois techniques d’extraction envisageables pour récupérer l’acide aconitique à partir de mélasse ou de vinasse issues de l’industrie sucrière réunionnaise. Suite à une comparaison de ces trois techniques d’extraction, il a été choisi de récupérer l’acide aconitique par chromatographie sur résines échangeuses d’ions à partir de vinasse de distillerie, car ce co-produit n’est pas encore valorisé à La Réunion. Deux résines anioniques ont été retenues pour cette extraction. Après avoir identifié les mécanismes de fixation de différents acides carboxyliques sur ces résines en réacteur agité, des essais sur colonne ont été réalisés et une proposition de procédé d’extraction d’acide aconitique à partir de vinasse sur une résine faiblement anionique a été élaborée. / Sugar cane juice contains lot of natural molecules which can be recovered, such as saccharose or carboxylic acids. The aconitic acid, which is the predominant molecule besides sugar, is found throughout sugar process and into by-products from sugar cane industry of La Reunion Island, has been considered. Precipitation, liquid-liquid extraction and ion exchange resins are three possible extraction process to recover carboxylic acid from molasse and distillery stillage (vinasse) coming from La Reunion sugar industry. After studying this three extraction process, the choice has been made to recover aconitic acid from vinasse by ion exchange resins. This by-product has been chosen because it is still not promoted in La Reunion Island. Amongst height ion exchange resins tested, two anionic resins showed better performance to recover aconitic acid from this by-product. The fixation mechanisms of different carboxylic acids onto those two resins have been identified using aqueous solutions of lactic, malic, citric and aconitic acids. Some column experiments of aconitic acid extraction from sugarcane vinasse have been done on laboratory scale with the two anionic resins and on semi-industrial scale with the weakly anionic resin. Finally, a complete aconitic acid extraction process has been proposed.

Les pyréthrinoïdes sont des insecticides auxquels la population est quotidiennement exposée. Le composé parent est suspecté d’induire des perturbations neuronales et hormonales chez l’homme. Au sein de cette famille, la perméthrine (mélange d’isomère cis et trans) est le composé le plus utilisé dans le traitement des intérieurs de maison. Dans ce travail de thèse, nous proposons de développer un modèle PBPK pour la perméthrine et certains de ses métabolites urinaires, utilisés comme biomarqueurs d’exposition, et d’évaluer les interactions métaboliques des deux isomères. Trois étapes ont été suivies. Une méthode analytique par GC-MS/MS a été développée pour doser simultanément les composés dans les différentes matrices. Un modèle PBPK de la perméthrine chez le rat a été associé à un modèles PBPK réduit du DCCA et empirique du 4’-OH-PBA et du 3-PBA. Les paramètres toxicocinétiques de chaque composé ont été estimés dans un cadre Bayésien à partir d’expériences in vivo menées à la dose orale de 25 mg/kg de cis- ou trans-perméthrine chez le rat. Le modèle PBPK de la perméthrine a été vérifié sur des données de cinétique d’un mélange cis/trans. Le métabolisme hépatique de chaque composé a été quantifié chez l’homme sur des hépatocytes primaires dans des conditions optimales pour l’extrapolation in vitro-in vivo, en incubant les isomères séparément et en mélange. Ce travail de thèse souligne la possibilité d’établir un modèle PBPK générique pour les pyréthrinoïdes. L’absence d’interaction entre les isomères au niveau in vitro et lors de la vérification du modèle PBPK de la perméthrine pourrait simplifier la caractérisation de l’exposition à un mélange de pyréthrinoïdes. / Population is largely exposed to pyrethroids, an insecticide family. The parent compound is suspected to induce neuronal and hormonal modifications in humans. Among this family, permethrin, a mixture of isomers cis/trans, is mainly used in house tratments. In this PhD project, we developed a PBK model of permethrin and some urinary metabolites uses as biomarkers of exposure. The matabolic interactions between the two isomers were also evaluated. A three steps strategy was followed. An analytical method by GC-MS/MS was developed to measure these compounds simultaneously in the different matrices. A PBPK of permethrin in rat was associated to a reduced PBPK model of DCCA and a 2-compartment model of 4'-OH-PBA and 3-PBA. The toxicokinetics parameters of each compound were estimated in a Bayesian framework from in vivo experiments in rats orally dosed with 25 mg/kg of cis- or trans permethrin. The PBPK model of permethrin was validated on the kinetic data of a mixture of permethrin. The hepatic metabolism was quantified in humans in primary hepatocytes in optimal conditions for in vitro-in vivo extrapolation, by incubating the isomers separately and as a mixture. This work underlines that a general PBPK model for Type 2 pyrethroids can be considered for the parent compound The lack of interaction between isomers during in vitro experiments and the validation of the PBPK model of permethrin could simplify the characterization of the exposure to a mixture of pyrethroids.

La vinasse de distillerie, co-produit de l’industrie canne-sucre-alcool-énergie, contient de 5 à 7 g/L d’un acide d’intérêt, l’acide aconitique, au sein d’un milieu complexe comportant d’autres acides organiques, des acides aminés, mais surtout des sels minéraux (chlorures et sulfates) et des colorants, rendant sa purification complexe. Afin d’améliorer les performances du procédé d’échange d’ions, au coeur de cette purification, la résine anionique faible Lewatit S4528 a été caractérisée. Le dosage de la résine et des mesures d’isothermes d’échange d’ions ont permis de définir : la capacité totale du support, l’ordre d’affinité des principaux anions de la vinasse et les coefficients d’échange d’ions associés, de même que la capacité pour l’acide d’intérêt dans cette matrice complexe. L’effet du pH, de la forme du support (sulfate, chlorure et base libre) et de l’éluant ont été étudiés en colonne pour différentes solutions (acide seul, vinasse « modèle », vinasse réelle), permettant de préciser les mécanismes de la purification.Les meilleures conditions (vinasse à pH 4,5, résine sous forme chlorure et élution par HCl 0,5 N) ont abouti à un éluat d’une pureté de 28 %MS avec un rendement global de 61 %. Pour éliminer les principales impuretés qui persistent dans l’éluat (ions chlorure et sulfate et des colorants), l’électrodialyse s’est avérée un procédé très performant en ce qui concerne l’élimination des ions chlorure (proche de 100 %) tandis qu’une étape d’adsorption sur résine polystyrénique XAD16 permet l’élimination de 80 % de la charge colorante de l’éluat acide. Le couplage le plus intéressant associe microfiltration, échange d’ions, électrodialyse et adsorption. Il permet d’obtenir une pureté estimée à 37 % MS, avec un facteur de purification de 3,6 par rapport à la vinasse initiale. Ces travaux ont permis d’améliorer d’un facteur 2,6 la pureté de l’acide par rapport à des études antérieures et de mieux comprendre les mécanismes de sa purification sur résine anionique faible. / Cane stillage or vinasse, a byproduct of cane industry, contains from 5 to 7 g/L of aconitic acid, a valuable trivalent carboxylic acid belonging to the second class of building block chemicals. Vinasse also contains a variety of organic compounds (organic acids, amino-acids, colouring matters) and minerals (chlorides, sulphates), which makes purification not straightforward. The objective of this work is to develop the extraction of aconitic acid from stillage, with anion exchange as the heart of the process. In order to improve performances, the main characteristics of the selected anion-exchange resin (Lewatit S4528) are studied. Acid-base dosage and ion-exchange equilibrium experiments allow the total capacity of this support and the ion-exchange coefficients for the major competing anions (aconitate, chloride and sulfate) to be obtained. Separation performances in column are studied for different pH, different solutions (aconitic acid alone, synthetic and industrial stillage) and different resin forms (sulfate, chloride and free- base) in order to elucidate the separation mechanisms.Elution step is also investigated. Best conditions are for stillage at its natural pH (pH 4.5) on the resin under chloride form and HCl 0,5N as the eluant. A 28% DM purity and a 61% global recovery are achieved for aconitic acid in the eluate. Main impurities still remaining are chlorides or sulfates and coloring matter. Homopolar electrodialysis proves successful for removing nearly 100% chlorides from aconitic acid with a limited loss of the acid (< 15%). Adsorption step on a polystyrenic resin (XAD16) of an acidic eluate leads to the retention of 80% of the colorants, with only 12% of the acid lost. At last, the most interesting process combination associates microfiltration, anion-exchange, electrodialysis and adsorption. Purity is 37% MS, namely 3.6 higher than the original vinasse. This work enables aconitic acid purity to be improved by a factor of 2.6 compared with prior studies and to have a better comprehension of the mechanisms involved in its purification on weak anionic resin.