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Caracterização fenotípica e genotípica de cepas de Chromobacterium violaceum isolados no estado do CearáMendes, Rafael de Carvalho January 2010 (has links)
Rafael de Carvalho Mendes. Caracterização fenotípica e genotípica de cepas de Chromobacterium violaceum isolados no estado do Ceará. 2010. 70 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-03T11:57:09Z
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Previous issue date: 2010 / Chromobacterium violaceum é classificada como uma β-proteobactéria, saprófita, comumente encontrada em solo de regiões de clima tropical e subtropical, produz vários metabólitos de grande interesse biotecnológico, dentre eles, a violaceína. Este trabalho consiste numa caracterização fenotípica e genotípica de cinco cepas de Chromobacterium violaceum isolados nos Municípios de Tejussuóca e Banabuiú, ambas, no Estado do Ceará. A caracterização genotípica consistiu de sequenciamento da região rDNA 16S e análises RFLP do gene recA. Para a caracterização fenotípica, foram realizados testes bioquímicos e susceptibilidade a antibióticos, a óleos essenciais de Lippia alba, bem como seus constituintes majoritários. Com o sequenciamento, as cepas isoladas no estado do Ceará são espécies de Chromobacterium violaceum. Por ser um gene conservado, o recA é utilizado como marcador molecular, fornecendo mais informações na especificidade dos genoma bacterianos. Pela a análise por RFLP, as cepas 1425, 1323, 2221 e a ATCC 12472 apresentaram três fragmentos digeridos pela enzima, enquanto que as cepas 1221 e 1222 apresentaram dois fragmentos, indicando sequências nucleotídicas diferentes para este gene conservado. As cincos cepas apresentaram características fenotípicas iguais a Chromobacterium violaceum ATCC 12472, todas demonstraram ser resistentes a uma grande variedade de antibióticos β-lactâmicos e mais susceptíveis as fluorquinolonas. Este é o primeiro trabalho na literatura científica que trata da ação antimicrobiana dos óleos essenciais da Lippia alba sobre a Chromobacterium violaceum, e pelos resultados obtidos, os óleos essenciais exerceram ação bactericida sobre todas as cepas, sugerindo ser uma possível alternativa de tratamento nos casos de doença provocada pela Chromobacterium violaceum, que na maioria dos casos é confundida pela classe médica com a melioidose provocada pela Burkholderia pseudomallei.
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ANÁLISE DE TRANSMISSÃO E DA DINÂMICA DE MODIFICAÇÃO DE GENÓTIPOS DE Mycobacterium tuberculosis NA REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA ES EM UM INTERVALO DE 10 ANOSNOBREGA, R. L. P. 25 February 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-02-25 / Introdução: Técnicas de tipagem molecular têm colaborado para o entendimento da dinâmica de transmissão da tuberculose (TB). Apesar de inúmeros trabalhos terem sido publicados a esse respeito, poucos estudos, no entanto, foram realizados levando-se em consideração a dinâmica de modificação dos perfis genotípicos de M. tuberculosis (Mtb) em um intervalo de tempo longo. Objetivos: Caracterizar os genótipos e identificar os fatores de risco associados com transmissão recente e tamanho de cluster de Mtb na Região Metropolitana de Vitória ES (RMV) e analisar a dinâmica de modificação dos genótipos de Mtb na Região Metropolitana de Vitória ES em intervalo de 10 anos. Métodos: Este estudo foi constituído de duas partes. Primeira parte: Estudo transversal de casos novos de TB diagnosticados na RMV, entre 2000 e 2010 para identificar fatores de risco associados à transmissão recente da TB e o tamanho do cluster de Mtb. A genotipagem dos isolados de Mtb foi realizada com base nos métodos de RFLP IS 6110, Spoligotyping e na análise de deleção RDRio. Foram realizados Modelos de regressão hierárquica polinomial para identificar os fatores associados com o tamanho do cluster. Segunda Parte: Estudo observacional para analisar a dinâmica de modificação dos genótipos de Mtb na RMV em intervalo de 10 anos (com cortes transversais nos períodos de 2000 2001 e 2011) com base nas técnicas de RFLP IS 6110 e MIRU- VNTR 24 loci tendo como fonte de dados registros laboratoriais e o SINAN. Resultados: Primeira Parte: Dentre os 959 isolados de Mtb, 461 (48%) casos pertenciam a um cluster. Nossos modelos de regressão polinomial mostraram que os isolados de Mtb pertencentes a família LAM e ao genótipo RDRio foram mais prováveis de estarem em clusters com 6-9 isolados (OR = 1,17, 95% IC 1,08 1,26; OR=1,25, 95% IC 1,14- 1,37; respectivamente) em relação aos outros grupos. Os pacientes com ≥10 isolados foram mais prováveis de pertencerem a família LAM e a família de RFLP ES14 (OR = 1,14, 95% IC 1,06 1,23; OR= 7,03, 95% IC 4,00 12,34, respectivamente). Segunda Parte: No período de 2000-2001, dentre os 329 isolados, 109 (33,2%) foram agrupados em 38 clusters enquanto, em 2011, dentre os 485 isolados de Mtb, 176 (36,2%) foram distribuídos em 39 clusters. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os períodos analisados em relação a formação de um cluster (p=0,35). A análise dos padrões gerados pelo RFLP IS 6110 identificou 8 clusters, ao quais estão mais envolvidos com transmissão recente na RMV. A correlação entre as duas técnicas de genotipagem mostrou em 2000-2001 uma concordância de 42,1%, e 42,5% em 2011. Conclusão: Esses resultados confirmam que a família LAM e o genótipo RDRio são mais encontrados em clusters com 6-9 isolados, e que a família de RFLP ES14 é o genótipo mais prevalente na RMV, sugerindo que a proporção de casos de TB em uma cidade pode ser causada por um pequeno número de genótipos circulantes dentro de uma região e que fatores relacionados ao patógeno devem ser melhor estudados para melhoria no controle da doença.
Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, técnicas de genotipagem, epidemiologia molecular, dinâmica de modificação do Mtb.
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Estudo de fatores relacionados ao controle da tuberculose: resistência às drogas, transmissão e suscetibilidade do hospedeiroFernandes, Marcilio Delan Baliza January 2007 (has links)
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Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Após ter sido considerada sob controle, a tuberculose ressurgiu na década de 90, sendo atualmente um sério problema de saúde pública envolvendo aspectos sociais e econômicos. Para entender os fatores envolvidos na transmissão e adoecimento pela tuberculose faz-se necessário compreender o tripé de sustentação da doença: ambiente, bacilo e hospedeiro. Em nosso trabalho avaliamos estes três aspectos importantes para a compreensão da epidemiologia da tuberculose em dois municípios da Região Metropolitana do Recife-PE. No município do Cabo de Santo Agostinho, caracterizamos o padrão de desenvolvimento de cepas resistentes e fatores associados. A freqüência de resistência primária e adquirida a qualquer droga foi 14% e 50% respectivamente enquanto que a freqüência primária e adquirida para multidroga resistência foi 8,3% e 40%. Tratamento prévio para tuberculose e abandono de tratamento consistiu em fatores de risco para resistência primária a drogas. A taxa de resistência primária e adquirida principalmente por infecção com linhagens resistentes a Isoniazida e Rifampicina é bastante alta dificultando o controle da transmissão da tuberculose no Cabo. Mapeamos a transmissão da tuberculose utilizando como ferramenta a genotipagem das cepas pelo spoligotyping. Um total de 40 padrões distintos foi observado. Destes, um padrão com nove isolados, três padrões com cinco isolados cada, outros três padrões com quatro isolados, dois padrões com três isolados, cinco padrões com dois isolados cada e vinte e seis padrões com um isolado. A análise da distribuição geográfica dos casos agrupados atendidos no Cabo comparados aos resultados de estudo prévios feito no Posto de Saúde Lessa de Andrade em Recife, que atende pacientes de todo o Estado de Pernambuco, mostrou que cepas agrupadas são encontradas em municípios vizinhos. No Município do Recife avaliamos o papel de marcadores genéticos (HLA)(...)
(...) do hospedeiro na predisposição para tuberculose em comunicantes de casos índices diagnosticados no Recife. Dos 257 indivíduos analisados, 54 eram agregados (sem parentesco com o caso Índice) e 203 tinham algum grau de parentesco com o caso índice. O risco relativo para desenvolver tuberculose foi de 1.22 (95%CI:0.75-1.99) para parentesco de primeiro grau, 1.13(95%CI:0.63-2.03) para parentesco de segundo grau e 1.11(95%CI:0.44-2.78) para parentesco de terceiro grau quando comparados com os contatos sem relação de parentesco. A análise da freqüência de alelos do HLA de classe II foi realizada em separado entre 77 indivíduos que haviam tido tuberculose e 119 indivíduos sem passado de tuberculose. Não encontramos qualquer alelo associado com suscetibilidade para adoecimento por tuberculose. Entretanto, o alelo DRB5*01 (OR= 0.45:; IC95%=0.20-0.98; p= 0.0441) aparece ligado à resistência para tuberculose e o alelo DRB3*02 (OR=0.59; IC95%=0.32-1.08; p=0.0905) mostra uma tendência de associação com resistência em desenvolver tuberculose. O conhecimento do perfil de resistência de cepas do M. tuberculosis e do seu poliformismo genético, bem como do hospedeiro em determinados grupos populacionais nos permite avaliar melhor os mecanismos de transmissão da doença contribuindo para o controle da tuberculose. / Tuberculosis resurged in the 90s after having been
considered to be under control and is now
a serious public health problem with social and eco
nomic ramifications. To understand the
factors involved in the transmission and the diseas
e, it is necessary to understand the three
fundamentals of the disease: the environment,
bacillus
and host. This work evaluates these
three important aspects of the epidemiology of tube
rculosis in two municipalities in the
metropolitan region of Recife-PE. In the town of Ca
bo de Santo Agostinho, we characterized
the pattern of the development of resistant strains
and their associated factors. The frequency
of primary and acquired resistance to any drug was
14% and 50%, respectively, while the
frequency of primary and acquired multidrug resista
nce was 8.3% and 40%, respectively.
Previous treatment for tuberculosis and abandonment
of treatment were risk factors for
primary resistance to drugs. Among persons with Iso
niazid- and Rifampicin-resistant strains,
the levels of primary and acquired resistance were
quite, making tuberculosis control in Cabo
quite difficult. The transmission pattern of tuberc
ulosis was defined by using by spoligotyping
to genotype strains. A total of 40 distinct pattern
s were observed: one pattern with 9 isolates,
three patterns with 5 isolates each, three other pa
tterns with 4 isolates, two patterns with 3
isolates, five patterns with 2 isolates each, and 2
6 patterns with 1 isolate alone. Geographical
analysis of cases residing in Cabo compared with th
ose evaluated at the post of Health in
Lessa de Andrade in Recife (a reference health serv
ice for greater Pernambuco) revealed that
both municipalities shared common isolates. In Reci
fe, the role of genetic markers (HLA) of
host predisposition to tuberculosis was evaluated a
mong persons who live in the same house
as index cases. Of the 257 subjects studied, 54 pe
rsons (reference cases) were not related to
the index case but shared their household. Among t
he 203 subjects related to the index case,
the relative risk for developing tuberculosis, depe
nding on degree of relationship, was 1.22
(95%CI :0.75-1 .99) for first-degree, 1.13 (95%CI :
0.63-2 .03) for second degree, and 1.11
(95%CI :0.44-2 .78) for third degree when compared
with the 54 afore-mentioned reference
cases. Frequency analysis of HLA class II alleles w
as conducted separately between the 77
individuals who had tuberculosis and the 119 indivi
duals with no history of tuberculosis. We
did not find any allele associated with susceptibil
ity to illness for tuberculosis. However, the
allele DRB5*01 (OR= 0.45; 95%CI= 0.20-0.98;
p
= 0.0441) appears linked to resistance to
tuberculosis and the allele DRB3*02 (OR= 0.59; 95%C
I= 0.32-1.08;
p
= 0.0905) shows a
trend of association with resistance to develop tub
erculosis. A more complete understanding
of
M. Tuberculosis
resistant strains and their genetic polymorphisms,
as well as the host
susceptibility in certain population groups, allow
us to better assess the mechanisms of
disease transmission and ultimately contribute to t
he control of tuberculosis.
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Mapeamento das condições necessárias para a incorporação da genotipagem RhDa partir do DNA fetal livre no plasma materno na rotina pré-natal de gestantes RhD-negativo acompanhadas no SUSCastilho, Shirley Lopes de January 2011 (has links)
Submitted by Luis Guilherme Macena (guilhermelg2004@gmail.com) on 2013-07-05T18:48:07Z
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Ensino. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e da Mulher. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O desconhecimento do grupo sanguíneo RhD fetal durante o período
gestacional faz com que gestantes RhD-negativo tenham o mesmo
acompanhamento pré-natal independente do feto ser RhD-positvo ou RhD-negativo. Assim, gestantes sem risco para o desenvolvimento de Doença
Hemolítica Perinatal (DHPN) são mantidas no pré-natal de alto risco
aumentando a taxa de ocupação destes serviços e dificultando a oferta para
aquelas que realmente necessitariam de assistência especializada. Um método
atual, não invasivo, a genotipagem RhDa partir do DNA fetal livre no plasma
materno permite o conhecimento do grupo sanguíneo fetal antes do
nascimento possibilitando excluir do pré-natal de alto risco gestantes com fetos
sem risco para a DHPN (fetos RhD-negativos).
Este estudo objetiva mapear o Fluxo da assistência pré-natal, em
especial de gestantes RhD-negativo, no Município do Rio de Janeiro visando
analisar a viabilidade da incorporação da genotipagem RhDa partir do DNA
fetal livre no plasma materno na rotina pré-natal de gestantes RhD-negativo
acompanhadas no SUS.
Esta análise foi realizada aplicando o método de Planejamento
Estratégico Situacional (PES) proposto por Carlos Matus. O método PES prevê
quatro momentos para o processamento dos problemas. O Momento
explicativo prevê o diagnóstico situacional, O momento normativo formula os
objetivos e o prazo para executá-los, o Momento estratégico analisa a
viabilidade dos planos e os atores envolvidos no processo e o momento
operacional estabelece a execução dos planos e a avaliação das mudanças.
Concluímos que a implantação da genotipagem RhDfetal utilizando o
DNA livre no plasma materno e a PCR em tempo real, no SUS, é factível. O
cenário atual é extremamente favorável. A preocupação das três esferas do
governo com a assistência integral à saúde materna e infantil promove um
leque de investimentos amplos neste segmento. A possível ação conjunta entre
o governo e as instituições públicas, com expertise em desenvolvimento de
métodos diagnóstico como Biomanguinhos, possibilitaria a implantação desta
tecnologia para diferentes segmentos da saúde pública no Brasil. / The lack of knowledge about the Rhblood group during the pregnancy
period make the D-negative pregnant women have the same prenatal follow-up
whether the fetal blood type isD positive or D-negative.
In this way, pregnant women without risk to develop Hemolytic Disease
of newborn (HDN) are kept in High Risk Prenatal Care increasing the
occupancy rate of the assistance servicesdecreasing the viability for who those
really need it. Nowadays a non-invasive method, the RHD genotyping using
free-fetal DNA from maternal plasma allows the fetal blood group knowledge
before the birth. This makes possible to exclude from High Risk Prenatal Care,
pregnant women with fetus without HDN risk. This study aims the
understanding of prenatal care flow of D-negative pregnant women in Rio de
Janeiro city trying to check the viability of the introduction of RHD genotyping
test using free-fetal DNA from maternal plasma in the D-negative pregnant
women in prenatal care public service. This analysiswas made using strategic-situational approach of CarlosMatus. There are four (4) moments of strategic
planning, according to Carlos Matus.The analytical moment describes the
stage of formulation of initial situation (diagnosis), the Normative Moment
designs the aims and defines the strategy of action. The Strategic Moment
analyzes the actors enrolled in the process and the viability of plans. The
Operational Moment establishes the execution of plans and evaluates the
changes.
In conclusion, the introduction of RHD genotyping test in free-fetal DNA
from maternal plasma using real-time PCR, in public services, is factual.
Brazil’s Health Ministry is working on improving the public health system.
The government issues about full assistance to women and children promote
wide investments in this heath area.
Actions joining both government and public institutions with expertise as
Biomanguinhos would make possible the development of different diagnoses
methods in health care in Brazil.
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Diferenciação entre soroconversão recente e de longo termo na infecção pelo HIV-1 implicações nos estudos sobre dinâmica da epidemia, diversidade viral, vigilância da resistência aos antirretrovirais e patogêneseCastro, Carlos Augusto Velasco de January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diferenciação sorológica entre casos incidentes e prevalentes de infecção pelo HIV tem sido descrita como uma importante ferramenta para subsidiar a análise das tendências da epidemia de HIV/AIDS. Considerando a importância de tal abordagem para avaliar eventuais tendências na diversidade viral, na resistência primária aos antirretrovirais nas infecções recentes e no monitoramento de grupos em risco, avaliamos indivíduos que buscaram a testagem para o HIV de novembro de 2004 a dezembro de 2008 em CTAs localizados em 4 cidades do estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias e São Gonçalo). As amostras soropositivas foram testadas para a diferenciação entre infecções recentes e de longo termo utilizando-se o teste BED-CEIA. Um subconjunto destas também foi avaliado pelo método de indice de avidez (IA) e por marcadores imunológicos - linfócitos TCD4+ e/ou \03B22 microglobulina, a fim de propor um algoritmo com maior especificidade para a detecção de amostras de indivíduos recém infectados pelo HIV-1. Amostras de soroconvertidos recentes (SR) e um subconjunto dos soroconvertidos de longo termo (SLT) foram selecionados para os protocolos de biologia molecular, sendo sequenciado um fragmento do gene pol da região que codifica a protease e a transcriptase reversa
Nossos resultados destacam que os HSH continuam a ser uma população altamente vulnerável, tendo prevalência até onze vezes maior que os homens heterosexuais entre os SR. A aplicação de uma zona cinzenta e a avaliação do estado imune contribuiram para uma redução significativa da presença de amostras indeterminadas quando os testes BED-CEIA e de IA foram aplicados, sendo o de IA mais específico. Embora não tenha sido observado tendência de mudança importante no padrão de subtipos de HIV-1 quando comparou-se RS e LTS no primeiro ano, ao longo do estudo revelou-se um incremento da proporção de amostras recombinantes, bem como uma crescente proporção de amostras relacionadas com CRFs em comparação com URFs, o que alinha-se com dados recentes publicados pela OMS-UNAIDS. Em nosso estudo esta tendência se deveu ao aumento entre os homens, sendo este aumento mais pronunciado entre os heterossexuais do que entre os HSH. Entre estes genomas recombinantes foi encontrado pela primeira vez no Rio de Janeiro amostras relacionados ao subtipo K, assim como uma detecção crescente de amostras com recombinação envolvendo os subtipos A e G entre os indivíduos caracterizados como recém infectados. Nossos dados revelam que os níveis de resistência primária aos antirretrovirais permaneceram relativamente estáveis ao longo do tempo, mas em um patamar preocupante. Entre os HSH a taxa de resistência foi o dobro da registrada em homens heterosexuais, o que sugere uma distribuição desigual em relação a resistência primária em determinados subgrupos. Novos estudos devam ser realizados com foco em populações específicas de forma a contribuir para o monitoramento da dinâmica da epidemia nas mesmas / The serological differentiation between incident an
d prevalent cases of HIV
infection has been described as an important tool t
o detect trends in HIV/AIDS.
Considering the importance of such approach to asse
ss possible trends in viral diversity
and primary resistance to antiretroviral drugs in r
ecent infections and monitoring of
groups at risk, we evaluate individuals who sought
testing for HIV from November 2004
to November 2008 in VCTs located in four cities in
the state of Rio de Janeiro (Rio de
Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias and Sao Gonca
lo).
The seropositive samples were tested to differentia
te between recent and long<
term infections using the BED<CEIA test and a subse
t was also evaluated by the avidity
test (AI) and immunological markers, lymphocytes TC
D4
+
and/or β2 microglobulin,
aiming to propose an algorithm with more specificit
y for the detection of individuals
newly infected with HIV<1. Samples of recent seroco
nverted (SR) and a subset of long<
term seroconverted (LTS) were selected for molecula
r protocols, where sequences were
obtained from the fragment of the
pol
gene region which encodes the protease and
reverse transcriptase.
Our results highlight that MSM continue to be a hig
hly vulnerable population, with
prevalence up to eleven times higher than among het
erosexual men between the RS
samples. In fact, prevention interventions focused
on this group should be continuously
implemented. The application of a gray zone area an
d the evaluation of the immune
status contributed to a significant reduction in th
e presence of indeterminate samples
when both BED<CEIA and AI tests were applied, and t
he AI showed to be more specific
than the BED<CEIA. Although no trend has been obser
ved in the pattern of HIV<1
subtypes when RS and LTS in the first year were com
pared, an increase in the
proportion of recombinant samples as well as an inc
reasing proportion of samples
related to CRF compared with URFs < which aligns wi
th recent data published by WHO<
UNAIDS< were detected throughout the study. In ou
r study this trend was due to the
increase among men, and even more pronounced among
heterosexual men than among
MSM. Among the recombinant genomes, samples relate
d to subtype K, were found for
the first time in Rio de Janeiro and a growing prop
ortion of samples with recombination
involving subtypes A and G among individuals charac
terized as newly infected was
detected. Overall levels of primary resistance to a
ntiretroviral drugs are a matter of
concern, although remained relatively stable over t
ime. Among MSM, the resistance rate
was twice as high as among heterosexual men, sugges
ting an uneven distribution in
relation to primary resistance in certain groups. F
urther studies should be implemented
in order to monitor the dynamics of the epidemic in
key populations
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Otimização de protocolos de testes moleculares para detecção e quantificação do vírus da Hepatite C em sangue coletado em papel de filtroMarques, Brunna Lemos Crespo January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação
Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C / The
d
iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic
al
markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample
collection
requires
trained personnel
what
it is difficult in remote areas or
prese
nting
few resources. The aim of this study
was to
optimize
protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in
dried
blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For
this, 99 indiv
iduals provided paired serum and DBS
samples
,
where
59
of them
were anti
-
HCV
rea
ctive
and 40 were non
-
reactive in their serum samples.
A
nti
-
HCV positive samples were subjected
to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT
-
P
CR (RT
-
qPCR) in
house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV
primers and probe designed for the 5'
non coding (
NC
)
region of HCV. For optimization
of these
technique
s
, the concentration of cDNA, reverse tr
anscriptase and numbers of cycles of reaction were
evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The
sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT
-
PCR
were also
determined.
Q
IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for
HCV RNA
extraction
among
DBS
samples
. The
in house
RT
-
qPCR was able to quantify HCV
among 44
serum samples
where the median viral load was lower than that observed in commercial technique (
4.94
log
10
and
6
log
10
copies of HCV / mL, respectively). The range of
HCV
detection
using
in house
RT
-
qPCR
was 10
-
10
9
copies of HCV per reaction. For
HCV
detection in DBS
, it
was necessary to increase reverse
transcriptase and cDNA
concentration giving
35
HCV RNA reactive
samples with a limit of detection
equal to 58.5 copies
of HCV
/ m
L
and the median viral load was similar to that observed in their sera
evaluated by commercial technique (5.38 log
10
and 5.89 log
10
copies of HCV / mL, respectively).
In
hous
e
RT
-
qPCR
presented
good reproducibility
using
standard curve and
paired DBS and sera
samples
. It was not observed
the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal
control.
In house
RT
-
qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8
5.0) in serum and 59.3%
(95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens
compared to the
commercial methodology
. When the RT
-
qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity
of the technique in DBS was equal to 65.
9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty
-
five serum samples
and 15
DBS
samples
were amplified in qualitative RT
-
PCR, where 43 serum
samples and
11
DBS
samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as
HCV
subgenotype 1b
,
1
3
as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among
DBS
samples,
9
were
9
classified as
HCV
subgenotype 1b and
2
as
HCV
subgenotype 1a.
HCV nucleotide sequences
presented
high homology between paired
DBS and sera
samples
and
all
of them
were classified as
geno
type 1.
It is
conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and
phylogenetic analysis of HCV and
it
is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C
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Desenvolvimento e padronização de uma reação de PCR multiplex para a genotipagem de protozoários patogênicosPereira, Elisa Cavalcante January 2015 (has links)
Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-09-20T14:28:59Z
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71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2
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71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2
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71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs), como a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo. Apesar do impacto causado por estas doenças, as mesmas continuam sendo pouco estudadas. O reino Protista, ao qual os agentes etiológicos dessas doenças pertencem, incluem espécies de importância veterinária que causam muitas perdas para a indústria pecuária. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas para o estudo de protozoários parasitos. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como loci para genotipagem desses protozoários, de modo a obter uma melhor caracterização interespecífica. Neste estudo, foram utilizadas técnicas de PCR singleplex e multiplex para a genotipagem de 16 espécies de protozoários de três diferentes gêneros: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (classe Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (filo Apicomplexa). Como metodologia de biologia molecular foram utilizados PCR e sequenciamento, bem como em bioinformática, onde foi utilizado filogenia molecular. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares de iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Além disso, os seguintes parasitos de importância para a saúde pública: T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. Vivax, foram utilizados neste trabalho
A partir dos 39 pares de iniciadores, 9 pares foram selecionados compreendendo 7 loci para o presente estudo: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seril-tRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Os testes a partir de diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma spp., Leishmania spp. e Plasmodium spp., onde mostraram uma sensibilidade de até 1 pg/\03BCL de DNA (para o locus Leucyl-tRNA synthetase em Trypanosoma e Leishmania). A reação inicial de PCR singleplex padronizada foi eficiente para todos os loci, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, a qual foi utilizada um conjunto de iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multilocus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania spp. e Trypanosoma spp. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem-sucedida, e pode-se destacar após a observação de conjunto de resultados que o melhor locus em termos de especificidade, sensibilidade e fidelidade aos dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises / According to the World Health Organization (WHO), Neglected Tropical Diseases (NTDs), examples being Chagas disease, African trypanosomiasis, among others, affect about 1 billion people in the world. However, they are little studied, despite its great impact on health. Also, they include species of veterinary importance that cause great harm to the livestock industry. The kingdom Protista, containing etiological agents of NTDs, they include species of veterinary importance and that cause great harm to the livestock industry. With advances in molecular genetics, techniques such as genotyping are being used increasingly used for the study of parasitic protozoans. Orthologous genes conserved in protozoa can be used as loci for genotyping, in order to obtain a better interspecific characterization. In this study, we used singleplex and multiplex PCR techniques for genotyping of 16 species of three different genus of protozoans: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (class Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (phylum Apicomplexa). As molecular biology methods were used PCR and sequencing of PCR fragments, as well as bioinformatics, using molecular phylogeny. For this purpose, were designed 39 degenerated primers for species of 2 groups: phylum Apicomplexa and class Kinetoplastea, then, the PCR reactions were performed with the aim of standardizing multiplex PCR reactions. Moreover, parasites of importance to public health such as Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum and P. vivax were used in this study
Based on the 39 pairs of primers, 9 pairs were selected comprising 7 loci for this study: methionyl-tRNA synthetase, leucyl-tRNA synthetase, seryl-tRNA synthetase, subunit U5 snRNP the spliceosome, mismatch repair ATPase, triosephosphate isomerase, and GTP- binding protein. The tests from serial dilutions of DNA from Trypanosoma spp., Leishmania spp. and Plasmodium spp., which showed a sensitivity of up to 1 pg/\03BCL DNA (for Leucyl-tRNA synthetase locus on Trypanosoma and Leishmania). The initial standardized singleplex PCR reaction was efficient for all loci, which resulted in the design of multiplex PCR reaction, where the best result was the number 5 reaction which was used a set of primers of the GTP-binding protein genes, U5 snRNP spliceosome subunit and Leucyl-tRNA synthetase, which when integrated allowed genotyping trypanosomatides multilocus of the genus Leishmania spp. and Trypanosoma spp. The methodology used for genotyping of these parasite species was successful, and can highlight after observation of the result set that the best locus in terms of specificity, sensitivity and fidelity to data found in literature, was LeucyltRNA synthetase, which showed satisfactory results in all analyzes
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Estudo da prevalência dos genótipos e mutações de resistência associadas aos antivirais em pacientes com hepatite B crônica atendidos nos serviços de referência do Estado do Ceará / Study of the prevalence of genotypes and resistance mutations associated with antiviral drugs in patients with chronic hepatitis B treated in reference services of Ceara stateCruz, José Napoleão Monte da 25 September 2015 (has links)
CRUZ, J. N. M. C. Estudo da prevalência dos genótipos e mutações de resistência associadas aos antivirais em pacientes com hepatite B crônica atendidos nos serviços de referência do Estado do Ceará. 2015. 86 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T13:45:09Z
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Previous issue date: 2015-09-25 / Infection with hepatitis B virus (VHB) is a serious public health problem. An estimated 450 million chronic carriers worldwide, where at least 600,000 people die annually from diseases related to hepatitis B. Viral load, HBe seroconversion-antiHBe, and specific genotype and viral mutations are acquired factors influence the progression of the disease. The aim of this study was to investigate the prevalence of VHB resistance mutations associated with antiviral and evaluate the genotype distribution in a sample of 142 patients with chronic hepatitis B, treated in the State of Ceará referral hospitals. Patients were considered reactive serum HBsAg for at least six months. Serological tests were performed by electrochemiluminescence (EQL), ABBOTT laboratory for HBsAg, HBeAg and anti-HBe. The results of the serological screening showed that all samples: 142 (100%) were reactive serum HBsAg (IgG), 87 (61.0%) were negative to serum and serum HBeAg to anti-HBe reagent, 55 (39, 0%) are seroreactive for HBe and serum non-reactive for anti-HBe. The quantitation of viremia (viral load) was performed by real time PCR (QPCR) in LACEN-EC. The viral load varied between the limits (2067 IU / ml to 3.41 billion IU / ml), with a median of 70 403 IU / ml. Eighty-eight (62%) of all samples were submitted to analysis of mutations associated with treatment and genotyping the Hepatitis laboratory of the FIOCRUZ-RJ, screened for sequencing as quality criteria and routine laboratory biosafety this. The identification of genotypes in the population studied showed the following distribution: F: 47 (53.4%) of A: 34 (38.6%), the D: 4 (4.6%), E: 2 ( 2.3%) and G 1 (1.1%). And the following mutations were detected: L180M (n = 10 / 9.9%), M204V (n = 8 / 7.9%), M204I (n = 4/4%), G173L (n = 1/1%) , T169L (n = 1/1%), T184I (n = 1/1%), L80V (n = 1/1%) while 74.3% showed no change. In the study it was observed that the F genotype (53.4%) was the most prevalent in the research population of Indian origin, followed by genotype (38.6%) due to migration of African slaves. And, the higher frequency of the detected mutations are associated with nucleoside inhibitors and nucleotides, especially lamivudine. / A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um grave problema de saúde pública. Estimam-se em 450 milhões os portadores crônicos no mundo, em que pelo menos 600 mil pessoas morrem anualmente por doenças relacionadas com o vírus da hepatite B. A carga viral, soroconversão HBe – anti-HBe, genótipo e mutações virais específicas e adquiridas são fatores que influenciam a progressão dessa doença. O objetivo do presente estudo foi investigar a prevalência de mutações de resistência do VHB associada aos antivirais e avaliar a distribuição genotípica numa amostragem de 142 pacientes com hepatite B crônica, atendidos nos hospitais de referência do Estado do Ceará. Foram realizadas sorologias por eletroquimioluminescência (EQL), laboratório ABBOTT para HBsAg, HBeAg e anti-HBe. O resultado da triagem sorológica no total das amostras mostrou que: 142 (100%) foram sororeagentes para HBsAg (IgG), 87(61,0%) foram soro não reagentes para HBeAg e soro reagentes para anti-HBe, 55(39,0%) são soros reagentes para HBe e soro não reagente para anti-HBe. A quantificação da viremia (carga viral) foi realizada por PCR em tempo real (QPCR), no LACEN-CE. A carga viral variou entre os limites de (2.067 UI/mL a 3.410.000.000 UI/mL), com mediana de 70.403 UI/mL. Oitenta e oito (62%) do total das amostras foram submetidas à pesquisa de mutações associadas ao tratamento e genotipagem no laboratório de hepatites da FIOCRUZ-RJ, triadas para sequenciamento conforme critérios de qualidade e biossegurança de rotina desse laboratório. A identificação dos genótipos na população estudada apresentou a seguinte distribuição: F: 47 (53,4%), A: 34 (38,6%), D: 4(4,6%), E: 2(2,3%) e genótipo G: 1(1,1%). E as seguintes mutações foram detectadas: L180M (n=10 / 9,9%), M204V (n=8 / 7,9%), M204I (n=4 / 4%), G173L (n=1 / 1%), T169L (n=1 / 1%), T184I (n=1 / 1%), L80V (n=1 / 1%) enquanto que 74,3% não apresentaram mutações. No estudo foi observado que o genótipo F(53,4%) foi o mais prevalente na população pesquisada de origem indígena, seguido do genótipo A (38,6%) devido à migração de escravos africanos. E, que a maior frequência das mutações detectadas está associada a inibidores de nucleosídeos e nucleotídeos, principalmente a lamivudina.
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Epidemiologia molecular e caracterização da resistência e virulência de amostras de Staphylococcus aureus provenientes de hospitais da Grande Vitória-ESBride, Lais de Lima 27 April 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-04-27 / CAPES / Epidemiologia Molecular e Caracterização da Resistência e Virulência de Amostras de Staphylococcus aureus Provenientes de Hospitais da Grande Vitória - ES.
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Infecções simples e múltiplas por HPV em mulheres brasileiras de diferentes faixas etárias com lesões cervicais escamosas ou glandulares = Single and multiple HPV infections in Brazilian women of different age strata with squamous or glandular cervical lesions / Single and multiple HPV infections in Brazilian women of different age strata with squamous or glandular cervical lesionsResende, Leandro Santos de Araújo, 1980- 10 January 2013 (has links)
Orientadores: Sophie Françoise Mauricette Derchain, Silvia Helena Rabelo dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:29:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Resende_LeandroSantosdeAraujo_M.pdf: 1302928 bytes, checksum: f506f4299bc449aaf95e8a2b34d89201 (MD5)
Previous issue date: 2013 / Resumo: Introdução: O câncer do colo uterino é o terceiro tipo mais prevalente no mundo e representa a quarta causa de morte por câncer entre as mulheres. No Brasil, estima-se que 17,540 mulheres foram diagnosticadas com essa neoplasia no ano de 2012. A infecção persistente pelo Papillomavirus humano (HPV) de alto risco (hr-HPV) e é considerada fator causal e necessário para lesões precursoras e câncer invasor. Já foram identificados mais de 100 tipos de HPVs. Os HPVs 16 e 18 são reconhecidos, no mundo, como os maiores responsáveis pelo desenvolvimento dessa doença. Objetivos: Descrever a prevalência e a distribuição, por idade, de infecções simples e múltiplas por diferentes tipos de HPV em mulheres com lesões cervicais escamosas e glandulares. Sujeitos e métodos: 328 mulheres com lesões escamosas, ou glandulares intraepiteliais ou invasoras do colo uterino. Todas as amostras foram submetidas à genotipagem por hibridização reversa com sondas de 21 tipos de HPV de alto risco (hr-HPV) e 16 tipos de HPV de baixo risco (lr-HPV). A prevalência de infecções simples e múltiplas pelo HPV foi comparada de acordo com as faixas etárias. Resultados: 287 (87%) mulheres apresentaram infecção por pelo menos um tipo de HPV e 149 (52%) tinham infecção múltipla. O HPV16 foi o tipo de vírus mais prevalente na amostra, detectado em 142 casos (49% de todos os casos positivos para HPV), seguido dos outros tipos de HPV do grupo alfa-9: HPVs 58, 52, 31, 35 e 33. Infecção simples ou múltipla pelo HPV18 foi positiva em 23 casos (8% dos casos de infecção por HPV de alto risco). Praticamente todas as lesões glandulares foram associadas à infecção simples por HPVs 16 e 18. Infecções múltiplas foram, significativamente, mais prevalentes nas lesões escamosas do que nas glandulares pelos HPVs 16 e 18 (P=0,04 e 0,03, respectivamente). A prevalência de infecções múltiplas seguiu um modelo de distribuição bimodal, com pico em mulheres com menos de 29 anos e naquelas com idade entre 50 e 59 anos. Conclusão: Esta amostra sugere que a estratégia para prevenção de lesões pré-invasivas e invasivas, escamosas ou glandulares, deve ser direcionada para o HPV16 e alguns tipos virais do grupo alfa-9. Ficou claro, na amostra deste estudo, que em mulheres jovens, a prevenção de infecção pelo HPV deve cobrir os HPVs 16 e 18, principalmente / Abstract: Background: Cervical cancer ranks third in prevalence and fourth as cause of death in women worldwide. In Brazil, 17,540 women were diagnosed in 2012 with the disease. Persistent infection with high-risk HPV types is a necessary condition for the development of pre-invasive and invasive cervical neoplasia. Currently, over 100 HPV types have been identified, but HPV16 and 18 are recognized as the mayor culprits in cervical carcinogenesis. Objectives: to assess the relationships between single- (ST) and multiple-type (MT) HPV infection with patients' age and lesion pathological status. Materials and Methods: 328 patients with either squamous or glandular intraepithelial or invasive cervical lesion were selected. All subjects were tested for HPV genotypes with reverse hybridization for 21 high- (hr-HPV) and 16 low-risk (lr-HPV) probes. Prevalence of ST and MT HPV infections was compared across and age strata. Results: 287 (87%) women had at least one HPV type detected and 149 (52%) had MT infections. The most prevalent HPV type was HPV16, present in 142 cases (49% of all HPV-positive cases), followed by the alpha-9 group HPV58, 52, 31, 35 and 33, all of them from alpha-9 HPV group. ST or MT HPV18, single or in multiple infections occurred in 23 cases (8% of hr-HPV cases). Almost all glandular lesions were associated with HPV16 and 18 alone. Multiple infections were significantly more prevalent in squamous than in glandular lesion for HPV16 and 18 (P=0.04 and 0.03 respectively). The prevalence of MT infections followed a bimodal distribution; peaking in women younger 29 years and in those aged 50 to 59. Conclusions: our data indicate that prevention strategies for pre-invasive and invasive squamous lesions should be focused on HPV16 and a few alpha-9 HPV types. It is clear to us that in young women, prophylaxis must cover a large amalgam of HPV types beyond classic HPV16 and 18 / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestre em Ciências da Saúde
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