Submitted by ANDRÉ LUIS GIACOMETTI CONCEIÇÃO null (andre4487@gmail.com) on 2016-03-08T12:40:30Z No. of bitstreams: 1 Arquivo_Completo_-_Tese_Doutorado_-_André_Luis_Giacometti_Conceição.pdf: 1296182 bytes, checksum: 29c1b4fbebefc1b96e79210f433f4d2f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-09T16:44:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 conceicao_alg_dr_sjrp.pdf: 1296182 bytes, checksum: 29c1b4fbebefc1b96e79210f433f4d2f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-09T16:44:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 conceicao_alg_dr_sjrp.pdf: 1296182 bytes, checksum: 29c1b4fbebefc1b96e79210f433f4d2f (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O carcinoma renal de células claras (ccRCC) é o mais comum dos subtipos histológicos de carcinoma renal. Este carcinoma é histologicamente caracterizado pela presença de células com citoplasma claro e abundante. O processo inicial de metástase pode ser atribuída à transição epitélio mesênquima (EMT). Neste estudo, buscou-se identificar genes diferencialmente expressos em ccRCC, construindo assim um perfil molecular para este tumor. Nós selecionamos genes descritos na literatura que apresentam relação com EMT, diferenciação e proliferação celular. Analisou-se por PCR quantitativo e imuno-histoquímica a expressão dos genes e suas proteínas, respectivamente, e os possíveis mecanismos epigenético que regulam a sua expressão em amostras de ccRCC e linhagem celular. Os genes OCLN e GAS1 foram encontrados com baixa expressão em ccRCC, e nós sugerimos que o miR-122 e miR- 34a podem regular sua expressão, respectivamente, neste tipo de câncer. Além disso, mostramos, por qPCR e imuno-histoquímica, a alta expressão de SLC2A1 foi significantemente alta em ccRCC. O conjunto de genes identificados neste estudo possibilita a compreensão das bases moleculares e de desenvolvimento do ccRCC. / Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common histological subtype of kidney cancer. This carcinoma is histologically characterized by the presence of clear and abundant cytoplasm. The initial process of ccRCC metastatic tumor formation can be attributed to epithelial- mesenchymal transition (EMT). In this study, we sought to identify genes differentially expressed in ccRCC and build a molecular profile of this cancer. We selected genes described in the literature to be related to EMT, cellular differentiation and proliferation. We analyzed the gene and protein expression by quantitative PCR and immunohistochemistry, respectively, and examined possible epigenetic mechanisms that regulate their expression in ccRCC samples and cell lines. OCLN and GAS1 genes were under-expressed in ccRCC, and we report that miR-122 and miR- 34a, respectively, may regulate their expression in this cancer. Furthermore, we showed by quantitative PCR (qPCR) and immunohistochemistry that SLC2A1 was significantly over-expressed in ccRCC. The set of genes identified in this study furthers our understanding of the molecular basis and development of ccRCC. / FAPESP: 2012/08853-0

O carcinoma renal de células claras é o tumor renal maligno mais frequentemente diagnosticado nos adultos. Uma série de defeitos genéticos tem sido observada no tecido tumoral renal e tais achados podem estar envolvidos na gênese ou progressão desses tumores. Alterações metabólicas e genéticas da mitocôndria são fatores que contribuem para muitas doenças humanas, incluindo o câncer. Objetivo: Estabelecer método para extração mitocondrial sem contaminação pelo DNA nuclear; verificar se existe contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs) no sequenciamento do genoma mitocondrial no carcinoma renal de células claras. Métodos: Para o estudo foram selecionados quatro pacientes portadores de carcinoma renal de células claras. Após a cirurgia obtivemos de cada paciente um fragmento de tumor e um fragmento de parênquima renal sem comprometimento neoplásico, as amostras de cada paciente foram extraídas de forma que ao final pudéssemos obter quatro amostras de DNA, sendo duas com isolamento da mitocôndria e duas sem o isolamento da mitocôndria. As amostras obtidas foram submetidas às seguintes análises genéticas: Sequenciamento completo do mtDNA; Reação em cadeia da polimerase para avaliação da contaminação do mtDNA obtido com isolamento da organela por DNA nuclear; avaliação do número de cópias do mtDNA (depleção) e patogenicidade das mutações. Resultados: Com os resultados obtidos neste estudo podemos afirmar que é possível a realização da extração do DNA mitocondrial sem a contaminação do genoma nuclear; e que o DNA mitocondrial extraído de maneira clássica do DNA total não apresentou contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs). / Clear cell renal carcinoma is the most frequently diagnosed malignant renal tumor in adults. A number of genetic defects have been observed in renal tumor tissue and such findings may be involved in the genesis or progression of these tumors. Metabolic and genetic changes in mitochondria are contributing factors to many human diseases, including cancer. Objective: To establish a method for mitochondrial extraction without nuclear DNA contamination; check for contamination by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs) in the sequencing of the mitochondrial genome in clear cell renal carcinoma. Methods: Four patients with clear cell renal carcinoma were selected for the study. After surgery, we obtained from each patient a tumor fragment and a renal parenchyma fragment without neoplastic involvement, the samples from each patient were extracted so that in the end we could obtain four DNA samples, two with mitochondrial isolation and two without the mitochondria isolation of mitochondria. The obtained samples were submitted to the following genetic analyzes: Complete sequencing of mtDNA; Polymerase chain reaction to evaluate the contamination of mtDNA obtained with organelle isolation by nuclear DNA; evaluation of mtDNA copy number (depletion) and pathogenicity of mutations. Results: With the results obtained in this study we can affirm that it is possible to perform mitochondrial DNA extraction without contamination of the nuclear genome; and that the mitochondrial DNA extracted from the classical DNA of the total DNA was not contaminated by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs).

Carcinoma de Células Renais (CCR) representa uma família de tumores distintos com evolução clínica imprevisível. Uma variedade de moléculas tem sido avaliada como marcadores prognósticos para CCR. Ciclina D1, uma proteína reguladora do ciclo celular, encontra-se superexpressa em vários tumores primários. Nosso objetivo é avaliar sua expressão como marcador prognóstico em CCR. Antes disso, traçamos um perfil clínico e histopatológico da amostra e verificamos sua relação com os fatores prognósticos considerados clássicos pela literatura. 109 espécimes de pacientes diagnosticados com CCR foram obtidos entre 2005 e 2010 no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP e submetidos à análise imunoistoquímica juntamente com 07 amostras de tecido renal normal. A maior parte das características epidemiológicas e clínicas de nossa amostra foi similar àquelas descritas na literatura mundial. Houve predomínio do gênero masculino, da raça branca, com idade próxima a 60 anos, frequência de pacientes assintomáticos em torno de 36% e grande prevalência do CCR de células claras (71,55%). A mortalidade específica da doença foi de 13,76%, sendo o CCR de células claras o tipo mais frequente entre os óbitos e casos metastáticos. Os casos que exibiram má evolução clínica, definida pela ocorrência de metástase e/ou óbito por CCR (22,01%), estiveram associados à presença de sintomas ao diagnóstico, maior tamanho tumoral, grupo de estágio alto (III ou IV), grau nuclear de Fuhrman alto (3 ou 4), presença de necrose e de diferenciação sarcomatóide no tumor, além de outros fatores histológicos desfavoráveis (p < 0,01). Isso indica que as variáveis utilizadas na avaliação de prognóstico em países desenvolvidos podem ser aplicadas aos nossos pacientes. Não houve expressão imunoistoquímica de Ciclina D1 nos casos de tecido renal normal. Observou-se heterogeneidade de marcação nuclear intratumoral no total de casos e menor expressão proteica entre os CCR papilífero e cromófobo. Pacientes com tumores com Ciclina D1baixa (até 30% de células positivas) apresentaram má evolução clínica (p = 0,03), maior tamanho tumoral (p = 0,01), presença de sintomas ao diagnóstico (p = 0,04), grau nuclear alto (p = 0,001), presença de necrose (p = 0,004) e de diferenciação sarcomatóide (p = 0,04) no tumor, além de menor sobrevida sem metástase e/ou óbito por CCR (p = 0,03). Após análise multivariada, a expressão de Ciclina D1 não apresentou valor prognóstico independente para má evolução clínica, embora tenha aumentado levemente a acurácia prognóstica do modelo adotado. Em todas as análises realizadas para o CCR de células claras isoladamente, observamos significância estatística semelhante à do total de casos (CCR). Nosso estudo demonstrou que: a proteína Ciclina D1 encontra-se superexpressa em CCR; os tipos de CCR parecem exibir diferentes padrões de marcação imunoistoquímica da Ciclina D1; alta marcação da proteína (acima de 30% de células positivas) esteve associada à boa evolução clínica e à maioria dos fatores prognósticos favoráveis bem estabelecidos na literatura. Novas investigações são necessárias para descobrir que mecanismos levam a seu acúmulo nas células neoplásicas e quais outros eventos podem estar contribuindo para a progressão da doença. / Renal Cell Carcinoma (RCC) is a family of distinct tumors with unpredictable clinical outcome. A variety of molecules have been evaluated as prognostic markers for RCC. Cyclin D1, a cell cycle regulatory protein, is overexpressed in several primary tumors. Our purpose is to evaluate its expression as a prognostic marker in RCC. Before that, we drew a clinical and histopathological profile of the sample and verified its relationship with prognostic factors regarded as classics in literature. 109 specimens from patients diagnosed with RCC were obtained between 2005 and 2010 at Hospital das Clínicas - Ribeirão Preto School of Medicine USP and submitted to immunohistochemical analysis, along with 07 normal kidney tissue samples. Most epidemiological and clinical characteristics of our sample were similar to those described in the literature. There was a predominance of male, Caucasian, aged about 60 years, the frequency of asymptomatic patients around 36%, and high prevalence of clear cell RCC (71.55%). The disease-specific mortality was 13.76%, being the clear cell RCC the most frequent type among deaths and metastatic cases. Cases that exhibited poor clinical outcome, defined by the occurrence of metastasis and/or death by RCC (22.01%), were related to the presence of symptoms at diagnosis, larger tumor size, high stage group (III or IV), high Fuhrman nuclear grade (3 or 4), presence of necrosis and sarcomatoid differentiation in the tumor and other unfavorable histological factors (p < 0.01). This indicates that the variables used in the assessment of prognosis in developed countries can be applied to our patients. There was no immunohistochemical expression of Cyclin D1 in cases of normal kidney tissue. There was intratumoral heterogeneity in nuclear staining in all cases and lower protein expression among papillary and chromophobe RCC. Patients with Cyclin D1low tumors (up to 30% positive cells) showed poor clinical outcome (p = 0.03), larger tumor size (p = 0.01), presence of symptoms at diagnosis (p = 0.04), high nuclear grade (p = 0.001), presence of necrosis (p = 0.004) and sarcomatoid differentiation (p = 0.04) in the tumor and lower survival without metastasis and/or death by RCC (p = 0.03). After multivariate analysis, the expression of Cyclin D1 showed no independent prognostic value for poor clinical outcome, although it has slightly increased the prognostic accuracy of the model adopted. In all analyzes performed for clear cell RCC alone, we observed statistical significance similar to that of the total cases (RCC). Our study showed that: Cyclin D1 protein is overexpressed in RCC; RCC types seem to exhibit different patterns of immunohistochemical staining for Cyclin D1; high protein expression (over 30% positive cells) was related to good clinical outcome and to most favorable prognostic factors well established in the literature. Further investigations are necessary to reveal which mechanisms lead to its accumulation in neoplastic cells and what other events might be contributing to the progression of the disease.

Carcinoma de Células Renais (CCR) representa uma família de tumores distintos com evolução clínica imprevisível. Uma variedade de moléculas tem sido avaliada como marcadores prognósticos para CCR. Ciclina D1, uma proteína reguladora do ciclo celular, encontra-se superexpressa em vários tumores primários. Nosso objetivo é avaliar sua expressão como marcador prognóstico em CCR. Antes disso, traçamos um perfil clínico e histopatológico da amostra e verificamos sua relação com os fatores prognósticos considerados clássicos pela literatura. 109 espécimes de pacientes diagnosticados com CCR foram obtidos entre 2005 e 2010 no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP e submetidos à análise imunoistoquímica juntamente com 07 amostras de tecido renal normal. A maior parte das características epidemiológicas e clínicas de nossa amostra foi similar àquelas descritas na literatura mundial. Houve predomínio do gênero masculino, da raça branca, com idade próxima a 60 anos, frequência de pacientes assintomáticos em torno de 36% e grande prevalência do CCR de células claras (71,55%). A mortalidade específica da doença foi de 13,76%, sendo o CCR de células claras o tipo mais frequente entre os óbitos e casos metastáticos. Os casos que exibiram má evolução clínica, definida pela ocorrência de metástase e/ou óbito por CCR (22,01%), estiveram associados à presença de sintomas ao diagnóstico, maior tamanho tumoral, grupo de estágio alto (III ou IV), grau nuclear de Fuhrman alto (3 ou 4), presença de necrose e de diferenciação sarcomatóide no tumor, além de outros fatores histológicos desfavoráveis (p < 0,01). Isso indica que as variáveis utilizadas na avaliação de prognóstico em países desenvolvidos podem ser aplicadas aos nossos pacientes. Não houve expressão imunoistoquímica de Ciclina D1 nos casos de tecido renal normal. Observou-se heterogeneidade de marcação nuclear intratumoral no total de casos e menor expressão proteica entre os CCR papilífero e cromófobo. Pacientes com tumores com Ciclina D1baixa (até 30% de células positivas) apresentaram má evolução clínica (p = 0,03), maior tamanho tumoral (p = 0,01), presença de sintomas ao diagnóstico (p = 0,04), grau nuclear alto (p = 0,001), presença de necrose (p = 0,004) e de diferenciação sarcomatóide (p = 0,04) no tumor, além de menor sobrevida sem metástase e/ou óbito por CCR (p = 0,03). Após análise multivariada, a expressão de Ciclina D1 não apresentou valor prognóstico independente para má evolução clínica, embora tenha aumentado levemente a acurácia prognóstica do modelo adotado. Em todas as análises realizadas para o CCR de células claras isoladamente, observamos significância estatística semelhante à do total de casos (CCR). Nosso estudo demonstrou que: a proteína Ciclina D1 encontra-se superexpressa em CCR; os tipos de CCR parecem exibir diferentes padrões de marcação imunoistoquímica da Ciclina D1; alta marcação da proteína (acima de 30% de células positivas) esteve associada à boa evolução clínica e à maioria dos fatores prognósticos favoráveis bem estabelecidos na literatura. Novas investigações são necessárias para descobrir que mecanismos levam a seu acúmulo nas células neoplásicas e quais outros eventos podem estar contribuindo para a progressão da doença. / Renal Cell Carcinoma (RCC) is a family of distinct tumors with unpredictable clinical outcome. A variety of molecules have been evaluated as prognostic markers for RCC. Cyclin D1, a cell cycle regulatory protein, is overexpressed in several primary tumors. Our purpose is to evaluate its expression as a prognostic marker in RCC. Before that, we drew a clinical and histopathological profile of the sample and verified its relationship with prognostic factors regarded as classics in literature. 109 specimens from patients diagnosed with RCC were obtained between 2005 and 2010 at Hospital das Clínicas - Ribeirão Preto School of Medicine USP and submitted to immunohistochemical analysis, along with 07 normal kidney tissue samples. Most epidemiological and clinical characteristics of our sample were similar to those described in the literature. There was a predominance of male, Caucasian, aged about 60 years, the frequency of asymptomatic patients around 36%, and high prevalence of clear cell RCC (71.55%). The disease-specific mortality was 13.76%, being the clear cell RCC the most frequent type among deaths and metastatic cases. Cases that exhibited poor clinical outcome, defined by the occurrence of metastasis and/or death by RCC (22.01%), were related to the presence of symptoms at diagnosis, larger tumor size, high stage group (III or IV), high Fuhrman nuclear grade (3 or 4), presence of necrosis and sarcomatoid differentiation in the tumor and other unfavorable histological factors (p < 0.01). This indicates that the variables used in the assessment of prognosis in developed countries can be applied to our patients. There was no immunohistochemical expression of Cyclin D1 in cases of normal kidney tissue. There was intratumoral heterogeneity in nuclear staining in all cases and lower protein expression among papillary and chromophobe RCC. Patients with Cyclin D1low tumors (up to 30% positive cells) showed poor clinical outcome (p = 0.03), larger tumor size (p = 0.01), presence of symptoms at diagnosis (p = 0.04), high nuclear grade (p = 0.001), presence of necrosis (p = 0.004) and sarcomatoid differentiation (p = 0.04) in the tumor and lower survival without metastasis and/or death by RCC (p = 0.03). After multivariate analysis, the expression of Cyclin D1 showed no independent prognostic value for poor clinical outcome, although it has slightly increased the prognostic accuracy of the model adopted. In all analyzes performed for clear cell RCC alone, we observed statistical significance similar to that of the total cases (RCC). Our study showed that: Cyclin D1 protein is overexpressed in RCC; RCC types seem to exhibit different patterns of immunohistochemical staining for Cyclin D1; high protein expression (over 30% positive cells) was related to good clinical outcome and to most favorable prognostic factors well established in the literature. Further investigations are necessary to reveal which mechanisms lead to its accumulation in neoplastic cells and what other events might be contributing to the progression of the disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T19:53:57Z : No. of bitstreams: 1 pires_lc_me_sjrp.pdf: 2393717 bytes, checksum: a2b9ac8071136c02761c529a8ecaecef (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os dados de seqüência genômicas humanas depositados em bancos públicos têm fornecido uma oportunidade sem precedentes para pesquisadores decifrarem a funcionalidade do genoma humano. Essas informações são extremamente valiosas na prevenção, diagnóstico e tratamento do câncer. O Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), o Gene Expression Omnibus (GEO), o Genome Data Mining (GDM) e o Babelomics funtional analysis of genome-scale experiments representam quatro importantes ferramentas para o estudo da genética funcional. O objetivo do presente trabalho foi o de explorar bancos de dados públicos para selecionar e validar a expressão de genes relacionados com o desenvolvimento e a progressão de carcinoma renal de células claras (CRcc). Utilizando ferramentas de bioinformática foi analisada a expressão gênica diferencial entre duas bibliotecas de SAGE elaboradas a partir de tecidos renais normais e de CRcc. Os resultados obtidos demonstraram alterações na expressão de genes participantes de importantes vias metabólicas. Baseando-se nessas análises, os genes CDK7, CLDN1, CSTB, EPC2 e ZNF706 foram selecionados e a expressão gênica diferencial desses foi avaliada por PCR em tempo real em 35 amostras de pacientes portadores de CRcc em diferentes estágios de progressão da doença e 1 amostra metastática. Paralelamente, utilizando-se a metodologia de RaSH foram elaboradas bibliotecas subtrativas entre o tecido neoplásico e o tecidos normal, sendo selecionados os genes MATR3 e PITPNB. O ZNF706 apresentou super expressão em relação aos tecidos normais, nas amostras tumorais analisadas independentemente do grau de evolução tumoral. O mesmo comportamento foi apresentado pelo gene CSTB, sendo que os maiores níveis de expressão foram observados nas amostras de estágio III de progressão tumoral. O gene CDK7 apresentou níveis de expressão dependente do grau de evolução da... / The data of human genomic sequences available in public database have provided an unpredictable opportunity for researchers to decipher the utility of human genome. This information is extremely valuable in prevention, diagnosis and cancer treatment. The Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), the Gene expression Omnibus (GEO), the Genome Data Mining (GDM) and the Babelomics Functional Analysis of Genome-Scale Experiments do represent four important tools for functional genetics studies. This work aimed to explore public database to select and validate expression of genes related to development and progression of Clear Cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC). The differential gene expression of two SAGE libraries from normal renal tissues and ccRCC was analyzed using bioinformatics tools. The results showed altered gene expression pattern in genes that participate in important metabolic pathways. Based on these analysis, the genes CDK7, CLDN1, CSTB, EPC2 and ZNF706 were selected and their differential gene expression was evaluated by Real Time PCR in 35 tissue samples from patients with ccRCC in different stages of disease progression and one metastatic sample. Simultaneously through RaSH methodology were elaborated subtractive libraries between normal and neoplasic tissues so the genes MATR3 and PITPNB were selected. The ZNF706 presented over expression in tumor tissues independent of tumor progression grade. The same behavior was presented by CSTB where the higher expression levels were observed in samples from stage IV of tumor progression. The CDK7 gene presented expression levels dependent of disease evolution grade where the lowers levels were in stages I, II, III and presented over expression in samples from stage IV and retroperitoneal metastasis. This result shows a clear relationship between CDK7 expression and the aggressiveness of ccRCC and suggests that this gene... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:12:52Z : No. of bitstreams: 1 valsechi_mc_me_sjrp_parcial.pdf: 574533 bytes, checksum: a4733296b652ce8ac3b0aa3af78e4e48 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-16T10:37:46Z: valsechi_mc_me_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-01-16T10:38:34Z : No. of bitstreams: 1 000590383.pdf: 1465270 bytes, checksum: 6abb1c740c0eb28b1d1eb0e5696f75a3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tumor renal é a mais letal das doenças urológicas. É uma doença histologicamente heterogênea, sendo o carcinoma renal de células claras o subtipo histológico mais comum. Embora a nefrectomia e imunoterapia sejam tratamentos bem estabelecidos, aproximadamente 30% dos pacientes tratados são acometidos por metástases. Alterações na expressão gênica e na inativação transcricional, devido ao mecanismo de metilação, são evidentes em células cancerosas. A metilação do DNA é um evento epigenético intimamente relacionado com o silenciamento da expressão gênica, e está envolvida em vários processos, dentre eles, a carcinogênese. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos investigar se os genes selecionados, GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentam expressão alterada nas amostras tumorais, verificar se a expressão gênica está associada com a progressão tumoral, e analisar o padrão de metilação de ilhas CpGs. Os quatro genes selecionados foram validados pela técnica de PCR em Tempo Real. Para validação desses genes foram utilizadas 35 amostras de carcinoma renal de células claras e 35 amostras de córtex renal normal. Os genes GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentaram redução de expressão significativa em amostras de carcinoma renal de células claras quando comparadas ao pool de amostras de córtex renal normal. Observou-se que a redução da expressão do gene ADAM23 está diretamente relacionada com o avanço do estadiamento tumoral. Foi observada uma freqüência elevada de hipermetilação do gene ADAM23, entretanto, não houve associação do padrão de metilação com os dados clínicos. A análise da expressão gênica e dos mecanismos responsáveis pela inativação transcricional dos genes CRABP2, KTN1 e ADAM23, estudados pela primeira vez em carcinoma renal, e GPC3, podem fornecer informações relevantes para o conhecimento e desenvolvimento do carcinoma renal de células claras. / The renal tumor, which is the most lethal of urological diseases, is a histologically heterogeneous disease, and the clear cell renal cell carcinoma the most common histological subtype. Although the treatment of nephrectomy and immunotherapy are established, approximately 30% of patients are affected by metastases. Changes in gene expression and transcriptional inactivation, due to the methylation mechanism are evident in cancer cells. The DNA methylation is an epigenetic event closely related to the silencing of gene expression, and is involved in several cases, including the carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the gene expression of GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23, check if gene expression was associated with tumor progression and analyze methylation pattern of CpG island. The four selected genes were validated by the quantitative RT-PCR. Thirty five samples of clear cell renal cell carcinoma and 35 samples of normal renal cortex were used for validation. The genes GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23 showed significant reduction of expression in samples of clear cell renal cell carcinoma when compared to a pool of samples of normal renal cortex. It was observed that the lower expression of ADAM23 is directly related to the advancement of the tumor staging. Despite the high frequency of hypermethylation of ADAM23, there was no association with the methylation pattern of the clinical data. The analysis of gene expression and the mechanisms responsible for the transcriptional inactivation of genes CRABP2, KTN1 and ADAM23, first studied in clear cell renal cell carcinoma, and GPC3, may provide relevant information for the clear cell renal cell carcinoma understanding and development.

O carcinoma renal de células claras é o tumor renal maligno mais frequentemente diagnosticado nos adultos. Uma série de defeitos genéticos tem sido observada no tecido tumoral renal e tais achados podem estar envolvidos na gênese ou progressão desses tumores. Alterações metabólicas e genéticas da mitocôndria são fatores que contribuem para muitas doenças humanas, incluindo o câncer. Objetivo: Estabelecer método para extração mitocondrial sem contaminação pelo DNA nuclear; verificar se existe contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs) no sequenciamento do genoma mitocondrial no carcinoma renal de células claras. Métodos: Para o estudo foram selecionados quatro pacientes portadores de carcinoma renal de células claras. Após a cirurgia obtivemos de cada paciente um fragmento de tumor e um fragmento de parênquima renal sem comprometimento neoplásico, as amostras de cada paciente foram extraídas de forma que ao final pudéssemos obter quatro amostras de DNA, sendo duas com isolamento da mitocôndria e duas sem o isolamento da mitocôndria. As amostras obtidas foram submetidas às seguintes análises genéticas: Sequenciamento completo do mtDNA; Reação em cadeia da polimerase para avaliação da contaminação do mtDNA obtido com isolamento da organela por DNA nuclear; avaliação do número de cópias do mtDNA (depleção) e patogenicidade das mutações. Resultados: Com os resultados obtidos neste estudo podemos afirmar que é possível a realização da extração do DNA mitocondrial sem a contaminação do genoma nuclear; e que o DNA mitocondrial extraído de maneira clássica do DNA total não apresentou contaminação por inserções nucleares de origem mitocondrial (NUMTs). / Clear cell renal carcinoma is the most frequently diagnosed malignant renal tumor in adults. A number of genetic defects have been observed in renal tumor tissue and such findings may be involved in the genesis or progression of these tumors. Metabolic and genetic changes in mitochondria are contributing factors to many human diseases, including cancer. Objective: To establish a method for mitochondrial extraction without nuclear DNA contamination; check for contamination by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs) in the sequencing of the mitochondrial genome in clear cell renal carcinoma. Methods: Four patients with clear cell renal carcinoma were selected for the study. After surgery, we obtained from each patient a tumor fragment and a renal parenchyma fragment without neoplastic involvement, the samples from each patient were extracted so that in the end we could obtain four DNA samples, two with mitochondrial isolation and two without the mitochondria isolation of mitochondria. The obtained samples were submitted to the following genetic analyzes: Complete sequencing of mtDNA; Polymerase chain reaction to evaluate the contamination of mtDNA obtained with organelle isolation by nuclear DNA; evaluation of mtDNA copy number (depletion) and pathogenicity of mutations. Results: With the results obtained in this study we can affirm that it is possible to perform mitochondrial DNA extraction without contamination of the nuclear genome; and that the mitochondrial DNA extracted from the classical DNA of the total DNA was not contaminated by nuclear inserts of mitochondrial origin (NUMTs).

A Síndrome de von Hippel-Lindau é uma doença hereditária multissistêmica, causada por mutações germinativas no gene VHL que predispõe o portador a manifestações benignas e malignas em diversos órgãos. Entre esses eventos, o carcinoma de células claras renais (CRC) é o de pior prognóstico, com uma penetração média de 25% e sendo a principal causa de morte nestes pacientes. Os CRCs são tumores agressivos, pouco responsivos à quimioterapia e imunoterapia, e muitas vezes são diagnosticados em estágios avançados. Podem estar associados a síndromes hereditárias como o VHL ou apresentar a forma esporádica. Caracteristicamente, o CRC é provocado pela inativação dos dois alelos do gene VHL. Nos casos associados ao VHL, um alelo do gene VHL sofre uma mutação germinativa e um segundo evento mutacional somático nas células do tumor. Por outro lado, na forma esporádica, o CRC é resultado de dois eventos somáticos adquiridos, que incluem uma combinação de metilação do promotor, mutações pontuais que afetam a sequência de leitura aberta (ORF) e rearranjos cromossômicos, principalmente perda de heterozigosidade (LOH). Embora os eventos somáticos nos CRCs esporádicos já tenham sido explorados em outros estudos, os mecanismos de inativação somáticos do gene VHL nos CRCs associados à síndrome ainda não foram bem descritos. Este estudo avaliou os eventos somáticos no gene VHL em CRCs retirados em procedimentos cirúrgicos de pacientes portadores da síndrome. Os eventos somáticos em vários tumores de um mesmo paciente foram comparados a fim de verificarmos se essas mutações são independentes e não clonais. Oito pacientes com amostras CRCs previamente armazenadas no BNT tiveram sua mutação germinativa no gene VHL caracterizada por sequenciamento ou MLPA. Todas as amostras foram submetidas a uma revisão da patologia e macrodissecadas sempre que necessário. Para a análise das manifestações somáticas do gene VHL, o DNA foi extraído de 30 CRCs conservados em RNA latter ou formaldeído (parafina). As amostras foram analisadas quanto à metilação da região promotora do gene pelo método MS-PCR e para mutações pontuais por sequenciamento. Fomos capazes de detectar a mutação somática em 25 dos 30 tumores, incluindo uma mutação pontual e dois tumores diferentes de um mesmo paciente, nenhuma microdeleção e 23 grandes deleções. Em contraste com a literatura, nenhum dos tumores apresentou metilação no promotor do VHL. Devido ao grande número de achados LOH e da resolução limitada da técnica de MLPA para avaliar a extensão dos rearranjos cromossômicos em 3p, não foi possível concluir a análise de clonalidade dos tumores. Um estudo exploratório para caracterizar ganhos e perdas genômicas utilizando a técnica CNV array está em andamento em nosso laboratório. / The von Hippel-Lindau syndrome (VHL) is a multissystemic hereditary disease, caused by germline mutations in the VHL gene that predisposes the carrier to benign and malignant manifestations in different organs. Among these events, the clear cell renal carcinoma (RCC) is the most fearful, with an average penetration of 25% being the leading cause of death in these patients. RCCs are aggressive tumors, poorly responsive to chemo- and immunotherapy that are often diagnosed in advanced stages. They can be associated with hereditary syndromes such as VHL or present in a sporadic form. Characteristically, RCCs carrier the inactivation of the two alleles of VHL gene. In cases associated with VHL, one allele of the VHL gene is mutated in the germline, and the second mutational event occurs in the somatic cells of the tumor. On the other hand, in the sporadic form, RCCs results of two acquired somatic events, which includes a combination of methylation of the promoter, point mutations affecting the ORF, and rearrangements mainly loss of heterozigosity (LOH). Although somatic events in sporadic RCC have been explored before by others, the mechanisms of somatic VHL gene inactivation in VHL-associated RCCs have been poorly characterized. This study evaluated the somatic mutational events in the VHL gene of RCCs removed from VHL patients in therapeutic surgical procedures. The somatic events in multiple tumors from the same patient were compared in order to analyze whether these mutations are independent and not clonal. Eight patients with RCCs samples previously stored at BNT had their germline VHL gene mutation characterized by sequencing or MLPA. All samples were submitted to a pathology review and macrodissected whenever necessary. For the analysis of somatic events of VHL gene, DNA from 30 RCCs were extracted from either RNA later or archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Samples were analyzed for VHL gene promoter methylation by MS-PCR, and for point mutation in the coding DNA by sequencing. We were able to detect the somatic mutation in 25 of the 30 tumors, including one point mutations in two different tumors of the same patient, no micro-deletions, and 23 large deletions. In contrast to the literature, none of the tumors have shown methylation on the VHL promoter. Because of the large number of LOH findings, and the limited resolution of MLPA to evaluate the extension of 3p chromosomal rearrangements, we could not conclude the analysis of tumor clonality. An exploratory study to characterize genomic gains and losses using CNV-array technique are ongoing in our laboratory.

A Síndrome de von Hippel-Lindau é uma doença hereditária multissistêmica, causada por mutações germinativas no gene VHL que predispõe o portador a manifestações benignas e malignas em diversos órgãos. Entre esses eventos, o carcinoma de células claras renais (CRC) é o de pior prognóstico, com uma penetração média de 25% e sendo a principal causa de morte nestes pacientes. Os CRCs são tumores agressivos, pouco responsivos à quimioterapia e imunoterapia, e muitas vezes são diagnosticados em estágios avançados. Podem estar associados a síndromes hereditárias como o VHL ou apresentar a forma esporádica. Caracteristicamente, o CRC é provocado pela inativação dos dois alelos do gene VHL. Nos casos associados ao VHL, um alelo do gene VHL sofre uma mutação germinativa e um segundo evento mutacional somático nas células do tumor. Por outro lado, na forma esporádica, o CRC é resultado de dois eventos somáticos adquiridos, que incluem uma combinação de metilação do promotor, mutações pontuais que afetam a sequência de leitura aberta (ORF) e rearranjos cromossômicos, principalmente perda de heterozigosidade (LOH). Embora os eventos somáticos nos CRCs esporádicos já tenham sido explorados em outros estudos, os mecanismos de inativação somáticos do gene VHL nos CRCs associados à síndrome ainda não foram bem descritos. Este estudo avaliou os eventos somáticos no gene VHL em CRCs retirados em procedimentos cirúrgicos de pacientes portadores da síndrome. Os eventos somáticos em vários tumores de um mesmo paciente foram comparados a fim de verificarmos se essas mutações são independentes e não clonais. Oito pacientes com amostras CRCs previamente armazenadas no BNT tiveram sua mutação germinativa no gene VHL caracterizada por sequenciamento ou MLPA. Todas as amostras foram submetidas a uma revisão da patologia e macrodissecadas sempre que necessário. Para a análise das manifestações somáticas do gene VHL, o DNA foi extraído de 30 CRCs conservados em RNA latter ou formaldeído (parafina). As amostras foram analisadas quanto à metilação da região promotora do gene pelo método MS-PCR e para mutações pontuais por sequenciamento. Fomos capazes de detectar a mutação somática em 25 dos 30 tumores, incluindo uma mutação pontual e dois tumores diferentes de um mesmo paciente, nenhuma microdeleção e 23 grandes deleções. Em contraste com a literatura, nenhum dos tumores apresentou metilação no promotor do VHL. Devido ao grande número de achados LOH e da resolução limitada da técnica de MLPA para avaliar a extensão dos rearranjos cromossômicos em 3p, não foi possível concluir a análise de clonalidade dos tumores. Um estudo exploratório para caracterizar ganhos e perdas genômicas utilizando a técnica CNV array está em andamento em nosso laboratório. / The von Hippel-Lindau syndrome (VHL) is a multissystemic hereditary disease, caused by germline mutations in the VHL gene that predisposes the carrier to benign and malignant manifestations in different organs. Among these events, the clear cell renal carcinoma (RCC) is the most fearful, with an average penetration of 25% being the leading cause of death in these patients. RCCs are aggressive tumors, poorly responsive to chemo- and immunotherapy that are often diagnosed in advanced stages. They can be associated with hereditary syndromes such as VHL or present in a sporadic form. Characteristically, RCCs carrier the inactivation of the two alleles of VHL gene. In cases associated with VHL, one allele of the VHL gene is mutated in the germline, and the second mutational event occurs in the somatic cells of the tumor. On the other hand, in the sporadic form, RCCs results of two acquired somatic events, which includes a combination of methylation of the promoter, point mutations affecting the ORF, and rearrangements mainly loss of heterozigosity (LOH). Although somatic events in sporadic RCC have been explored before by others, the mechanisms of somatic VHL gene inactivation in VHL-associated RCCs have been poorly characterized. This study evaluated the somatic mutational events in the VHL gene of RCCs removed from VHL patients in therapeutic surgical procedures. The somatic events in multiple tumors from the same patient were compared in order to analyze whether these mutations are independent and not clonal. Eight patients with RCCs samples previously stored at BNT had their germline VHL gene mutation characterized by sequencing or MLPA. All samples were submitted to a pathology review and macrodissected whenever necessary. For the analysis of somatic events of VHL gene, DNA from 30 RCCs were extracted from either RNA later or archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Samples were analyzed for VHL gene promoter methylation by MS-PCR, and for point mutation in the coding DNA by sequencing. We were able to detect the somatic mutation in 25 of the 30 tumors, including one point mutations in two different tumors of the same patient, no micro-deletions, and 23 large deletions. In contrast to the literature, none of the tumors have shown methylation on the VHL promoter. Because of the large number of LOH findings, and the limited resolution of MLPA to evaluate the extension of 3p chromosomal rearrangements, we could not conclude the analysis of tumor clonality. An exploratory study to characterize genomic gains and losses using CNV-array technique are ongoing in our laboratory.