O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais. / Oral squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant tumor with high morbidity and mortality rates, and it is difficult to treat. Conventional treatment for oral SCCs includes surgery and radiotherapy that may be followed by chemotherapy. Although these treatments are widely used, they are ineffective against some resistant tumors. Oncologic photodynamic therapy (PDT) has been used as an adjuvant treatment for oral SCCs, especially in less invasive cases that require tumor reduction before surgical resection. However, like conventional treatments, PDT can induce the occurrence of resistant cell populations such as cutaneous carcinomas and colon and breast adenocarcinomas. The hypothesis that oral SCCs develop resistance to PDT has not yet been tested. Therefore, the aims of this study were to investigate whether oral SCCs (SCC9) develop resistance to several cycles of 5-aminolevulinic acidmediated PDT (5-ALA-PDT) and to determine whether the expression of markers associated with cell survival (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR, and Akt) is altered during this process. An oral SCC (SCC9) cell line was used, which was subjected to the following conditions: 1) Control: cultured without any treatment; 2) ALA: incubated with 5-ALA (1 mM for 4 h); 3) LED: treated with LED light (630 nm, 5.86 J/cm2, 22.5 J, 150 mW, 150 s); and 4) PDT: treated with 5-ALA-PDT (with the protocols of the ALA and LED groups combined) generating a lethal dose of 90%. Initially, only one cycle of PDT was administered, and cell viability was determined in all groups 24, 48, 72, and 120 h after irradiation. Subsequently, the DNA fragmentation detection assay (TUNEL) and immunofluorescence analysis of the expression of proteins NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt were performed on viable cells. The fraction of cells that survived the first treatment with 5-ALA-PDT exhibited intense staining for pmTOR and growth potential during the testing period. After these assays, the cells that survived the first cycle were collected, plated, and cultured and were subjected to another cycle of 5- ALA-PDT. This process was repeated five times at various irradiation intensities, and cell viability gradually increased. The cell populations that exhibited 1.5-times higher viability than that detected after the first PDT cycle were considered to be resistant to treatment. The markers analyzed after the first PDT cycle were again assessed in the resistant populations. Four resistant cell populations were obtained with a viability of up to 4.6-times higher than that of the first PDT cycle and LED light treatment, which varied between 5.86 and 9.38J/cm2. The most resistant population exhibited lower intensity of protoporphyrin IX, higher migration capacity, and changes in nuclear morphology. The resistant populations tested showed increased expression of pNF?B, iNOS, pmTOR, and pAkt, but not of the anti-apoptotic Bcl-2 protein. Moreover, an in vivo assay was conducted in rats; oral SCCs were chemically induced and treated with 5-ALA-PDT. The intensity of the immunohistochemical expression of proteins pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR, and pAkt in cells adjacent to the area with necrosis caused by PDT was higher than that observed in the untreated control. In conclusion, oral SCCs treated with 5-ALA-PDT at a lethal dose of 90% exhibited increasing viability after several treatment cycles and overexpression of proteins associated with cell survival both in vitro and in vivo. These results, together with the higher migration capacity, suggest the acquisition of the phenotype of resistance to 5-ALA-PDT. This aspect should be carefully considered when initiating this therapy for oral SCCs.

O carcinoma epidermóide representa mais de 90% das neoplasias malignas de cabeça e pescoço, apresentando taxas elevadas de morbi-mortalidade, porém pouco se sabe sobre as vias de sinalização que estão envolvidas na progressão tumoral. Têm sido relatado na literatura, que alguns estímulos podem ativar a holoenzima PI3K que, por sua vez, desencadeia um processo que induz a fosforilação da proteína Akt (pAkt) que leva a ativação e a translocação do NF-B do citoplasma para o núcleo, onde ocorre a transcrição de genes envolvidos na proliferação e invasão celular. Assim, esse estudo analisou, através dos métodos de Imunofluorescência e Western Blot, a expressão das proteínas pAkt, NF-B e Ciclina D1 em três linhagens de células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6, HN30 e HN31) submetidas a cultivo tridimensional e ensaio de invasão (gerando clones invasivos HN6.1, HN30.1 e HN31.1), ambos realizados com Matrigel®. O pAkt apresentou marcação citoplasmática e nuclear nas linhagens celulares HN6, HN30, HN6.1 e na HN30 submetida ao cultivo tridimensional, todavia, as linhagens celulares HN31, HN30.1, HN31.1 e HN6/HN31 cultivadas tridimensionalmente, apresentaram positividade predominantemente nuclear. No caso do NF-B, a localização foi marcadamente citoplasmática em todas as linhagens celulares cultivadas bi ou tridimensionalmente, porém, com exceção da HN31.1, o padrão de marcação foi citoplasmático e nuclear nos clones invasivos. Por fim, a Ciclina D1 exibiu imunopositividade apenas nuclear. A técnica de Western Blot mostrou diminuição nos níveis de expressão das proteínas analisadas quando as células foram cultivadas em Matrigel®, sendo, na maioria das vezes, essa redução estatisticamente significante, exceto no caso da linhagem celular HN6, que apresentou um aumento significativo de Ciclina D1. Os clones invasivos HN6.1 e HN30.1 exibiram elevação significativa dos níveis de expressão de pAkt e NF-B porém, a HN31.1 apresentou aumento de pAkt e discreta diminuição de NF-B, mas ambos os valores não estatisticamente significantes. Em relação à Ciclina D1, houve um aumento dos seus níveis em todas as linhagens invasivas, sendo que apenas na HN6.1 foi estatisticamente significante. Esses resultados mostraram que, nas linhagens celulares avaliadas, quando cultivadas em ambiente tridimensional, a significativa redução dos níveis de expressão de proteínas da via de sinalização PI3K ocorreu devido a uma possível fase adaptativa dessas células ao Matrigel® que seria seguida provavelmente por uma etapa de aumento do potencial proliferativo e posterior transdiferenciação de algumas células para ganho de fenótipo mais agressivo. Além disso, este estudo mostrou a participação da via de sinalização Akt/NF-B/Ciclina D1 no processo de invasão das células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6.1 e HN30.1). / Squamous cell carcinoma represents more than 90% of the head and neck malignant tumors, with high mortality rates. Nevertheless, the knowledge about signaling pathways involved in tumor progression remains unclear. The relationship between pAkt and NF-B is well established in carcinogenesis. It is known that the activation of PI3K can be induced by some factors what leads to Akt phosphorilation (pAkt). This further event starts an activation cascade that induces NF-B translocation from the cytoplasm into the nucleus where the transcription of genes enrolled in cellular proliferation and invasion will be done. Therefore, this study analyzed the status of pAkt, NF-B and Cyclin D1 proteins by Immunofluorescence and Western Blot methods in three head and neck squamous cell carcinoma cell lines (HN6, HN30 and HN31) submitted to three-dimensional culture model and an in vitro invasion assay (invasive clones HN6.1, HN30.1 e HN31.1), both with Matrigel®. pAkt expression was detected in cytoplasm and nucleus in HN6, HN30, HN6.1 and HN30 cultured with Matrigel®, however, HN31, HN30.1, HN31.1 cell lines and HN6/HN31 submitted to three-dimensional culture model showed nuclear expression. NF-B localization was strongly cytoplasmatic in all cell lines cultured with or without Matrigel®, but, regarding HN31.1, NF-B protein expression was nuclear and cytoplasmatic in the invasive clones. Cyclin D1 was nuclear in all cell lines analyzed. Western blot assays showed a decrease in pAkt, NF-B and Cyclin D1 expression levels in all cells lines in three-dimensional culture model, most of them statistically significant, but It was detected a considerable increase in Cyclin D1 expression in HN6 cultured in threedimensional model. Moreover, HN6.1 and HN30.1 showed a significant enhance in pAkt and NF-B levels but, HN31.1 demonstrated a raise in pAkt and a slight decline in NF-B, both were not statistically significant. Finally, an increase in Cyclin D1 expression levels was illustrated in all cell lines but, only HN6.1 showed a statistic signal. These results suggest that, in the cell lines studied, when cultured in threedimensional model, a noteworthy reduction in expression levels of PI3K signaling pathway proteins happened for the reason that a possibly adaptation phase of these cells to Matrigel® was occurring, in the first moment, but it would be probably followed by an increase proliferative potential stage and subsequent transdifferentiation of some cells that could show, consequently, a more aggressive phenotype. At last, this study revealed the participation of Akt/NF-B/Cyclin D1 signaling pathway in invasion process of head and neck squamous cell carcinoma (HN6.1 and HN30.1).

O carcinoma epidermóide oral (CEO) tem alta incidência e mortalidade no mundo, sendo frequentes casos de recidivas em função da resistência aos tratamentos convencionais. Essa resistência tem sido associada à presença de células tronco tumorais (CTT). A terapia fotodinâmica (PDT) tem sido utilizada nos casos de desordens orais potencialmente malignas (DOPM) e CEOs superficiais, com relativo índice de sucesso. Contudo, são relatados casos de recidivas, que sugerem certa resistência à PDT. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se células de DOPM desenvolvem resistência à PDT mediada pelo ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), tal qual ocorre com células de CEO expostas ao mesmo tratamento, bem como verificar se as células displásicas e neoplásicas orais exibem um fenótipo sugestivo de células tronco tumoral. Foram cultivadas células epiteliais displásicas orais (linhagem DOK) e células de CEO de língua (linhagem SCC9), divididas nos seguintes grupos experimentais: Grupo Controle - células sem tratamento; Grupo ALA - células tratadas com 5-ALA, com concentração e tempo de incubação igual ao do grupo PDT; Grupo LED - células tratadas com LED, com dosimetria igual ao do grupo PDT; Grupo PDT - células tratadas com PDT mediada pelo 5-ALA, subdivididas em duas gerações: geração 1 - células expostas a somente um ciclo de PDT; geração 4 - células expostas a quatro ciclos de PDT e que exibiram resistência (maior viabilidade) à dose inicial aplicada para a geração 1. Para esses grupos, foram realizados ensaios de formação de colônias e de invasão, bem como citometria de fluxo para verificar a expressão de CD44, ESA e p75NTR. Observou-se que todos os grupos expostos à PDT contendo células da linhagem DOK exibiram resistência à dose inicial de PDT, porém em intensidade menor àquela observada para a linhagem SCC9. As células resistentes à PDT de ambas as linhagens exibiram maior potencial de formação de colônias, mas somente a primeira geração de células exibiu maior potencial de invasão. Na análise de citometria de fluxo, observou-se que as células resistentes à PDT de ambas as linhagens exibiram superexpressão de CD44high/ESAhigh. A linhagem SCC9 exibiu ainda maior frequência de células CD44high/ESAlow e CD44high/p75NTR+, sugerindo a presença de uma subpopulação com alto potencial de invasão e resistente aos tratamentos convencionais. Não houve diferenças significativas na frequência de células ESAhigh/p75NTR+ em ambas as linhagens. Concluiu-se que as células displásicas orais desenvolvem resistência à PDT com intensidade menor se comparada às células SCC9. Em ambas as linhagens, as células resistentes exibiram um fenótipo sugestivo de células tronco tumorais. Esse fato deve ser considerado ao se instituir a PDT mediada pelo 5-ALA em lesões displásicas e neoplásicas orais que demandam múltiplos ciclos de tratamento. / Oral squamous cell carcinoma (SCC) has a high incidence and mortality in the world. There are frequent cases of relapses due to its resistance to conventional treatments. This resistance has been associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Photodynamic therapy (PDT) has been used in cases of potentially malignant oral lesions (PMOL) and superficial SCC\'s, with a relative success rate. However, relapses are reported, which suggest some resistance to PDT. The aim of the present study was to evaluate whether PMOL cells develop resistance to PDT mediated by the 5- aminolevulinic acid (5-ALA), as occurs with SCC cells exposed to the same treatment, as well as to verify if dysplastic and oral neoplastic cells exhibit a suggestive phenotype of CSC. Oral dysplastic epithelial cells (DOK lineage) and CSC cells of the tongue (SCC9 lineage) were divided into the following experimental groups: Control Group - cells with no treatment; Group ALA - 5-ALA treated cells, with concentration and incubation time equal to that of the PDT group; LED group - LED light treated cells, with dosimetry equal to that of the PDT group; PDT group - cells treated with PDT mediated by the 5-ALA, subdivided into two generations: Generation 1 - cells exposed to only one PDT cycle; Generation 4 - cells exposed to four PDT cycles and exhibiting resistance (greater viability) to the initial dose applied for Generation 1. Colony forming and invasion assays, as well as flow cytometry to verify the expression of CD44, ESA and p75NTR were performed to the experimental groups. It was observed that all groups exposed to PDT containing DOK lineage cells exhibited resistance to the initial dose of PDT, but at a lower intensity than those observed for the SCC9 lineage. PDTresistant cells from both lineages exhibited increased potential for colony formation, but only the first generation of cells exhibited increased invasion potential. In flow cytometric analysis, PDT-resistant cells from both lineages exhibited overexpression of CD44high / ESAhigh. SCC9 lineage also exhibited higher frequency of CD44high / ESAlow and CD44high / p75NTR+ cells, suggesting the presence of a subpopulation with high invasion potential and resistant to conventional treatments. There were no significant differences in the frequency of ESAhigh / p75NTR+ cells in both lineages. It was concluded that the oral dysplastic cells develop resistance to PDT, with lower intensity when compared to SCC9 cells. In both lineages, the resistant cells exhibited a phenotype suggestive of CSC. This fact should be considered when establishing PDT mediated by the 5-ALA in oral dysplastic and neoplastic lesions that require multiple cycles of treatment.

Os genes homeobox são uma família de genes reguladores que são vitais para vários aspectos do crescimento e diferenciação celular. Recentemente, implicações dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF na gênese e progressão tumoral vêm sendo verificadas. Entretanto, o envolvimento desses genes em carcinomas epidermóides (CE) de boca ainda não foi demonstrado. A possível presença de transcritos dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF em carcinomas epidermóides de boca e em tecidos não tumorais adjacentes (TN) foi analisada. Os transcritos dos genes foram amplificados por RT-PCR e sua localização celular determinada por hibridização in situ (ISH) com sondas de mRNA específicas. A amplificação do HOXA7 foi observada em 70% dos casos sendo 15% apenas nas amostras TN, 45% somente nos CEs e 10% em ambos tecidos. Nenhuma amplificação do HOXC6 foi observada. O TGIF foi amplificado em 80% dos casos, sendo 5% somente nas amostras TN, 20% nos CEs e 55% em ambos tecidos. Análises estatísticas mostraram que não havia diferença significante entre a amplificação do transcrito HOXA7 ou TGIF e o tipo de tecido analisado. Além disso, nenhuma associação entre a amplificação dos transcritos nas amostras CE e os aspectos clínicos foi observada. O sinal de hibridização in situ foi similar para os transcritos HOXA7 e TGIF. Nas amostras TN o sinal da ISH foi intenso no epitélio, ora disperso sendo mais proeminente na camada espinhosa ora mais proeminente nas camadas basais e suprabasais. Nos CEs os transcritos foram localizados por toda neoplasia sendo que o sinal era menor em áreas menos diferenciadas. Esses resultados mostram que o HOXC6 não está envolvido com a carcinogênese oral enquanto que a presença dos transcritos HOXA7 e TGIF principalmente em regiões bem diferenciadas dos carcinomas epidermóides de boca sugere uma participação desses genes nesta neoplasia / Homeobox genes comprise a family of developmental regulators that are vital for several aspects of growth and differentiation. Recently HOXA7, HOXC6 and TGIF genes have been implicated with carcinogenesis and tumoral progression. However their involvement with oral squamous cell carcinomas (OSCC) has not been demonstrated yet. The possible presence of HOXA7, HOXC6 and TGIF transcripts in OSCC and adjacent non-tumoral tissues (NT) was verified. Transcripts were amplified by RT -PCR and its cellular localization was determined by in situ hybridization with specific riboprobes. Amplification of HOXA7 was seen in 70% of cases, 15% only in NT tissues, 45% only in OSCC samples and 10% in both tissues. No amplification of HOXC6 was observed. TGIF was amplified in 80% of cases, 5% only in NT tissues, 20% only in OSCC samples and 55% in both tissues. Statistical analysis showed that there was no significant difference between amplification of HOXA7 or TGIF and the type of tissue analyzed. Moreover, no association between amplification of transcripts in OSSC and clinical aspects was observed. ISH signal was similar for HOXA7 and TGIF transcripts. In NT tissues there was an intense expression in the epithelium, either in basal and suprabasal layers or disperse and more intense in the spinous layer. In OSCC transcripts were locali zed in all tumoral cells, but in poorly differentiated areas the signal was less intense. These results show that HOXC6 was not involved in oral carcinogenesis while the presence of HOXA7 and TGIF transcripts in OSSC, mostly in well differentiated regions, suggests a participation of these genes in OSCC

Genes da família homeobox têm sido alvo de intensas pesquisas científicas relacionadas ao câncer. Recentemente, mostramos que o gene homeobox TGIF1 está expresso no carcinoma epidermóide de boca na sua forma genérica. Porém, não foi feita uma discriminação entre quais variantes transcricionais, ou subtipos, do TGIF1 estariam expressas. Neste estudo, propusemo-nos a verificar diferenças na freqüência de expressão das variantes transcricionais do TGIF1 em carcinomas epidermóides de boca (CEB) em relação a tecidos morfologicamente não tumorais (TN), avaliar possíveis associações entre essas variantes nos pacientes portadores de CEB e relacionar o grau de expressão dessas variantes com aspectos clínicos, histológicos e com a sobrevida dos pacientes. Adicionalmente, procuramos analisar a expressão da proteína do TGIF1. Foram analisadas 48 amostras congeladas de CEB e 12 de TN. O RNA total de cada amostra foi extraído utilizando-se solução de TRizol®. Os transcritos do TGIF1 foram amplificados por RT-PCR para cada caso de CEB e TN utilizando-se inicialmente um par de iniciadores genéricos para todas as suas variantes. Após essa triagem, os casos positivos foram amplificados utilizando-se pares de iniciadores específicos para cada variante. Não houve diferença estatística entre a freqüência de expressão das variantes do TGIF1 nos grupos CEB e TN, porém as variantes 4 e 8 foram as que apresentaram p-valores menores. Dentro do grupo de CEB, houve associação significativa entre algumas variantes entre si (sete dos vinte e um cruzamentos), de forma que as variantes 1 e 4 foram as que mais tiverem associação com outras variantes. Dessa forma, optamos por prosseguir o estudo utilizando somente as variantes 1, 4 e 8. Não houve correlação entre a expressão das variantes selecionadas e variáveis clinicas e histológicas propostas. Em relação à sobrevida, a expressão das variantes 1 e 8 mostraram correlação univariada com o desfecho óbito, de maneira que o grupo de indivíduos que mais expressou ambas as variantes foi o que apresentou menor risco de óbito. Através da análise multivariada das variantes 1 e 8 e aspectos clínicos e histológicos, somente o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguínea tiveram significado estatístico. A expressão protéica do TGIF1 foi analisada em 46 amostras parafinadas considerando-se a diferenciação celular, a graduação imunoistoquímica e o compartimento celular. Os resultados obtidos mostraram que as variantes do TGIF1 estão expressas diferentemente no grupo dos pacientes com CEB e sugerese que a expressão das variantes 1 e 8 estejam relacionadas, de maneira semelhante, a um menor risco de óbito para pacientes portadores de CEB. Adicionalmente, sugere-se que o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguinea representem fatores de risco relevantes para o óbito de pacientes portadores de CEB. Sugere-se também que a expressão simultânea da proteína do TGIF1 tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula esteja correlacionada a lesões pobremente diferenciadas. / Genes of the homeobox family have been the subject of intense scientific research related to cancer. Recently, we show that this gene is expressed in oral squamous cell carcinoma in its generic form. However, it was not made a discrimination between which transcript variants, or subtypes\", of TGIF1 were expressed. In this study, we aim to verify differences in the expression of the eight transcript variants described for the homeobox gene TGIF1 in oral squamous cell carcinomas (OSCC) related with morphologically non-tumoral tissues (NT), evaluate possible associations between these variants in patients with OSCC and relate the degree of expression of these variants with clinical, histological and survival aspects of patients. Additionally, we analyzed the expression of TGIF1 protein. It was analyzed 48 frozen samples of OSCC and 12 of NT. The total RNA from each sample was extracted using TRizol solution. TGIF1 transcripts were first amplified by RT-PCR for each case of OSCC and NT using a generic pair of primers. After these screening, the positive cases were amplified using specific pair of primers for each variant. There was no statistical difference between the frequency of expression of TGIF1 transcript variants in OSSC and NT groups, but the variants 4 and 8 had the lowest p-values. Within the OSCC group, there was a significant association between some variants among themselves (seven of the twenty-one associations), in a way that the variants 1 and 4 were the ones that had most association with other variants. Thus, we chose to continue the study using only variants 1, 4 and 8. There was no correlation between the expression of the selected variants with the clinical and histological aspects. Regarding survival, the expression of variants 1 and 8 showed statistical correlation with the outcome death, in a way that the group of patients that most expressed both variants was that one with the lower risk of death. By multivariate analysis of variants 1 and 8 and clinical and histological aspects, only the size of the lesion and vascular invasion blood were statistically significant. The protein expression of TGIF1 was analyzed in 46 paraffin-embedded tissues considering the cell differentiation, the immunohistochemistry graduation and the cell compartment. The results showed that the variants of TGIF1 are differently expressed in the OSCC group of patients and it is suggested that the expression of variants 1 and 8 may be related, in a similar way, to a lower risk of death for patients with OSCC. Additionally, it is suggested that the size of the lesion and the vascular invasion of blood represent relevant risk factors for death in patients with OSCC. It is also suggested that the simultaneous expression of TGIF1 protein not only in the nucleus but also in the cytoplasm of the cell is correlated with the poorly differentiated lesions of OSCC.

Os genes homeobox atuam na morfogênese e na diferenciação celular e vêm sendo relacionados a cânceres em humanos. O projeto “Genoma Câncer de Cabeça e Pescoço" encontrou aproximadamente 20 desses genes possivelmente envolvidos com esse tipo de neoplasia e o PITX1 foi um dos genes encontrados. Sabe-se que o gene PITX1 está relacionado ao desenvolvimento das estruturas anteriores do embrião, porém sua participação em neoplasias não está bem estabelecida até o momento. Nesse estudo nos propusemos a verificar a presença de transcritos do gene PITX1 em carcinomas epidermóides de boca e tecidos não tumorais adjacentes, analisando sua possível relação com a morfologia das células neoplásicas. Para tanto, os transcritos do gene foram amplificados por RT-PCR e sua localização celular determinada por hibridização in situ com sondas de mRNA específicas. Os resultados mostraram que o transcrito sofreu amplificação em 86,2% dos casos, sendo que 28% foram somente nos tumores, 16% somente nos tecidos não tumorais e 56% em ambos os tecidos. A análise estatística através do Z-test (teste de diferença de proporção entre duas populações) mostrou que não houve diferença significativa entre a amplificação e o tipo de tecido analisado. Reações de hibridização in situ mostraram marcação predominante no componente epitelial de maneira heterogênea ora intensa ora branda em populações celulares diversas tanto nos tecidos tumorais quantos nos tecidos não tumorais adjacentes à lesão, sem relação aparente com a morfologia celular. De maneira geral, o sinal foi mais intenso no epitélio do tecido não tumoral quando comparado ao neoplásico. Frente aos resultados obtidos sugere-se que o gene PITX1 pode estar envolvido na carcinogênese de boca, sendo que a sua expressão está reduzida na maioria das células do carcinoma epidermóide de boca. / Homeobox genes have functions on morphogenesis and cell differentiation and have been related with cancer in humans. PITX1 was one of the genes found in the Head and Neck Cancer Genome Project. It is known that PITX1 gene is related with anterior structures of the developing embryo, although its relation with neoplasm is not we ll established. In this study we proposed to verify the presence of PITX1 gene transcripts in oral squamous cell carcinoma and adjacent non-tumoral tissues, analyzing its possible relation with the morphology of neoplastic cells. For such study, gene transcripts were amplified by RT -PCR and its cellular localization determined by in situ hybridization with specific riboprobes. Results showed that the transcript was amplified in 86,2% of the cases; 28% were only in the tumors, 16% non-tumoral tissues and 56% were amplified in both tissues. Statistics analysis by Z-test showed there was no significant difference between amplification and the type of tissue analyzed. In situ hybridization reactions showed transcripts mostly expressed in the epithelium component in a heterogenic manner sometimes intense and others discrete in several cells populations in both tumoral and non-tumoral adjacent tissues, with no apparent relationship to cell morphology. In general, signal was more intense in the non-tumoral epithelium when compared to the neoplasia. These results suggest that PITX1 gene can be involved with oral carcinogenesis and that its expression is reduced in most of the oral squamous cell carcinoma.

Os genes homeobox atuam na morfogênese e na diferenciação celular e vêm sendo relacionados a cânceres em humanos. O projeto “Genoma Câncer de Cabeça e Pescoço” encontrou aproximadamente 20 desses genes possivelmente envolvidos com esse tipo de neoplasia e o PITX1 foi um dos genes encontrados. Sabe-se que o gene PITX1 está relacionado ao desenvolvimento das estruturas anteriores do embrião, porém sua participação em neoplasias não está bem estabelecida até o momento. Nesse estudo nos propusemos a verificar a presença de transcritos do gene PITX1 em carcinomas epidermóides de boca e tecidos não tumorais adjacentes, analisando sua possível relação com a morfologia das células neoplásicas. Para tanto, os transcritos do gene foram amplificados por RT-PCR e sua localização celular determinada por hibridização in situ com sondas de mRNA específicas. Os resultados mostraram que o transcrito sofreu amplificação em 86,2% dos casos, sendo que 28% foram somente nos tumores, 16% somente nos tecidos não tumorais e 56% em ambos os tecidos. A análise estatística através do Z-test (teste de diferença de proporção entre duas populações) mostrou que não houve diferença significativa entre a amplificação e o tipo de tecido analisado. Reações de hibridização in situ mostraram marcação predominante no componente epitelial de maneira heterogênea ora intensa ora branda em populações celulares diversas tanto nos tecidos tumorais quantos nos tecidos não tumorais adjacentes à lesão, sem relação aparente com a morfologia celular. De maneira geral, o sinal foi mais intenso no epitélio do tecido não tumoral quando comparado ao neoplásico. Frente aos resultados obtidos sugere-se que o gene PITX1 pode estar envolvido na carcinogênese de boca, sendo que a sua expressão está reduzida na maioria das células do carcinoma epidermóide de boca. / Homeobox genes have functions on morphogenesis and cell differentiation and have been related with cancer in humans. PITX1 was one of the genes found in the Head and Neck Cancer Genome Project. It is known that PITX1 gene is related with anterior structures of the developing embryo, although its relation with neoplasm is not we ll established. In this study we proposed to verify the presence of PITX1 gene transcripts in oral squamous cell carcinoma and adjacent non-tumoral tissues, analyzing its possible relation with the morphology of neoplastic cells. For such study, gene transcripts were amplified by RT -PCR and its cellular localization determined by in situ hybridization with specific riboprobes. Results showed that the transcript was amplified in 86,2% of the cases; 28% were only in the tumors, 16% non-tumoral tissues and 56% were amplified in both tissues. Statistics analysis by Z-test showed there was no significant difference between amplification and the type of tissue analyzed. In situ hybridization reactions showed transcripts mostly expressed in the epithelium component in a heterogenic manner sometimes intense and others discrete in several cells populations in both tumoral and non-tumoral adjacent tissues, with no apparent relationship to cell morphology. In general, signal was more intense in the non-tumoral epithelium when compared to the neoplasia. These results suggest that PITX1 gene can be involved with oral carcinogenesis and that its expression is reduced in most of the oral squamous cell carcinoma.

Os genes homeobox são uma família de genes reguladores que são vitais para vários aspectos do crescimento e diferenciação celular. Recentemente, implicações dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF na gênese e progressão tumoral vêm sendo verificadas. Entretanto, o envolvimento desses genes em carcinomas epidermóides (CE) de boca ainda não foi demonstrado. A possível presença de transcritos dos genes HOXA7, HOXC6 e TGIF em carcinomas epidermóides de boca e em tecidos não tumorais adjacentes (TN) foi analisada. Os transcritos dos genes foram amplificados por RT-PCR e sua localização celular determinada por hibridização in situ (ISH) com sondas de mRNA específicas. A amplificação do HOXA7 foi observada em 70% dos casos sendo 15% apenas nas amostras TN, 45% somente nos CEs e 10% em ambos tecidos. Nenhuma amplificação do HOXC6 foi observada. O TGIF foi amplificado em 80% dos casos, sendo 5% somente nas amostras TN, 20% nos CEs e 55% em ambos tecidos. Análises estatísticas mostraram que não havia diferença significante entre a amplificação do transcrito HOXA7 ou TGIF e o tipo de tecido analisado. Além disso, nenhuma associação entre a amplificação dos transcritos nas amostras CE e os aspectos clínicos foi observada. O sinal de hibridização in situ foi similar para os transcritos HOXA7 e TGIF. Nas amostras TN o sinal da ISH foi intenso no epitélio, ora disperso sendo mais proeminente na camada espinhosa ora mais proeminente nas camadas basais e suprabasais. Nos CEs os transcritos foram localizados por toda neoplasia sendo que o sinal era menor em áreas menos diferenciadas. Esses resultados mostram que o HOXC6 não está envolvido com a carcinogênese oral enquanto que a presença dos transcritos HOXA7 e TGIF principalmente em regiões bem diferenciadas dos carcinomas epidermóides de boca sugere uma participação desses genes nesta neoplasia / Homeobox genes comprise a family of developmental regulators that are vital for several aspects of growth and differentiation. Recently HOXA7, HOXC6 and TGIF genes have been implicated with carcinogenesis and tumoral progression. However their involvement with oral squamous cell carcinomas (OSCC) has not been demonstrated yet. The possible presence of HOXA7, HOXC6 and TGIF transcripts in OSCC and adjacent non-tumoral tissues (NT) was verified. Transcripts were amplified by RT -PCR and its cellular localization was determined by in situ hybridization with specific riboprobes. Amplification of HOXA7 was seen in 70% of cases, 15% only in NT tissues, 45% only in OSCC samples and 10% in both tissues. No amplification of HOXC6 was observed. TGIF was amplified in 80% of cases, 5% only in NT tissues, 20% only in OSCC samples and 55% in both tissues. Statistical analysis showed that there was no significant difference between amplification of HOXA7 or TGIF and the type of tissue analyzed. Moreover, no association between amplification of transcripts in OSSC and clinical aspects was observed. ISH signal was similar for HOXA7 and TGIF transcripts. In NT tissues there was an intense expression in the epithelium, either in basal and suprabasal layers or disperse and more intense in the spinous layer. In OSCC transcripts were locali zed in all tumoral cells, but in poorly differentiated areas the signal was less intense. These results show that HOXC6 was not involved in oral carcinogenesis while the presence of HOXA7 and TGIF transcripts in OSSC, mostly in well differentiated regions, suggests a participation of these genes in OSCC

Genes da família homeobox têm sido alvo de intensas pesquisas científicas relacionadas ao câncer. Recentemente, mostramos que o gene homeobox TGIF1 está expresso no carcinoma epidermóide de boca na sua forma genérica. Porém, não foi feita uma discriminação entre quais variantes transcricionais, ou subtipos, do TGIF1 estariam expressas. Neste estudo, propusemo-nos a verificar diferenças na freqüência de expressão das variantes transcricionais do TGIF1 em carcinomas epidermóides de boca (CEB) em relação a tecidos morfologicamente não tumorais (TN), avaliar possíveis associações entre essas variantes nos pacientes portadores de CEB e relacionar o grau de expressão dessas variantes com aspectos clínicos, histológicos e com a sobrevida dos pacientes. Adicionalmente, procuramos analisar a expressão da proteína do TGIF1. Foram analisadas 48 amostras congeladas de CEB e 12 de TN. O RNA total de cada amostra foi extraído utilizando-se solução de TRizol®. Os transcritos do TGIF1 foram amplificados por RT-PCR para cada caso de CEB e TN utilizando-se inicialmente um par de iniciadores genéricos para todas as suas variantes. Após essa triagem, os casos positivos foram amplificados utilizando-se pares de iniciadores específicos para cada variante. Não houve diferença estatística entre a freqüência de expressão das variantes do TGIF1 nos grupos CEB e TN, porém as variantes 4 e 8 foram as que apresentaram p-valores menores. Dentro do grupo de CEB, houve associação significativa entre algumas variantes entre si (sete dos vinte e um cruzamentos), de forma que as variantes 1 e 4 foram as que mais tiverem associação com outras variantes. Dessa forma, optamos por prosseguir o estudo utilizando somente as variantes 1, 4 e 8. Não houve correlação entre a expressão das variantes selecionadas e variáveis clinicas e histológicas propostas. Em relação à sobrevida, a expressão das variantes 1 e 8 mostraram correlação univariada com o desfecho óbito, de maneira que o grupo de indivíduos que mais expressou ambas as variantes foi o que apresentou menor risco de óbito. Através da análise multivariada das variantes 1 e 8 e aspectos clínicos e histológicos, somente o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguínea tiveram significado estatístico. A expressão protéica do TGIF1 foi analisada em 46 amostras parafinadas considerando-se a diferenciação celular, a graduação imunoistoquímica e o compartimento celular. Os resultados obtidos mostraram que as variantes do TGIF1 estão expressas diferentemente no grupo dos pacientes com CEB e sugerese que a expressão das variantes 1 e 8 estejam relacionadas, de maneira semelhante, a um menor risco de óbito para pacientes portadores de CEB. Adicionalmente, sugere-se que o tamanho da lesão e a invasão vascular sanguinea representem fatores de risco relevantes para o óbito de pacientes portadores de CEB. Sugere-se também que a expressão simultânea da proteína do TGIF1 tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula esteja correlacionada a lesões pobremente diferenciadas. / Genes of the homeobox family have been the subject of intense scientific research related to cancer. Recently, we show that this gene is expressed in oral squamous cell carcinoma in its generic form. However, it was not made a discrimination between which transcript variants, or subtypes\", of TGIF1 were expressed. In this study, we aim to verify differences in the expression of the eight transcript variants described for the homeobox gene TGIF1 in oral squamous cell carcinomas (OSCC) related with morphologically non-tumoral tissues (NT), evaluate possible associations between these variants in patients with OSCC and relate the degree of expression of these variants with clinical, histological and survival aspects of patients. Additionally, we analyzed the expression of TGIF1 protein. It was analyzed 48 frozen samples of OSCC and 12 of NT. The total RNA from each sample was extracted using TRizol solution. TGIF1 transcripts were first amplified by RT-PCR for each case of OSCC and NT using a generic pair of primers. After these screening, the positive cases were amplified using specific pair of primers for each variant. There was no statistical difference between the frequency of expression of TGIF1 transcript variants in OSSC and NT groups, but the variants 4 and 8 had the lowest p-values. Within the OSCC group, there was a significant association between some variants among themselves (seven of the twenty-one associations), in a way that the variants 1 and 4 were the ones that had most association with other variants. Thus, we chose to continue the study using only variants 1, 4 and 8. There was no correlation between the expression of the selected variants with the clinical and histological aspects. Regarding survival, the expression of variants 1 and 8 showed statistical correlation with the outcome death, in a way that the group of patients that most expressed both variants was that one with the lower risk of death. By multivariate analysis of variants 1 and 8 and clinical and histological aspects, only the size of the lesion and vascular invasion blood were statistically significant. The protein expression of TGIF1 was analyzed in 46 paraffin-embedded tissues considering the cell differentiation, the immunohistochemistry graduation and the cell compartment. The results showed that the variants of TGIF1 are differently expressed in the OSCC group of patients and it is suggested that the expression of variants 1 and 8 may be related, in a similar way, to a lower risk of death for patients with OSCC. Additionally, it is suggested that the size of the lesion and the vascular invasion of blood represent relevant risk factors for death in patients with OSCC. It is also suggested that the simultaneous expression of TGIF1 protein not only in the nucleus but also in the cytoplasm of the cell is correlated with the poorly differentiated lesions of OSCC.

O carcinoma epidermóide representa mais de 90% das neoplasias malignas de cabeça e pescoço, apresentando taxas elevadas de morbi-mortalidade, porém pouco se sabe sobre as vias de sinalização que estão envolvidas na progressão tumoral. Têm sido relatado na literatura, que alguns estímulos podem ativar a holoenzima PI3K que, por sua vez, desencadeia um processo que induz a fosforilação da proteína Akt (pAkt) que leva a ativação e a translocação do NF-B do citoplasma para o núcleo, onde ocorre a transcrição de genes envolvidos na proliferação e invasão celular. Assim, esse estudo analisou, através dos métodos de Imunofluorescência e Western Blot, a expressão das proteínas pAkt, NF-B e Ciclina D1 em três linhagens de células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6, HN30 e HN31) submetidas a cultivo tridimensional e ensaio de invasão (gerando clones invasivos HN6.1, HN30.1 e HN31.1), ambos realizados com Matrigel®. O pAkt apresentou marcação citoplasmática e nuclear nas linhagens celulares HN6, HN30, HN6.1 e na HN30 submetida ao cultivo tridimensional, todavia, as linhagens celulares HN31, HN30.1, HN31.1 e HN6/HN31 cultivadas tridimensionalmente, apresentaram positividade predominantemente nuclear. No caso do NF-B, a localização foi marcadamente citoplasmática em todas as linhagens celulares cultivadas bi ou tridimensionalmente, porém, com exceção da HN31.1, o padrão de marcação foi citoplasmático e nuclear nos clones invasivos. Por fim, a Ciclina D1 exibiu imunopositividade apenas nuclear. A técnica de Western Blot mostrou diminuição nos níveis de expressão das proteínas analisadas quando as células foram cultivadas em Matrigel®, sendo, na maioria das vezes, essa redução estatisticamente significante, exceto no caso da linhagem celular HN6, que apresentou um aumento significativo de Ciclina D1. Os clones invasivos HN6.1 e HN30.1 exibiram elevação significativa dos níveis de expressão de pAkt e NF-B porém, a HN31.1 apresentou aumento de pAkt e discreta diminuição de NF-B, mas ambos os valores não estatisticamente significantes. Em relação à Ciclina D1, houve um aumento dos seus níveis em todas as linhagens invasivas, sendo que apenas na HN6.1 foi estatisticamente significante. Esses resultados mostraram que, nas linhagens celulares avaliadas, quando cultivadas em ambiente tridimensional, a significativa redução dos níveis de expressão de proteínas da via de sinalização PI3K ocorreu devido a uma possível fase adaptativa dessas células ao Matrigel® que seria seguida provavelmente por uma etapa de aumento do potencial proliferativo e posterior transdiferenciação de algumas células para ganho de fenótipo mais agressivo. Além disso, este estudo mostrou a participação da via de sinalização Akt/NF-B/Ciclina D1 no processo de invasão das células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6.1 e HN30.1). / Squamous cell carcinoma represents more than 90% of the head and neck malignant tumors, with high mortality rates. Nevertheless, the knowledge about signaling pathways involved in tumor progression remains unclear. The relationship between pAkt and NF-B is well established in carcinogenesis. It is known that the activation of PI3K can be induced by some factors what leads to Akt phosphorilation (pAkt). This further event starts an activation cascade that induces NF-B translocation from the cytoplasm into the nucleus where the transcription of genes enrolled in cellular proliferation and invasion will be done. Therefore, this study analyzed the status of pAkt, NF-B and Cyclin D1 proteins by Immunofluorescence and Western Blot methods in three head and neck squamous cell carcinoma cell lines (HN6, HN30 and HN31) submitted to three-dimensional culture model and an in vitro invasion assay (invasive clones HN6.1, HN30.1 e HN31.1), both with Matrigel®. pAkt expression was detected in cytoplasm and nucleus in HN6, HN30, HN6.1 and HN30 cultured with Matrigel®, however, HN31, HN30.1, HN31.1 cell lines and HN6/HN31 submitted to three-dimensional culture model showed nuclear expression. NF-B localization was strongly cytoplasmatic in all cell lines cultured with or without Matrigel®, but, regarding HN31.1, NF-B protein expression was nuclear and cytoplasmatic in the invasive clones. Cyclin D1 was nuclear in all cell lines analyzed. Western blot assays showed a decrease in pAkt, NF-B and Cyclin D1 expression levels in all cells lines in three-dimensional culture model, most of them statistically significant, but It was detected a considerable increase in Cyclin D1 expression in HN6 cultured in threedimensional model. Moreover, HN6.1 and HN30.1 showed a significant enhance in pAkt and NF-B levels but, HN31.1 demonstrated a raise in pAkt and a slight decline in NF-B, both were not statistically significant. Finally, an increase in Cyclin D1 expression levels was illustrated in all cell lines but, only HN6.1 showed a statistic signal. These results suggest that, in the cell lines studied, when cultured in threedimensional model, a noteworthy reduction in expression levels of PI3K signaling pathway proteins happened for the reason that a possibly adaptation phase of these cells to Matrigel® was occurring, in the first moment, but it would be probably followed by an increase proliferative potential stage and subsequent transdifferentiation of some cells that could show, consequently, a more aggressive phenotype. At last, this study revealed the participation of Akt/NF-B/Cyclin D1 signaling pathway in invasion process of head and neck squamous cell carcinoma (HN6.1 and HN30.1).