Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La mitogaligine est une protéine codée par galig, un nouveau gène cytotoxique. Les résultats précédemment obtenus indiquent que cette protéine, adressée aux mitochondries, induit la fuite vers le cytoplasme d'un effecteur pro-apoptotique mitochondrial, le cytochromec. Cette nouvelle étude suggère tout d'abord, que l'interaction directe de la mitogaligine avec la cardiolipine, un phospholipide spécifique des mitochondries, puisse être à l'origine de la destabilisation des membranes mitochondriales, et expliquer ainsi la fuite de cytochrome c. Ce faisceau de résultats indique que la cytotoxicité de galig est associée à l'action de la mitogaligine sur les mitochrondries. Dans une seconde partie, la mort cellulaire induite par la mitogaligine a été caractérisée. Bien que les mitochondries soient précocemment altérées, il apparaît que la mitogaligine puisse également être adressée au noyau des cellules, et induire la mort cellulaire à partir de ce compartiment. Ces résultats suggèrent que l'activité cytotoxique de la mitogaligine puisse être régulée par son adressage subcellulaire.

La cachexie est un syndrome complexe caractérisé par une balance énergétique négative. Le rôle joué par le métabolisme énergétique mitochondrial dans ce syndrome est peu connu. Nos précédents travaux montraient une diminution de la synthèse de l’ATP dans les mitochondries hépatiques en stade de cachexie cancéreuse sévère. Dans ce travail, nous démontrons, in vitro, que l’augmentation de la production d’espèce réactive de l’oxygène et du contenu en cardiolipine dans des mitochondries hépatiques saines, mime partiellement les mécanismes observés lors d’un stade cachexie sévère. Nous observons cependant que l’altération du métabolisme mitochondrial hépatique apparait à un stade tardif du développement de la cachexie. En stade sévère les mitochondries musculaires ne développent pas d’altération de leur efficacité de synthèse d’ATP mais une diminution des leurs capacités oxydatives. / Cancer cachexia is a composite syndrome, characterized by a negative energetic balance. The role played by mitochondrial energetic metabolism in this syndrome is poor known. Our past work showed a decrease of ATP synthesis efficiency in hepatic mitochondria in severe state of cancer cachexia. In this work, we demonstrate, in vitro, that increase of reactive oxygen species and cardiolipine content, in healthy mitochondria, can partly mimic the mechanisms observed in severe state of cancer cachexia. We observe that alteration of hepatic mitochondrial metabolism appear last during the development of cancer cachexia. In sever state of cancer cachexia, skeletal muscle mitochondria don’t develop this alteration but demonstrated a decrease of oxidative capacities.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l'interaction du complexe Nitrate Reductase A (NarGHI) avec les quinones et les lipides de la membrane chez E. coli. Nous avons identifié que les intermédiaires ménasmiquinones interagissent avec une liaison hydrogène avec l'histidine 66 du site Qd. Par ailleurs, nous avons mis en évidence par la fixation spécifique d'une molécule de cardiolipine est indispensable au fonctionnement du complexe NarGHI en permettant la fixation du quinol. Enfin, nous avons démontré l'existence d'une liaison fonctionnelle entre la voie de biosynthèse des hèmes et les complexes respiratoires via la protéine HemG, qui couple la réduction des quinones avec l'oxydation du protoporphyrinogène IX. Ces éléments prouvent qu'une voie catalytique peut contribuer à la synthèse ATP. L'ensemble de ces résultats indique une étroite interconnexion physique et fonctionnelle entre tous les éléments qui composent la membrane cytoplasmique d'E. coli / In this thesis, I study the interaction between the nitrate reductase A comlex (NarGHI) with the quinines and lipids of the E. coli cytoplasmic membrane. We demonstrate that His66 present at the Qd site is directly hydrogen bonded to both menasemiquinone and ubisemiquinone species. In addition, we show that functionning of the enzyme complex is controlled by cardiolipin binding in a specific cavity allowing quinol binding at the nearby QD site. Finally, we relealed that heme biosynthesis is a quinone-depended metabolic reaction during anaerobic growth of E. coli, in wich the HemG protein will direct electron transfer issued from oxidation of a heme biosynthetic intermediate towards quinone molecules via interaction between quinones, lipids and membrane- associated complexes that couple respiration and anabolic pathways to ATP generation in specialized domains of E. coli membrane

Les cardiolipines (CL), phospholipides spécifiques des membranes mitochondriales, sont impliquées dans différentes fonctions mitochondriales. Il a été précédemment démontré que l’accumulation des CL entraînait une augmentation du gaspillage énergétique mitochondrial hépatique et une réduction du rendement de la synthèse d’ATP. Ces travaux de thèse montrent qu’à l’inverse, une diminution modérée de la quantité de CL (- 45 %) induit une réduction des capacités oxydatives mitochondriales sans diminuer la synthèse d’ATP et donc une augmentation de l’efficacité de la synthèse d’ATP. Nous démontrons également les mécanismes conduisant à l’accumulation des cardiolipines hépatiques en situation de cachexie cancéreuse. Le TNFa, cytokine proinflammatoire impliquée dans la cachexie cancéreuse, induit une surexpression spécifique de la phosphatidylglycérolphosphate synthase. La surexpression de cette enzyme impliquée dans la synthèse de novo des CL entraîne une accumulation de CL, responsable du gaspillage énergétique mitochondrial. / Cardiolipin (CL), a specific mitochondrial phospholipid, is involved in various mitochondrial functions. It has been shown that CL accumulation led to increased mitochondrial hepatic energy wasting and reduced ATP synthesis efficiency. This work showed, on the opposite, that moderate reduction in CL content (-45%) induced a decrease in mitochondrial oxidative capacity without decreasing ATP synthesis rate and thus an increased ATP synthesis efficiency. Then we demonstrated mechanisms responsible for hepatic cardiolipin accumulation during cancer cachexia. TNFa, proinflammatory cytokine involved in cancer cachexia, induced a specific overexpression of phosphatidylglycerolphosphate synthase. Overexpression of this enzyme involved into CL de novo biosynthesis led to CL accumulation, responsible for energy wasting during cancer.

Ce travail a porté sur une nouvelle protéine impliquée dans l’apoptose, la mitogaligine, et plus particulièrement sur le fragment interne [31-53] responsable de son adressage à la mitochondrie. L’objectif général du projet est de comprendre au niveau atomique son mécanisme d’action sur les membranes mitochondriales. Le fragment d’adressage est à lui seul cytotoxique. C’est pourquoi j’ai concentré l’essentiel de mon travail de thèse sur son étude. Nous avons défini sa toxicité sur des cellules humaines et montré qu’il perturbait l’intégrité membranaire, excluant certaines protéines de la mitochondrie. Ce phénomène concorde avec le relargage de cytochrome c, à l’origine du déclenchement de l’apoptose par la voie mitochondriale. Pour mieux comprendre le mode d’action du fragment d’adressage et le rôle joué par la cardiolipine, lipide caractéristique des membranes mitochondriales, j’ai étudié par différentes techniques biophysiques complémentaires l’effet du milieu membranaire sur la structuration du peptide et l’effet du peptide sur la membrane. Le peptide a une très forte affinité (13nM) pour des membranes contenant de la cardiolipine. Il se place à plat sur la membrane, s’enfouissant dans l’interface, sans induire d’organisation particulière des lipides. De plus, nous avons mis en évidence que le peptide était capable d’induire une courbure positive de la membrane, ce qui va interférer avec de nombreux processus vitaux pour la cellule. Enfin, pour réaliser les études structurales et fonctionnelles de la protéine entière, j’ai participé aux premières étapes de production de mitogaligine, qui s’est avéré très délicate aussi bien par voie d’expression que par synthèse chimique. / This work is about a new protein of apoptosis, mitogaligin, and more particularly about the internal fragment [31-53] responsible for its mitochondrial targeting. General aim of the project is to understand at the atomic scale its mechanism of action on mitochondrial membranes. The addressing fragment is cytotoxic by itself. That is the reason why I focused the main part of my work on this peptide. We defined its toxicity on human cells and showed that it was capable of disrupting the membrane integrity, excluding some proteins from mitochondrion. This phenomenon agrees with the release of cytochrom c, which induces apoptosis by the mitochondrial pathway. In order to better understand the mode of action of the addressing fragment and the role played by Cardiolipin, a specific lipid of mitochondrial membranes, I studied by various and complementary biophysics techniques the effect of membrane environments on the peptide structuration and the effect of the peptide on the membrane. The peptide has a very high affinity (13nM) for cardiolipin-containing membranes. It takes place parallel to the membrane, standing at the interface, without leading to a particular lipids organization. Furthermore, we highlighted that the peptide was capable of inducing a positive curvature of the membrane, what is going to interfere with numerous vital processes for the cell. Finally, to realize the structural and functional studies of the whole protein, I was involved in the first stages of mitogaligin’s production, which has proved to be very tricky either by recombinant pathway or by chemical synthesis.

Ce travail a porté sur une nouvelle protéine impliquée dans l'apoptose, la mitogaligine, et plus particulièrement sur le fragment interne [31-53] responsable de son adressage à la mitochondrie. L'objectif général du projet est de comprendre au niveau atomique son mécanisme d'action sur les membranes mitochondriales. Le fragment d'adressage est à lui seul cytotoxique. C'est pourquoi j'ai concentré l'essentiel de mon travail de thèse sur son étude. Nous avons défini sa toxicité sur des cellules humaines et montré qu'il perturbait l'intégrité membranaire, excluant certaines protéines de la mitochondrie. Ce phénomène concorde avec le relargage de cytochrome c, à l'origine du déclenchement de l'apoptose par la voie mitochondriale. Pour mieux comprendre le mode d'action du fragment d'adressage et le rôle joué par la cardiolipine, lipide caractéristique des membranes mitochondriales, j'ai étudié par différentes techniques biophysiques complémentaires l'effet du milieu membranaire sur la structuration du peptide et l'effet du peptide sur la membrane. Le peptide a une très forte affinité (13nM) pour des membranes contenant de la cardiolipine. Il se place à plat sur la membrane, s'enfouissant dans l'interface, sans induire d'organisation particulière des lipides. De plus, nous avons mis en évidence que le peptide était capable d'induire une courbure positive de la membrane, ce qui va interférer avec de nombreux processus vitaux pour la cellule. Enfin, pour réaliser les études structurales et fonctionnelles de la protéine entière, j'ai participé aux premières étapes de production de mitogaligine, qui s'est avéré très délicate aussi bien par voie d'expression que par synthèse chimique.

Les isoenzymes de nucléoside diphosphate kinase (NDPK) sont connues depuis maintenant presque 60 ans et n'ont été considérées que pour leur activité catalytique de transfert de groupement phosphoryle. La découverte du gène nme, un gène antimétastatique codant une NDPK, a renouvelé l'intérêt scientifique pour cette famille d'enzymes. Il est désormais connu que la multiplication des gènes durant l'évolution a été accompagnée de diversifications structurales et fonctionnelles. J'ai étudié la fixation des NDPK-A, -B et –D (retrouvées associées aux membranes biologiques, bien que le rôle de cette association soit encore méconnu) à des membranes modèles, et j'ai trouvé des différences dans les mécanismes de fixation. J'ai montré la capacité de la NDPK-D, isoforme mitochondriale, à interagir avec des membranes anioniques ou zwitterioniques, à augmenter leur fluidité et à former des domaines protéolipidiques en présence de CL, lipide anionique spécifique de la membrane mitochondriale interne. J'ai observé cette capacité à former des domaines protéolipidiques avec d'autres protéines interagissant avec la CL, comme la créatine kinase mais pas le cytochrome C. La NDPK-A ne se fixe pas aux phospholipides du feuillet interne de la membrane plastique, ce qui suggère un autre partenaire in vivo. La NDPK-B n'interagit qu'avec des membranes anioniques via un processus en deux étapes, provoque une diminution de fluidité et est capable de former des domaines protéolipidiques. La ségrégation des lipides anioniques induite par la fixation de protéines pourrait contribuer à la formation de plateformes au sein de la membrane susceptibles de servir de point d'ancrage à de nombreuses molécules, modulant ainsi les fonctions cellulaires / Nucleoside diphosphate kinase isoenzymes (NDPK) have been known for nearly 60 years and, until recently, have been considered as housekeeping enzymes. The discovery of a nme gene, an antimetastatic gene that codes for a NDPK, revived the interest for this family. It is now known that the multiplication of nme genes throughout evolution has been accompanied with structural and functional diversification. I studied the binding of NDPK-A, -B and –D (which ae retrieved associated to cellular membranes where they are thought to play several roles) to model membranes and found differences in their behavior towards different compositions of phospholipids. I showed the ability of the NDPKD mitochondrial isoform to interact with both anionic and zwitterionic membranes, to modify their fluidity and to form proteolipidic domains in presence of CL, a mitochondrial inner membrane specific anionic lipid. I observed this ability to form proteo-cardiolipin domains with other CL interacting protein like creatine kinase but not with cytochrome c. NDPK-A was not able to bind to inner leaflet plasma membrane mimicking systems suggesting another partner in vivo. Concerning NDPK-B, it interacted only with anionic membranes via a two step-process, induced a decrease of the membrane fluidity and was able to form proteolipidic domains. Such anionic lipid segregation triggered by protein binding may contribute to platforms formation within membranes. Those platforms are then susceptible to provide a functional docking platform for numerous molecules and thus to modulate cellular functions

Le but de cette thèse est de montrer la réponse de la membrane mitochondriale au cours la régulation de l’apoptose en étudiant l’effet de domaines clés sur la dynamique membranaire et l’importance de la composition phospholipidiques des modèles utilisés. Le domaine BH4 est la partie spécifique anti-apoptotique de la famille Bcl-2. La première étape a été de synthétiser le peptide par voie chimique en utilisant la synthèse peptidique en phase solide. Un protocole décrivant les étapes de purification par chromatographie liquide et de caractérisation par spectroscopie de masse, garantissant une pureté indispensable pour des études biophysiques, a été établi. La modification de la structure secondaire du peptide interagissant avec des vésicules a été étudiée par spectroscopie infrarouge ainsi que par dichroïsme circulaire. Le peptide s’agrège à la surface et s’insère peu profondément dans la partie hydrophobe de la membrane. En utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la calorimétrie, il a été montré que le peptide BH4 modifie l’organisation et la dynamique des liposomes mimant la surface mitochondriale. La deuxième étude a porté sur la première hélice de la protéine pro-apoptotique Bax (Bax-a1) qui a la propriété de diriger la protéine cytosolique vers la mitochondrie. Un protocole de synthèse et purification a été à nouveau établi. Le but de cette étude est de démontrer le rôle de l’interaction spécifique entre la cardiolipine, un phospholipide uniquement présent dans la mitochondrie et le peptide Bax-a1. Les études RMN ont montré que Bax-a1 n’interagissait uniquement que si la cardiolipine était présente, produisant un fort effet électrostatique piégeant le peptide à la surface de la membrane. Enfin, un nouveau protocole permettant d’étudier la réponse des lipides de mitochondries isolées toujours actives par RMN est présenté. Le but est de pouvoir directement observer les modifications subies par chaque phospholipide de la mitochondrie. . / The aim of this thesis was the investigation of the mitochondrial response mechanisms upon apoptotic stimuli. The specific objectives were the biophysical characterization of membrane dynamics and the specific roles of lipids in the context of apoptotic regulation occurring at the mitochondrion and its complex membrane systems. The BH4 domain is an anti-apoptotic specific domain of the Bcl-2 protein. Solid phase peptide synthesis was used to produce large amount of the peptide for biophysical studies. A protocol has been established and optimized, guarantying the required purity for biophysical studies. In detail the purification by high performance liquid chromatography and the characterisation via mass spectroscopy are described. The secondary structure of BH4 changes significantly in the presence of lipid vesicles as observed by infrared spectroscopy and circular dichroism. The BH4 peptide aggregates at the membrane surface and inserts slightly into the hydrophobic part of the membrane. Using nuclear magnetic resonance (NMR) and calorimetry techniques, it could even be shown that the BH4 domain modifies the dynamic and organization of the liposomes which mimic a mitochondrial surface. The second study was on the first helix of the pro-apoptotic protein Bax. This sequence called Bax-a1 has the function to address the cytosolic Bax protein to the mitochondrial membrane upon activation. Once again a protocol has been established for the synthesis and purification of this peptide. The aim was to elucidate the key role of cardiolipin, a mitochondria-specific phospholipid, in the interaction of Bax-a1 with the mitochondrial membrane system. The NMR and circular dichroism studies showed that Bax-a1 interacts with the membrane models only if they contain the cardiolipin, producing a strong electrostatic lock effect which is located at the membrane surface. Finally, a new NMR approach was developed which allows the investigation of the lipid response of isolated active mitochondria upon the presence of apoptotic stimuli. The goal was there to directly monitor lipid specific the occurring changes during these physiological activities.