Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Costa de Carvalho.pdf: 1454881 bytes, checksum: 831238c6d9864b9fca7efc9ba6164541 (MD5) Previous issue date: 2007-09-25 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The municipal district of Raposa located in the State of Maranhão, Brazil, is an endemic area of human and canine visceral leishmaniasis. Dogs are considered to be the principal Leishmania chagasi reservoir in this location. The objective of this study was to examine the relative levels of parasitic DNA in different tissues of infected dogs and their association with clinical signs of Leishmaniasis. We initiated this study by collecting blood samples from 233 distinct dogs that were analyzed by means of serological diagnosis. Of all examined dogs, 69 were positive in the anti-Leishmania ELISA. According to technical reasons only 27 of the Leishmania infected dogs could be recaptured and studied. The animals were classified according to their clinical signs in asymptomatics (10 animals), oligosymptomatics (8 animals) and polysymptomatics (9 animals) groups. A quantitative PCR method was developed and established in order to examine the parasitic load in blood, bone marrow, lymph node, spleen and skin. The parasite could be detected in lymph nodes of all animals analyzed (100%). The tissue with the highest parasitic load was lymph nodes followed by spleen, blood, bone marrow and skin. Comparing all analyzed tissues, the lymph nodes presented the highest levels of parasitic DNA, without exception, regardless their symptoms classification. Contrary to various other studies, we have detected the lowest parasitic DNA concentration in skin tissues. The quantitative PCR assay established in this study was sensitive, fast and inexpensive for qualitative and quantitative analyses of the Leishmania chagasi DNA. The canine lymph node is the most frequently infected tissue, with greater levels of parasitic DNA, and may be considered a target tissue for leishmaniasis monitoring in dogs. / O município de Raposa (Maranhão, Brasil) é uma área endêmica de leishmaniose visceral humana e canina. Neste município, cães são considerados o principal reservatório de Leishmania chagasi. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração do DNA parasitário em diferentes tecidos de cães infectados e sua associação com sinais clínicos de leishmaniose. Iniciamos este estudo com a coleta de sangue de 233 cães para diagnóstico sorológico da infecção. Dentre todos os cães examinados, 69 apresentaram anticorpos anti-Leishmania no teste ELISA. Destes, apenas 27 puderam ser recapturados e estudados. Os animais foram classificados de acordo com avaliação clínica em assintomáticos (n=10); oligossintomáticos (n=8) e polissintomáticos (n=9). A técnica de PCR quantitativa foi desenvolvida e padronizada para avaliar a concentração de DNA parasitário em sangue, medula, linfonodo, baço e pele. O parasito foi detectado em todas as amostras de linfonodo analisadas (100%). O tecido com os maiores níveis de DNA parasitário foi o linfonodo, seguido pelo baço, sangue, medula e pele. Comparando-se os tecidos analisados, o linfonodo foi o tecido com as maiores cargas parasitárias, sem exceção, entre animais assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos. Contrariamente a outros estudos, detectamos baixos níveis de DNA parasitário em amostras de pele. A PCR quantitativa padronizada neste estudo foi um método sensível, rápido e econômico para detectar e determinar os níveis de DNA parasitário de Leishmania chagasi. Em cães, o linfonodo é o tecido mais acometido pelo parasito e com maiores níveis de DNA, podendo ser considerado o sítio ideal para o monitoramento da leishmaniose canina.

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.