Made available in DSpace on 2016-12-08T15:59:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese doutorado Anderson COMPLETA VERSAO 3.pdf: 4759464 bytes, checksum: a5e0058789d16b29bc737da2e0e29d6a (MD5) Previous issue date: 2013-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fundamentação: Evidências experimentais e clinicas apontam um estado gradativo de ativação imune-inflamatória em pacientes com insuficiência cardíaca (IC). Níveis elevados de diversas citocinas são encontrados na circulação e no músculo cardíaco de indivíduos com IC, correlacionando-se, invariavelmente, com o grau de gravidade da doença e agindo na disfunção endotelial, na indução de anemia, na apoptose miocitária e na perda gradativa de massa muscular esquelética. Existem controvérsias sobre a intensidade do exercício físico que mais favorece o tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca (IC). Tem sido sugerido que o exercício intervalado de alta intensidade poderia proporcionar melhores resultados em termos de qualidade de vida (QoL) e parâmetros fisiológicos. Neste contexto, pouco tem sido estudado sobre os inflamatórios. Objetivo: Verificar o efeito terapêutico do exercício físico agudo e crônico de diferentes intensidades no perfil inflamatório em pacientes com IC. Método: Ensaio clínico controlado randomizado, desenvolvido durante 12 semanas, com vinte dois pacientes homens diagnosticados com IC compensados, fração de ejeção menor que 45%, média de idade de 53,8±8 anos, classe II e III da NYHA, aleatoriamente distribuídos em dois grupos: grupo submetido a exercício de moderada intensidade (GMI), exercitando-se com frequência cardíaca (FC) correspondente ao limiar aeróbio e grupo de exercício intervalado de alta intensidade (GAI), exercitando-se com FC correspondente ao limiar anaeróbio. Ambos os grupos realizaram exercício aeróbio em esteira rolante, três vezes por semana, durante 60 minutos de sessão de exercício. Foram feitas avaliações em quatro momentos: antes e após a primeira sessão de exercício e antes e após a última sessão (36°). Os marcadores inflamatórios circulantes foram determinados pela concentração plasmática de interleucinas (IL-1, IL-6, IL-10), fator de necrose tumoral alfa (TNF-&#945;), proteína solúvel sCD40, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e proteína quimiotática de monócitos -1 (MCP-1), dosados por ELISA. A proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70) de células mononucleares foi dosada por Western Bloting e Kit por Elisa. Estas proteínas foram dosadas em nível plasmático (repouso) e em situação de exercício físico e choque térmico, intra, extracelular e a razão de ambas as situações. Antes e após o programa de exercício foram realizadas avaliações da: da função cardíaca e endotelial pelo ecodoppel (ECO); desempenho cardiorrespiratório por meio da ergoespirometria (VO2pico) e teste de caminhada de seis minutos (6MWT); qualidade de vida (QoL) por Questionário de Minesotta e SF-36. Resultados: Nas vias de sinalização inflamatórias, comparando o basal com à ultima sessão, verificou-se diminuição da IL-6 (p<0,001) para ambos os grupos, com maior queda para o GAI, assim como para o TNF-&#945; comparando o mesmo momento. Na sessão de exercício, a mudança aguda aconteceu na última sessão para o TNF-&#945;, VEGF e IL-10 em ambos os grupos. A expressão HSP70 aumentou em ambos os grupos, antes e após a realização do exercício (p <0,01). O GMI apresentou maior conteúdo intracelular de HSP70 com o exercício quando comparado com GAI, sendo que no nível de exportação extracelular, ambos os grupos apresentaram a mesma resposta. O treinamento proporcionou aprimoramento das respostas anti-inflamatórias verificadas pelaa razão intra e extra celular de HSP70. Houve melhora significativa da função diastólica do ventrículo esquerdo, avaliada pelo E/E´, apenas para o GAI. O VO2pico aumentou significativamente em 8,3% e 11,2% para o GMI e GAI, respectivamente. Independente da intensidade de exercício, verificou-se melhora superior a 15% em todos os domínios da QoL. Conclusão: Em ambos os grupos foi verificado aprimoramento da resposta anti-inflamatória e citoprotetora ao exercício, aguda e cronicamente. Foram observados ganhos significativos na função diastólica de VE e endotelial, desempenho cardiorrespiratório e na QoL, sem diferenças estatística entre os grupos.

Resumo: Em modelos experimentais de agressão cardíaca, a dificuldade de se estabelecer uma classificação in vivo do grau de disfunção ventricular tem restringido a realização de estudos longitudinais. O objetivo deste estudo foi identificar variáveis ecocardiográficas que definam graus de insuficiência cardíaca em ratos com estenose aórtica (EAo). Foram usados ratos Wistar (n=23), machos (90-100 g) submetidos à cirurgia para indução de EAo. O grupo controle consistiu de 12 animais. Após a constatação de taquipnéia, foi realizado o exame ecocardiográfico. A análise de agrupamento possibilitou separar os ratos com EAo em dois grupos distintos quanto à gravidade do acometimento cardíaco, que foram denominados de disfunção leve (n=13) e disfunção grave (n=9). Um animal não se agrupou em nenhum das classificações. Como resultado da função discriminante de Fisher, foi encontrado três grupos distintos quanto a função cardíaca: normal, leve e grave. Concluímos que a análise de agrupamento e a função discriminante de Fisher, desenvolvidas a partir de variáveis ecocardiográficas são úteis na classificação funcional de ratos portadores de estenose aórtica. / Abstract: The difficulty to detect different degrees of heart dysfunction in laboratory animals, in vivo, has restricted longitudinal studies. The purpose of this study was to identify echocardiographic parameters that allow distinguishing different degrees of cardiac dysfunction in aortic banded rats. Wistar male rats (90-100 g) were subjected to aortic banding (n=23) or a sham operation (n=12). Echocardiogram was performed after animals presented tachypnea. The following echocardiographic parameters were evaluated to cluster rats into groups with similar characteristics using cluster analysis: absolute or relative to body weight values of left ventricular end-diastolic diameter (LVDD) and left atrial systolic diameter; left ventricular endsystolic diameter (LVSD); LV weight to body weight ratio (LVW/BW); three indexes of left ventricular shortening (endocardial fractional shortening, EFS; midwall FS, MFS; and posterior wall shortening velocity, PWSV); and ratio of early to late diastolic mitral inflow velocities (E/A). Fisher's discriminatory graphic technique was used to elaborate the criteria to classify new animals into different degrees of cardiac function. Cluster analysis allowed the clustering of aortic banded rats into two groups according to the degree of heart failure severity which were named as mild (n=13) and severe (n=9) stage of heart failure. In conclusion, cluster analysis and Fisher's technique using echocardiographic data allowed the classification of degrees of heart function in aorctic banded rats, in vivo. / Orientador: Ana Valéria Barros de Castro / Coorientador: Antonio Carlos Cicogna / Banca: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Maria Tereza Nunes / Mestre

O infarto do miocárdio é atualmente considerado a etiologia que mais contribui para o aparecimento de insuficiência cardíaca (IC) em humanos. Em detrimento a hiperativação de fatores neuro-humorais, a progressão da IC é caracterizada por uma série de anormalidades celulares associadas à disfunção ventricular. Dentre estas anormalidades, alterações na função e dinâmica mitocondrial merecem destaque, uma vez que a homeostase da organela é essencial para a viabilidade celular e o bom funcionamento da bomba cardíaca. No presente estudo, caracterizamos em modelo animal de disfunção cardíaca associada ao infarto do miocárdio: a) fenótipo cardíaco; b) função mitocondrial; c) equilíbrio redox; e d) dinâmica mitocondrial. Nossos resultados nos permitem afirmar que doze semanas após a cirurgia de infarto do miocárdio, os animais desenvolveram importantes alterações fenotípicas como aumento da massa cardíaca, dilatação ventricular, hipertrofia do cardiomiócito e maior deposição de tecido fibroso cardíaco, que contribuíram para o estabelecimento da disfunção ventricular. Além disso, foi possível confirmar a instalação do quadro de disfunção mitocondrial cardíaca, representada pela redução na capacidade respiratória e perda da homeostase redox. Por fim, encontramos um aumento no número de mitocôndrias cardíacas com menor diâmetro, alterações que vieram acompanhadas de uma menor atividade das enzimas relacionadas à fusão mitocondrial. Uma vez caracterizada a função e a dinâmica mitocondrial na disfunção cardíaca, avaliamos o efeito do treinamento físico aeróbico (TF) nessas variáveis. O TF, atualmente utilizado como um adjuvante no tratamento das doenças cardiovasculares, foi eficaz em promover o remodelamento cardíaco reverso e melhorar a função cardíaca nos animais infartados. Além disso, melhorou a capacidade respiratória e reduziu o estresse oxidativo, restaurando a função mitocondrial. Aliado a esses achados, o TF normalizou a atividade das enzimas relacionadas à dinâmica mitocondrial, fato associado à normalização do número e tamanho da organela. Esses resultados demonstram que a disfunção cardíaca induzida por infarto do miocárdio está associada à um quadro de mitocondriopatia em ratos, com alterações tanto na função quanto estrutura mitocondrial, e que o TF desencadeia efeitos benéficos na manutenção da integridade/função mitocondrial e melhora da função contrátil cardíaca / Myocardial infarction is considered the etiology that most contributes to the onset of heart failure in humans. Among the ventricular dysfunction-associated cellular abnormalities, changes in mitochondrial function and dynamics are critical, since the organelle homeostasis is crucial in maintaining the metabolic, electrical and mechanical properties of the heart. In the present study, we characterized in cardiac dysfunction- induced myocardial infarction in rats: a) cardiac phenotype; b) mitochondrial metabolism; c) redox balance, and d) mitochondrial dynamics. Our results show that twelve weeks after myocardial surgery, the animals developed pathological cardiac remodeling-associated ventricular dysfunction. Furthermore, we observed a reduced mitochondrial respiratory capacity and loss of redox homeostasis. Finally, we found a lower activity of enzymes related to mitochondrial fusion, these changes were accompanied by an increase in the number of small mitochondria. Once characterized mitochondrial function and dynamics, we evaluated the effect of exercise training in these variables in rats with cardiac dysfunction. The exercise training, currently established as an important non-pharmacological treatment for cardiovascular diseases, reversed the pathological cardiac remodeling and minimized the ventricular dysfunction in infarcted animals. Furthermore, exercise training restored the mitochondrial function by increasing respiratory capacity and reducing oxidative stress. Finally, exercise training restored the activity of mitochondrial dynamics-related enzymes and morphology. Taken together, our findings uncover the potential benefits of exercise training in reversing the cardiac mitochondriopathy observed in failing hearts, reinforcing the importance of this intervention as a non-pharmacological tool for heart failure therapy

Aims Cardiac dysfunction is a critical manifestation of severe sepsis/septic shock and is responsible for high mortality due to sepsis. Recent evidence suggests that angiogenic factors have a protective effect on sepsis-induced organ damage. Heat shock protein A12B (HSPA12B) is a newly discovered gene that is essential for angiogenesis. We hypothesized that overexpression of HSPA12B would induce protection against endotoxin-induced cardiac dysfunction.Methods and results To evaluate this hypothesis, we generated transgenic mice overexpressing the human hspa12b gene (Tg). Wild-type (WT) littermates served as controls. Tg and WT mice were treated with lipopolysaccharide (LPS) and cardiac function was measured after 6 h. LPS treatment caused cardiac dysfunction in WT mice. In contrast, cardiac function was significantly preserved in Tg mice following LPS administration. LPS increased the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)/intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and leucocyte infiltration into the myocardium of WT mice. In Tg mice, LPS-increased VCAM-1/ICAM-1 expression and leucocyte infiltration were significantly attenuated. Overexpression of HSPA12B also prevented the decrement in the activation of phosphatidlyinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signalling in the myocardium. Importantly, PI3K inhibition with Wortmannin abolished the protection of HSPA12B against LPS-induced cardiac dysfunction. Conclusion These results suggest that HSPA12B plays an important role in the attenuation of endotoxin-induced cardiac dysfunction and that the mechanisms involve the preserved activation of PI3K/Akt signalling, resulting in attenuation of LPS-increased expression of VCAM-1/ICAM-1 and leucocyte infiltration into the myocardium.

<p>  </p> <p>Heart disease is the leading cause of death for individuals with Duchenne muscular dystrophy (DMD). DMD is a devastating and progressive neuromuscular disease with no known cure. This X-linked genetic disorder affects nearly 1 in 5000 boys and manifests as debilitating muscle weakness and progressive cardiomyopathy (CM). While CM in some individuals with DMD progresses rapidly and fatally in their teenage years, others can live relatively symptom-free into their thirties or forties. Early identification and treatment can improve quality and length of life, but currently, there are no standard imaging biomarkers that can detect early onset or rapidly progressing DMD CM. Addressing this gap, we describe here a novel cardiac image analysis paradigm using 4D cardiac magnetic resonance imaging (CMR) to map left-ventricular kinematics comprehensively in DMD CM. The primary goal of this dissertation work is to introduce novel imaging biomarkers and computational methods to enable earlier diagnosis and precise prognosis for cardiac function in DMD. Central to this goal, we identified myocardial strain biomarkers that predict the early onset and rapid progression of cardiac disease in vulnerable patients. These findings bridge clinical gaps and pave the way for multi-center studies to characterize DMD CM progression and assessment of individual patient risk profiles for improved treatment and outcomes in DMD.</p>

Thesis (MScMedSc)--University of Stellenbosch, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: INTRODUCTION: Obesity and its associated complications such as diabetes and cardiovascular disease are escalating worldwide. Cardiovascular mortality and the occurrence of heart failure following a myocardial infarction are increased among diabetics. A high caloric diet has been associated with specific metabolic alterations such as increased FA utilization and decreased glucose utilization. We therefore hypothesized that, in a rat model of diet-induced obesity, pathways involved in myocardial glucose utilization would be down regulated with simultaneous up regulation of FA utilization pathways and that this will lead to certain metabolic adaptations which will eventually become maladaptive. We aimed to elucidate mitochondrial oxidative capacity, biogenesis, and signaling pathways involved in substrate utilization and energy production in rats on the obesity inducing diet for a period of 8 or 16 weeks. METHODS: The diet of male Wistar rats (180-200 g) was supplemented with sucrose and condensed milk for 8 or 16 weeks (DIO) and compared to age-matched controls. We determined the fasting blood glucose and serum insulin levels, which was used to calculate the HOMA index. Furthermore, (i) A set of hearts were removed and freeze-clamped immediately. (ii) Isolated hearts were perfused with Krebs-Henseleit buffer (10 mM glucose), subjected to regional ischaemia by ligating the left anterior descending artery (35 min). After 10 min reperfusion, the infarcted and non-infarcted zones were freeze-clamped separately. Isolated mitochondria prepared from fresh tissue were used to measure oxidative capacity using either glutamate or palmitoyl-L-carnitine as substrates and exposed to anoxia (20 min) /reperfusion and used in e- transport chain complex analysis. Additionally we determined (i) ATP production (HPLC), (ii) citrate synthase activity and quantity as measure of active mitochondria per mg of protein and (iii) PDH complex expression and activity (ELISA). Levels of GLUT1, GLUT 4, PGC-1α, PPARα, PKB/Akt, GSK-3, PTEN, AMPK and PI3K activity were measured via Western blotting and Real-time PCR was used to measure the expression of PDK 4 and FAT/CD36. RESULTS: The blood glucose and serum insulin levels were significantly elevated in the diet group after 8 weeks of DIO. The PPARα, PGC-1α and PDK 4 levels were also significantly elevated in the diet group with no significant difference in the levels of any of the other proteins measured or the level of citrate synthase activity. After 16 weeks of DIO the citrate synthase, PTEN and p-PI3K activity was significantly reduced and the %recovery after anoxia/reperfusion when using palmitoyl was significantly increased in the diet group. There was no change in mitochondrial oxidative function in both groups after 8 and 16 weeks, as well as no difference in ATP production during state 3 respiration. CONCLUSION: The increased blood glucose and serum insulin levels as well as the increase in the HOMA index in the diet group after 8 weeks of DIO indicates that these obese animals were insulin resistant. An increase in the level of PPARα and PGC-1α expression indicates an early compensatory effect which facilitates enhanced fatty acid utilization. This is underscored by elevated levels of PDK 4. We could find no significant difference in the quantity of the PDH enzyme but there was a significant increase in the level of PDH activity in the diet group after 16 weeks of DIO. Mitochondria from the 16 weeks DIO animals were able to withstand anoxia/reperfusion and showed no malfunctioning of the electron transport chain, despite a reduction in PI3K & PTEN activity and the presence of insulin resistance. Mitochondrial biogenesis does not seem to play a significant role in the heart‟s adaptive response as there was no increase in the citrate synthase activity in both groups. We conclude that the hearts from these obese and insulin resistant rats are coping well and have adapted metabolically to compensate for any reduction in glucose oxidation. It is plausible that this initial metabolic adaptation may become maladaptive as obesity progresses. / AFRIKAANSE OPSOMMING: INLEIDING: Vetsug en die geassosieerde komplikasies, naamlik diabetes en kardiovaskulêre siektes is besig om wêreldwyd toe te neem. Kardiovaskulêre sterftes en die voorkoms van hartversaking ná 'n miokardiale infarksie is verhoog onder diabete. 'n Dieet met 'n hoë vetinname word ook geassosieer met spesifieke metabolise veranderings, soos verhoogde vetsuur gebruik en 'n afname in glukoseverbruik. Ons het dus vermoed dat seintransduksie paaie betrokke by miokardiale glukose verbruik afgereguleer sal wees met tesame opreguleering van seintransduksie paaie betrokke by vetsuur verbruik, en dat dit sal lei tot sekere metaboliese aanpassings wat uiteindelik wanaanpaslik sal word. Ons DOESTELLING in hierdie studie was dus om meer lig te werp op mitokondriale oksidatiewe kapasiteit, biogenese, en seintransduksie betrokke by substraatverbruik en energieproduksie in rotte op die vetsugveroorsakende-dieet (vir 'n tydperk van 8 tot 16 weke). METODE: Die dieet van die manlike Wistar rotte (180-200 g) is aangevul met sucrose en gekondenseerde melk vir 8 of 16 weke (DIO) en is dan vergelyk met kontrole rotte van dieselfde ouderdom. Die vastende bloedglukose-en insulienvlakke is bepaal en hierdie waardes is gebruik om die HOMA indeks te bereken. Verder is, (i) 'n stel harte verwyder en onmiddelik gevriesklamp (ii) geïsoleerde harte met Krebs-Henseleit buffer (10 mM glukose) geperfuseer en dan aan 35 min streeksiskemie en 10 min herperfusie blottgestel. Na 10 min herperfusie, is die infarct en nie-infarktsones apart gevriesklamp. Geïsoleerde mitokonderieë is voorberei van vars weefsel en is gebruik a) om oksidatiewe kapasiteit te meet met behulp van glutamaat of palmitoiel-L-karnitien as substrate of b) blootgestel aan 20 min anoksie gevolg deur heroksigenasie of c) is gebruik in elektronvervoerkettingkompleks analise. Verder is die volgende ook bepaal: (i) ATP-produksie (HPLC), (ii) sitraat sintase aktiwiteit en hoeveelheid, gemeet as maatstaf van die aktiewe mitkondrieë per mg van proteïen en (iii) PDH-komplekuitdrukking en aktiwiteit (ELISA). Vlakke van GLUT 1, GLUT 4, PGC-1 alpha, PPAR alpha, PKB/Akt, GSK-3, PTEN, AMPK, en PI 3 kinase is bepaal deur Western klad analise en “Real –time PCR” is gebruik om die uitdrukking van PDK 4 en FAT/CD 36 te bepaal. RESULTATE: Die bloedglukose- en serum insulinvlakke was beduidend verhoog in die dieetgroep na 8 weke van DIO. Die PPAR alpha, PGC-1 alpha en PDK 4 vlakke was ook beduidend verhoog in die dieetgroep met geen beduidende verskil in die vlakke van enige van die ander proteïene gemeet of die vlakke van sitraat-sintase aktiwiteit nie. Na 16 weke van DIO het die vlakke van sitraat-sintase, PTEN en p-PI 3 kinase beduidend verlaag en die % herstel na anoksie/heroksigenering (met die gebruik van palmitoiel-L-karnitien) het beduidend toegeneem in die dieetgroep. Geen ander mitokondriale veranderinge kon waargeneem word nie. Ons kon geen verandering vind in die mitokondriale oksidatiewe funksie tussen die twee groepe na 8 en 16 weke van DIO. Daar was ook geen verandering in die hoeveelheid ATP geproduseer gedurende staat 3 respirasie. GEVOLGTREKKING: Die verhoogde bloedglukose en serum insulienvlakke, sowel as die toename in die HOMA indeks in die dieetgroep na 8 weke van DIO, dui daarop dat hierdie oorgewig diere insulienweerstandig is. 'n Toename in die vlak van PPAR alpha en PGC-1 alpha uitdrukking dui op 'n vroeë kompenserende effek, wat die verhoogde verbruik van vetsure fasiliteer. Dit is beklemtoon deur verhoogde vlakke van PDK 4. Ons kon geen beduidende verskil in die hoeveelheid PDH-ensiem vind nie, maar daar was wel 'n beduidende toename in die vlak van PDH aktiwiteit in die dieetgroep na 16 weke van DIO. Mitokondrieë van die 16 weke DIO diere kon anoksie/heroksigenering weestaan en het geen wanfunksionering van die elektronvervoerketting getoon nie, ten spyte van 'n vermindering in PI 3 kinase en PTEN aktiwiteit en die teenwoordigheid van insulienweerstandigheid. Mitokondriale biogenese blyk nie 'n beduidende rol te speel in die hart se aanpassingreaksie nie, want daar was geen verhoging in die sitraat-sintase aktiwiteit in beide groepe nie. Na aanluiding van die resultate verkry met hierdie studie, maak ons ook die gevolgtrekking dat die harte van rotte na 16 weke se blootstelling aan 'n hoë vet omgewing, metabolies kon aanpas en goed funksioneer. Ons gevolgtrekking is dus dat die harte van diere wat lei aan vetsug en wat insulien weerstandig is die verlaaging in glukose metabolisme goed hanteer en metabolies aangepas het hierby. Dit is moontlik dat hierdie aanvanklike aanpasing wanaanpaslik kan word soos vetsug vorder.

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, sendo a cardiomiopatia isquêmica a mais prevalente. Independente da sua etiologia, a via final comum da maioria das doenças cardiovasculares é a insuficiência cardíaca. Nos últimos anos, tem sido reportado que o acúmulo de proteínas mal enoveladas no retículo endoplasmático (estresse do RE) pode contribuir para redução da função cardíaca e instalação da insuficiência cardíaca. Apesar do mecanismo responsável pela disfunção contrátil induzida pelo estresse do RE ainda não ser conhecido, evidências sugerem que a inibição da via de sinalização PI3K/AKT pela proteína JNK pode estar envolvida nessa resposta. Na primeira parte desta tese, verificamos que a indução do estresse do RE em cardiomiócitos isolados ativou a JNK, mas não inibiu a via de sinalização PI3K/AKT. A inativação de JNK reverteu a disfunção contrátil e a redução da amplitude do transiente de Ca+2 de cardiomiócitos causados pelo estresse do RE. Pelo fato da via sinalização PI3K/AKT não estar envolvida na disfunção contrátil causada pelo estresse do RE, analisamos outro alvo de JNK, a proteína BNIP3, proteína pró-apoptótica e envolvida no controle de qualidade mitocondrial promovendo mitofagia quando ativada. O estresse do RE aumentou a expressão de BNIP3, a qual foi atenuada pela inibição de JNK. A depleção de BNIP3 impediu a disfunção contrátil dos cardiomiócitos e a redução da amplitude do transiente de Ca+2 induzidos pelo estresse do RE. Na segunda parte da tese, o objetivo foi avaliar se os efeitos observados em cardiomiócitos submetidos a estresse do RE poderiam ser observados em modelo experimental de doença cardiovascular. Nesse sentido, observamos que a disfunção cardíaca provocada pelo infarto do miocárdio em ratos foi acompanhada pelo quadro de estresse do RE e pela ativação da via de sinalização JNK/BNIP3. Entretanto, o treinamento físico aeróbico (TFA), uma das principais terapias não farmacológicas mais eficazes das doenças cardiovasculares, foi capaz de atenuar o estresse RE, a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 e a disfunção cardíaca de ratos infartados. Na terceira parte da tese, verificamos que o TFA aumentou a expressão proteica de DERLIN-1, uma proteína que atua retro-translocando proteínas mal enoveladas para o citosol, no miocárdio de ratos saudáveis. O aumento dos níveis proteicos de DERLIN-1 observado em ratos infartados foi atenuado pelo TFA. Apesar do aumento da proteína DERLIN-1, observamos que nos animais infartados as proteínas mal enoveladas acumulavam na forma de oligômeros e que o TFA atenuou essa resposta. Em conjunto, os resultados da presente tese sugerem que a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 pelo estresse do RE causa disfunção contrátil de cardiomiócitos e que o TFA é capaz de atenuar essa resposta no coração de ratos infartados, melhorando o controle de qualidade de proteína no músculo cardíaco / Cardiovascular diseases are currently the main cause of death worldwide, with the ischemic cardiomyopathy as the most prevalent ethiology. This is of particular interest, since ischemic cardiomyopathy advances to heart failure, a common endpoint of the most cardiovascular disease. In the last years, it has been showed that accumulation of unfolded protein in the endoplasmic reticulum (ER stress) may cause cardiac dysfunction and heart failure development. Despite the mechanisms behind this cardiac deterioration is still unknown, evidences suggest that ER stress-induced cardiomyocytes contractile dysfunction results from PI3K/AKT signaling pathway inhibition, which would be caused by JNK activation. In the first part of this thesis, we found that the ER stress activated JNK, but different from our hypothesis it was not accompanied by an inactivation of PI3K/AKT signaling pathway. The inhibition of JNK mitigated the reduction in cardiomyocytes shortening and amplitude of Ca+2 transient caused by ER stress. Once the PI3K/AKT signaling pathway was not involved in the ER stress-induced cardiomyocytes contractile dysfunction, we have analyzed protein expression of BNIP3, another JNK target involved in apoptosis and mitochondria quality control. We observed that the elevation in BNIP3 proteins levels after ER stress induction was prevented by inhibition of JNK. BNIP3 depletion attenuated the reduction in cardiomyocytes contractility and amplitude of Ca+2 transient induced by ER stress. In the second part of the thesis, we found that myocardial infarction-induced cardiac dysfunction in rats was accompanied by ER stress and activation of JNK/BNIP3 signaling pathway. However, the AET mitigated ER stress, activation of JNK/BNIP3 signaling pathway and cardiac dysfunction in infarcted rats. In third part of the thesis, we have identified that AET increased the protein expression of DERLIN-1 an ER membrane protein that retro-translocates unfolded proteins to cytosol in the myocardial of healthy rats. We observed that the increased DERLIN-1 protein levels in infarcted rats were mitigated by AET. Despite increased DERLIN-1 protein expression, we found high levels of oligomers in the myocardium of infarcted rat, which was reduced by AET. It suggests that unfolded protein degradation was reduced in infarcted hearts. Taken together, these results suggest that ER stress causes cardiomyocytes contractile dysfunction through JNK/BNIP3 signaling pathway activation and that AET mitigates the myocardial infarction-induced ER stress and activation of JNK/BNIP3 signaling pathway by restoring of ER-associated protein quality control in the cardiac muscle

O choque séptico é uma síndrome inflamatória sistêmica secundária a um processo infeccioso, no qual as disfunções das células endoteliais e do músculo liso vascular contribuem para suprimento sanguíneo insuficiente a órgãos vitais, com consequente hipotensão sistêmica, insuficiência múltipla de órgãos e morte. Em geral, nos pacientes com choque séptico, existe um desequilíbrio dos fatores hemodinâmicos, levando ao baixo débito cardíaco e vasodilatação, além da redução da resposta contrátil aos diferentes agonistas, nos quais a participação do óxido nítrico (NO), de NO-sintases (NOS) e do estresse oxidativo são evidentes. A contribuição do sistema de peptídeos natriuréticos é evidenciada nos pacientes e em animais submetidos à sepse severa ou ao choque séptico. O peptídeo natriurético tipo C (CNP) é um agente vasodilatador que leva ao relaxamento vascular pela produção de GMPc intracelular, NO, hiperpolarização de membrana das células do músculo liso vascular e redução da concentração citosólica de cálcio. O tratamento com antagonista de receptores NPR-A/B tornou os animais menos susceptíveis à sepse, com menor resposta hipotensora, melhora da contração a agonistas e redução do processo inflamatório e NO plasmático. Portanto, a hipótese do presente trabalho é que no modelo de choque séptico induzido por ligação e perfuração cecal (CLP) em ratos, ocorreria menor resposta vasoconstritora ao agonista seletivo 1-adrenérgico Fenilefrina (PE) e este efeito seria atenuado pela inibição da sinalização desencadeada pelo CNP e modulado pelo estresse oxidativo. A sobrevivência dos ratos CLP foi menor do que a observada em ratos controle-operados (Sham). Os parâmetros cardiovasculares foram mais prejudicados nos ratos CLP do que em ratos Sham. A PE apresentou efeito pressórico menor em ratos CLP comparados aos ratos Sham. O CNP induziu efeito hipotensor em ambos os grupos, porém com maior aumento de frequência cardíaca nos ratos CLP. A contração induzida pela PE foi menor em aorta e artéria mesentérica de resistência, isoladas de ratos CLP, cujo efeito foi modulado pelo endotélio vascular. A vasodilatação induzida pelo CNP foi menor em aorta de ratos CLP. Além disso, o CNP apresentou efeito modulador negativo sobre a contração da PE em aortas com ou sem endotélio, mas não em artérias mesentéricas de resistência isoladas de ratos Sham e CLP. A menor resposta contrátil induzida pela PE em aortas de ratos CLP foi aumentada pelo antagonista de receptor NPR-B, pela inibição das enzimas NOS, xantina oxidase e metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) em aortas com endotélio. O efeito modulador negativo do CNP sobre a contração da PE foi revertido pelo antagonista de receptor NPR-B, inibição de NOS, redução da disponibilidade de O2- e pela degradação de H2O2, em ambos os grupos. Além disso, o estresse oxidativo e a concentração citosólica de H2O2 foram maiores no músculo liso vascular de ratos CLP. A expressão protéica de CNP endógeno foi menor no endotélio e maior no músculo liso da aorta de ratos CLP do que de Sham. Porém, a expressão protéica dos receptores 1-adrenérgicos e NPR-B não foram diferentes entre os grupos, mas a expressão protéica do receptor NPR-C foi menor na aorta de ratos CLP. A mobilização de cálcio intracelular foi menor no músculo liso da aorta de ratos CLP e a alta concentração de potássio extracelular não foi suficiente para despolarizar a membrana das células musculares da aorta de ratos CLP. A expressão protéica dos receptores NPR-B e NPR-C não foram diferentes no coração de ratos CLP. Entretanto, o potencial de membrana do ventrículo esquerdo (VE) dos ratos CLP foi menor que aquele de ratos Sham. Além disso, a concentração citosólica de cálcio no VE de ratos CLP foi menor que em ratos Sham, mas a redução de cálcio citoplasmático induzida pelo CNP foi maior no VE de ratos CLP comparada aquela em ratos Sham. Ocorreu disfunção cardíaca nos ratos CLP. No modelo de choque séptico induzido por cirurgia CLP em ratos, a participação do sistema de peptídeos natriuréticos, sobretudo do CNP, contribui para a menor resposta contrátil à fenilefrina e representa potencial via de intervenção na sepse severa e no choque séptico. / Septic shock is a systemic inflammatory syndrome secondary to an infection which the vascular dysfunction leads to an insufficient blood flow to vital organs with systemic hypotension, multiple organ injury and death. Usually, in septic shock patients there is an imbalance on hemodynamic factors, leading to low cardiac output and vasodilation, with decrease on contractile responses to several agonists, which the contribution of nitric oxide (NO), NO-synthases (NOS) and oxidative stress are evident. The contribution of natriuretic peptide system is observed on patients and animals submitted to severe sepsis or septic shock. C-type natriuretic peptide (CNP) is a vasodilator that leads to vascular relaxation through cGMP, NO, vascular smooth muscle hyperpolarization and reduction in cytosolic calcium. Treatment of animals with NPR-A/B antagonist, as well as knockout mice to NPR-A receptor are less susceptible to sepsis, with less hypotension, enhanced contraction to different agonists and reduction in inflammation and plasma NO. Therefore, the hypothesis of the present work is in septic shock induced by cecal ligation and puncture (CLP) model in rats there is low vasoconstriction to the selective 1- adrenoceptor agonist Phenylephrine (PE) and this effect could be attenuated by the inhibition of CNP signaling, strongly modulated by the oxidative stress. CLP survival was lower than the control rats (Sham) and cardiovascular parameters were impaired in CLP compared to the Sham rats. PE had positive pressure effect lower in CLP than in Sham rats. CNP induced hypotension in both groups with greater increases of cardiac rate in CLP. PE-induced contraction was decreased in aorta and resistance mesenteric artery isolated from CLP rats and this effect was modulated by the vascular endothelium. CNP-induced vasodilation was lower in rat aorta of CLP. Moreover, CNP had a negative modulator effect over the PE contraction on aortas with or without endothelium, but not on resistance mesenteric artery isolated from Sham and CLP rats. The low contractile response induced by PE on CLP aortas was enhanced by NPR-B antagonist, and by NOS, xanthine oxidase or extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) inhibition on aortas with endothelium. The negative modulation induced by CNP over the PE contraction was reversed by the presence of NPR-B antagonist, NOS inhibition, and by the decrease on O2- availability and H2O2 degradation in both groups. Furthermore, oxidative stress and H2O2 intracellular content were greater on vascular smooth muscle of CLP rats. Protein expression of endogenous CNP was lower on endothelium and greater on smooth muscle of aortas isolated from CLP compared to Sham rats. However, the protein expression of 1-adrenoceptor and NPR-B were not different between the groups, but the protein expression of NPR-C was lower on smooth muscle of CLP aortas. Intracellular calcium mobilization was decreased on vascular smooth muscle of CLP aortas and extracellular high potassium solution was not able to depolarize smooth muscle layer of CLP aortas. Protein expression of NPR-B and NPR-C were not different on CLP hearts. However, membrane potential of left ventricle (LV) of CLP was lower than in Sham rats. Besides, intracellular calcium content of LV of CLP was lower than Sham rats but the decrease on cytosolic calcium induced by CNP was greater on LV of CLP compared to the Sham rats. There was cardiac dysfunction on CLP rats. In rat CLP septic shock model, the role of natriuretic peptide, mainly CNP, is of great importance in the decreased 1-adrenoceptor contraction, representing a potential via of intervention on severe sepsis and septic shock.

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo, sendo a cardiomiopatia isquêmica a mais prevalente. Independente da sua etiologia, a via final comum da maioria das doenças cardiovasculares é a insuficiência cardíaca. Nos últimos anos, tem sido reportado que o acúmulo de proteínas mal enoveladas no retículo endoplasmático (estresse do RE) pode contribuir para redução da função cardíaca e instalação da insuficiência cardíaca. Apesar do mecanismo responsável pela disfunção contrátil induzida pelo estresse do RE ainda não ser conhecido, evidências sugerem que a inibição da via de sinalização PI3K/AKT pela proteína JNK pode estar envolvida nessa resposta. Na primeira parte desta tese, verificamos que a indução do estresse do RE em cardiomiócitos isolados ativou a JNK, mas não inibiu a via de sinalização PI3K/AKT. A inativação de JNK reverteu a disfunção contrátil e a redução da amplitude do transiente de Ca+2 de cardiomiócitos causados pelo estresse do RE. Pelo fato da via sinalização PI3K/AKT não estar envolvida na disfunção contrátil causada pelo estresse do RE, analisamos outro alvo de JNK, a proteína BNIP3, proteína pró-apoptótica e envolvida no controle de qualidade mitocondrial promovendo mitofagia quando ativada. O estresse do RE aumentou a expressão de BNIP3, a qual foi atenuada pela inibição de JNK. A depleção de BNIP3 impediu a disfunção contrátil dos cardiomiócitos e a redução da amplitude do transiente de Ca+2 induzidos pelo estresse do RE. Na segunda parte da tese, o objetivo foi avaliar se os efeitos observados em cardiomiócitos submetidos a estresse do RE poderiam ser observados em modelo experimental de doença cardiovascular. Nesse sentido, observamos que a disfunção cardíaca provocada pelo infarto do miocárdio em ratos foi acompanhada pelo quadro de estresse do RE e pela ativação da via de sinalização JNK/BNIP3. Entretanto, o treinamento físico aeróbico (TFA), uma das principais terapias não farmacológicas mais eficazes das doenças cardiovasculares, foi capaz de atenuar o estresse RE, a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 e a disfunção cardíaca de ratos infartados. Na terceira parte da tese, verificamos que o TFA aumentou a expressão proteica de DERLIN-1, uma proteína que atua retro-translocando proteínas mal enoveladas para o citosol, no miocárdio de ratos saudáveis. O aumento dos níveis proteicos de DERLIN-1 observado em ratos infartados foi atenuado pelo TFA. Apesar do aumento da proteína DERLIN-1, observamos que nos animais infartados as proteínas mal enoveladas acumulavam na forma de oligômeros e que o TFA atenuou essa resposta. Em conjunto, os resultados da presente tese sugerem que a ativação da via de sinalização JNK/BNIP3 pelo estresse do RE causa disfunção contrátil de cardiomiócitos e que o TFA é capaz de atenuar essa resposta no coração de ratos infartados, melhorando o controle de qualidade de proteína no músculo cardíaco / Cardiovascular diseases are currently the main cause of death worldwide, with the ischemic cardiomyopathy as the most prevalent ethiology. This is of particular interest, since ischemic cardiomyopathy advances to heart failure, a common endpoint of the most cardiovascular disease. In the last years, it has been showed that accumulation of unfolded protein in the endoplasmic reticulum (ER stress) may cause cardiac dysfunction and heart failure development. Despite the mechanisms behind this cardiac deterioration is still unknown, evidences suggest that ER stress-induced cardiomyocytes contractile dysfunction results from PI3K/AKT signaling pathway inhibition, which would be caused by JNK activation. In the first part of this thesis, we found that the ER stress activated JNK, but different from our hypothesis it was not accompanied by an inactivation of PI3K/AKT signaling pathway. The inhibition of JNK mitigated the reduction in cardiomyocytes shortening and amplitude of Ca+2 transient caused by ER stress. Once the PI3K/AKT signaling pathway was not involved in the ER stress-induced cardiomyocytes contractile dysfunction, we have analyzed protein expression of BNIP3, another JNK target involved in apoptosis and mitochondria quality control. We observed that the elevation in BNIP3 proteins levels after ER stress induction was prevented by inhibition of JNK. BNIP3 depletion attenuated the reduction in cardiomyocytes contractility and amplitude of Ca+2 transient induced by ER stress. In the second part of the thesis, we found that myocardial infarction-induced cardiac dysfunction in rats was accompanied by ER stress and activation of JNK/BNIP3 signaling pathway. However, the AET mitigated ER stress, activation of JNK/BNIP3 signaling pathway and cardiac dysfunction in infarcted rats. In third part of the thesis, we have identified that AET increased the protein expression of DERLIN-1 an ER membrane protein that retro-translocates unfolded proteins to cytosol in the myocardial of healthy rats. We observed that the increased DERLIN-1 protein levels in infarcted rats were mitigated by AET. Despite increased DERLIN-1 protein expression, we found high levels of oligomers in the myocardium of infarcted rat, which was reduced by AET. It suggests that unfolded protein degradation was reduced in infarcted hearts. Taken together, these results suggest that ER stress causes cardiomyocytes contractile dysfunction through JNK/BNIP3 signaling pathway activation and that AET mitigates the myocardial infarction-induced ER stress and activation of JNK/BNIP3 signaling pathway by restoring of ER-associated protein quality control in the cardiac muscle

O choque séptico é uma síndrome inflamatória sistêmica secundária a um processo infeccioso, no qual as disfunções das células endoteliais e do músculo liso vascular contribuem para suprimento sanguíneo insuficiente a órgãos vitais, com consequente hipotensão sistêmica, insuficiência múltipla de órgãos e morte. Em geral, nos pacientes com choque séptico, existe um desequilíbrio dos fatores hemodinâmicos, levando ao baixo débito cardíaco e vasodilatação, além da redução da resposta contrátil aos diferentes agonistas, nos quais a participação do óxido nítrico (NO), de NO-sintases (NOS) e do estresse oxidativo são evidentes. A contribuição do sistema de peptídeos natriuréticos é evidenciada nos pacientes e em animais submetidos à sepse severa ou ao choque séptico. O peptídeo natriurético tipo C (CNP) é um agente vasodilatador que leva ao relaxamento vascular pela produção de GMPc intracelular, NO, hiperpolarização de membrana das células do músculo liso vascular e redução da concentração citosólica de cálcio. O tratamento com antagonista de receptores NPR-A/B tornou os animais menos susceptíveis à sepse, com menor resposta hipotensora, melhora da contração a agonistas e redução do processo inflamatório e NO plasmático. Portanto, a hipótese do presente trabalho é que no modelo de choque séptico induzido por ligação e perfuração cecal (CLP) em ratos, ocorreria menor resposta vasoconstritora ao agonista seletivo 1-adrenérgico Fenilefrina (PE) e este efeito seria atenuado pela inibição da sinalização desencadeada pelo CNP e modulado pelo estresse oxidativo. A sobrevivência dos ratos CLP foi menor do que a observada em ratos controle-operados (Sham). Os parâmetros cardiovasculares foram mais prejudicados nos ratos CLP do que em ratos Sham. A PE apresentou efeito pressórico menor em ratos CLP comparados aos ratos Sham. O CNP induziu efeito hipotensor em ambos os grupos, porém com maior aumento de frequência cardíaca nos ratos CLP. A contração induzida pela PE foi menor em aorta e artéria mesentérica de resistência, isoladas de ratos CLP, cujo efeito foi modulado pelo endotélio vascular. A vasodilatação induzida pelo CNP foi menor em aorta de ratos CLP. Além disso, o CNP apresentou efeito modulador negativo sobre a contração da PE em aortas com ou sem endotélio, mas não em artérias mesentéricas de resistência isoladas de ratos Sham e CLP. A menor resposta contrátil induzida pela PE em aortas de ratos CLP foi aumentada pelo antagonista de receptor NPR-B, pela inibição das enzimas NOS, xantina oxidase e metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) em aortas com endotélio. O efeito modulador negativo do CNP sobre a contração da PE foi revertido pelo antagonista de receptor NPR-B, inibição de NOS, redução da disponibilidade de O2- e pela degradação de H2O2, em ambos os grupos. Além disso, o estresse oxidativo e a concentração citosólica de H2O2 foram maiores no músculo liso vascular de ratos CLP. A expressão protéica de CNP endógeno foi menor no endotélio e maior no músculo liso da aorta de ratos CLP do que de Sham. Porém, a expressão protéica dos receptores 1-adrenérgicos e NPR-B não foram diferentes entre os grupos, mas a expressão protéica do receptor NPR-C foi menor na aorta de ratos CLP. A mobilização de cálcio intracelular foi menor no músculo liso da aorta de ratos CLP e a alta concentração de potássio extracelular não foi suficiente para despolarizar a membrana das células musculares da aorta de ratos CLP. A expressão protéica dos receptores NPR-B e NPR-C não foram diferentes no coração de ratos CLP. Entretanto, o potencial de membrana do ventrículo esquerdo (VE) dos ratos CLP foi menor que aquele de ratos Sham. Além disso, a concentração citosólica de cálcio no VE de ratos CLP foi menor que em ratos Sham, mas a redução de cálcio citoplasmático induzida pelo CNP foi maior no VE de ratos CLP comparada aquela em ratos Sham. Ocorreu disfunção cardíaca nos ratos CLP. No modelo de choque séptico induzido por cirurgia CLP em ratos, a participação do sistema de peptídeos natriuréticos, sobretudo do CNP, contribui para a menor resposta contrátil à fenilefrina e representa potencial via de intervenção na sepse severa e no choque séptico. / Septic shock is a systemic inflammatory syndrome secondary to an infection which the vascular dysfunction leads to an insufficient blood flow to vital organs with systemic hypotension, multiple organ injury and death. Usually, in septic shock patients there is an imbalance on hemodynamic factors, leading to low cardiac output and vasodilation, with decrease on contractile responses to several agonists, which the contribution of nitric oxide (NO), NO-synthases (NOS) and oxidative stress are evident. The contribution of natriuretic peptide system is observed on patients and animals submitted to severe sepsis or septic shock. C-type natriuretic peptide (CNP) is a vasodilator that leads to vascular relaxation through cGMP, NO, vascular smooth muscle hyperpolarization and reduction in cytosolic calcium. Treatment of animals with NPR-A/B antagonist, as well as knockout mice to NPR-A receptor are less susceptible to sepsis, with less hypotension, enhanced contraction to different agonists and reduction in inflammation and plasma NO. Therefore, the hypothesis of the present work is in septic shock induced by cecal ligation and puncture (CLP) model in rats there is low vasoconstriction to the selective 1- adrenoceptor agonist Phenylephrine (PE) and this effect could be attenuated by the inhibition of CNP signaling, strongly modulated by the oxidative stress. CLP survival was lower than the control rats (Sham) and cardiovascular parameters were impaired in CLP compared to the Sham rats. PE had positive pressure effect lower in CLP than in Sham rats. CNP induced hypotension in both groups with greater increases of cardiac rate in CLP. PE-induced contraction was decreased in aorta and resistance mesenteric artery isolated from CLP rats and this effect was modulated by the vascular endothelium. CNP-induced vasodilation was lower in rat aorta of CLP. Moreover, CNP had a negative modulator effect over the PE contraction on aortas with or without endothelium, but not on resistance mesenteric artery isolated from Sham and CLP rats. The low contractile response induced by PE on CLP aortas was enhanced by NPR-B antagonist, and by NOS, xanthine oxidase or extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) inhibition on aortas with endothelium. The negative modulation induced by CNP over the PE contraction was reversed by the presence of NPR-B antagonist, NOS inhibition, and by the decrease on O2- availability and H2O2 degradation in both groups. Furthermore, oxidative stress and H2O2 intracellular content were greater on vascular smooth muscle of CLP rats. Protein expression of endogenous CNP was lower on endothelium and greater on smooth muscle of aortas isolated from CLP compared to Sham rats. However, the protein expression of 1-adrenoceptor and NPR-B were not different between the groups, but the protein expression of NPR-C was lower on smooth muscle of CLP aortas. Intracellular calcium mobilization was decreased on vascular smooth muscle of CLP aortas and extracellular high potassium solution was not able to depolarize smooth muscle layer of CLP aortas. Protein expression of NPR-B and NPR-C were not different on CLP hearts. However, membrane potential of left ventricle (LV) of CLP was lower than in Sham rats. Besides, intracellular calcium content of LV of CLP was lower than Sham rats but the decrease on cytosolic calcium induced by CNP was greater on LV of CLP compared to the Sham rats. There was cardiac dysfunction on CLP rats. In rat CLP septic shock model, the role of natriuretic peptide, mainly CNP, is of great importance in the decreased 1-adrenoceptor contraction, representing a potential via of intervention on severe sepsis and septic shock.