El objetivo de esta Tesis Doctoral fue la formación por vía electroquímica y caracterización de interfases modificadas, con propiedades catalíticas, en este caso para la reacción de electrorreducción de iones nitrato. Los sistemas estudiados fueron Au/Sn, Au/Pd y Au/Sn-Pd los cuales fueron constituidos, en su forma final, como estructuras microcristalinas soportadas sobre carbono vítreo. Para ello se emplearon técnicas electroquímicas convencionales, y técnicas de caracterización superficial, tales como microscopía STM y AFM in-situ, microscopía SEM, DRX, EDX, XPS y AES. Inicialmente se analizó la formación de estructuras bidimensionales y tridimensionales de Sn y Pd por deposición espontánea, a subpotencial (UPD) y a sobrepotencial (OPD) sobre monocristales de Au(hkl), con (hkl) = (111) y (100). Estos sistemas pueden considerarse como modelos para los catalizadores soportados. Los procesos de deposición espontánea y a subpotencial de Sn ocurren con nucleación de islas bidimensionales sobre las terrazas planas y en bordes de escalón. A bajos subpotenciales y en ambos sustratos, se detectó la formación de aleación superficial. En el caso del Pd, los resultados indican una adsorción inicial de iones [PdCl4]2�� que actúan como precursores de la reducción posterior a Pd metálico, tanto en el caso del UPD, como en la deposición por el método de inmersión. Sobre las superficies modificadas Au(hkl)/Sn o Au(hkl)/Pd se logró la deposición de Pd ó Sn, respectivamente, por el método de inmersión y UPD. A los efectos de constituir el sistema soportado sobre el sustrato carbonoso, se analizó el proceso de nucleación y crecimiento de Au sobre CV y HOPG concluyendo, que en ambos casos, sigue un mecanismo de nucleación 3D controlado por difusión. Se caracterizaron los sitios de nucleación y la distribución de tamaños de los microcristales formados. Posteriormente se conformaron los sistemas bimetálicos o trimetálicos CV/Au/Sn, CV/Au/Pd y CV/Au/Sn-Pd por deposición secuencial de Pd y Sn sobre las superficies modificadas CV/Au, tanto por el método de inmersión como por UPD. Los cristalitos de Au presentes sobre el sustrato carbonoso constituyen sitios activos para la deposición espontánea o para la adsorción en zona de subpotencial, tanto del Pd como del Sn. Por último, fue analizado cualitativamente el efecto electrocatalítico de estas estructuras para la reacción de reducción de iones nitrato, evidenciándose un efecto sinérgico entre el Pd y el Sn en el caso de las heteroestructuras Au(hkl)/Pd-Sn y CV/Au/Pd-Sn. / The aim of this Doctoral Thesis was the formation, by electrochemical means, and characterization of modified interphases with electrocatalytic properties, in this case, for the electroreduction reaction of nitrate ions. The studied systems were Au/Sn, Au/Pd y Au/Sn-Pd, which were constituted in their final form, as microcrystalline structures supported on vitreous carbon. For this purpose, conventional electrochemical techniques, and surface characterization techniques such as in-situ STM and AFM, SEM, XRD, EDX, XPS and AES were applied. Initially, the formation of two-dimensional and three-dimensional structures of Sn and Pd by spontaneous deposition, electrochemical underpotential deposition (UPD) and overpotential deposition (OPD) onto Au(hkl) single crystals, with (hkl) = (111) and (100), were analysed, These systems can be considered as models for the supported catalysts. The spontaneous deposition and the UPD processes of Sn occur with nucleation of twodimensional islands on the flat terraces and on step edges. At low underpotentials and on both substrates, the formation of a surface alloy was detected. In the case of Pd, the results show in the UPD process as well as in the spontaneous deposition process, initial adsorption of [PdCl4]2�� ions which act as precursors for the subsequent reduction to metallic Pd. Onto the Au(hkl)/Sn and Au(hkl)/Pd modified surfaces, Pd or Sn were deposited respectively, by the immersion method and UPD. For the purpose of constituting the system supported on the carbon substrate, the nucleation and growth process of Au on CV and HOPG was analysed, and it was concluded that, in both cases, it followed a three-dimensional nucleation mechanismus controlled by diffusion. The nucleation sites and the size distribution of the formed microcrystals were characterized. Subsequently, the bimetallic and three-metallic systems CV/Au/Sn, CV/Au//Pd y CV/Au/Sn-Pd were conformed by sequential deposition of Pd and Sn on the CV/Au modified surfaces, by both the immersion method and the UPD. The Au crystallites present on the carbon substrate constitute active sites for the Pd and Sn spontaneous deposition or adsorption in the UPD range. Finally, the electrocatalytic behavior of these structures was qualitatively studied for the nitrate ions reduction reaction, showing a synergistic effect between Pd and Sn in the case of Au(hkl)/Pd-Sn and CV/Au/Pd-Sn heterostructures.

Trabajo financiado por la DGES del Ministerio de Educación y Cultura (MEC) (proyectos PB97-0133 y BQU 2001-0538) y por la Generalitat Valenciana (GV99-31-1-02)

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Tese de doutoramento. Engenharia Química. 2005. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto

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A redução polarográfica de ácido azotídrico, HN3, se da com formação de NH+4 como produto principal, com outras reações secundárias. Ocorre em potencias mais anódico que a descarga de hidrogênio em tampões de ácido acético e acetato. A presença de cobalto(II) em tampões de N-3/HN>sub>3 leva à antecipação da descarga do HN3, com aumento no rendimento de NH+4. Fizeram-se numerosos estudos dos diversos fatores, usando-se coulometria galvamostática e potenciostática, para que se pudessem analisar os produtos da reação de eletrodo. Cobalto(I) é o intermediário que reage rapidamente com HN3, dando origem à primeira onda catalítica. A segunda onda está associada com a modificação da velocidade de reação de eletrodo do HN3, como principal fator. A cinética da reação do cobalto(II) foi estudada, obtendo-se a seguinte constante de velocidade para o processo catódico global, em azoteto 0,40 M: k0 = 9,9 x 10-7 cm-1 seg-1 Níquel(II) dá duas ondas catalíticas a primeira de pequena intensidade, ocorre justamente com a descarga de níquel(II). A segunda onda ocorre em potenciais mais negativos e tem como causa a formação de nucleos ativos que aceleram a reação de eletrodo à semelhança com os metais do grupo da platina. / The polarographic reduction of hydrazoic acid, HN3, occurs with the formation of NH+4 cations as the main product, with others side reactions. This reduction takes place at more anodic potentials than the hydrogen discharge from acetate/acetic acid buffers mixtures. The presence of cobalt(II) in N-3/HN3 buffers solutions cause the antecipation of HN3 reductions, with increase in the NH+4 yield. A number of factors has been studied, by use of galvanostatic and potentiostatic coulometry, as auxiliary tools, in order to analyse the products from electrode reactions. Cobalt(I) is the intermediate which fastly reacts with HN3 giving rise to the first catalytic wave. The second one is joined with change of the reaction rate of HN3 at mercury electrode, as the main factor. The kinetics of electrode reduction of cobalt(II) was studied and the following rate constant for the overall cathodic process in sodium azide 0,40 M, was determined: k0 = 9,9 x 10-7 cm-1 seg-1. Nickel(II) gives two catalytic Wawes. The first one occurs together with the niekel discharge and is of low intensity. The second catalytic wave occurs at more negative potentials and is based upon the formation of active nuclei at the mercury surface wich acelerate.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å and 1.6 Å resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å and 1.6 Å resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 Å, 2.0 Å, 2.03 Å, 2.0 Å, 1.85 Å, 1.4 Å e 1.6 Å respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

A redução polarográfica de ácido azotídrico, HN3, se da com formação de NH+4 como produto principal, com outras reações secundárias. Ocorre em potencias mais anódico que a descarga de hidrogênio em tampões de ácido acético e acetato. A presença de cobalto(II) em tampões de N-3/HN>sub>3 leva à antecipação da descarga do HN3, com aumento no rendimento de NH+4. Fizeram-se numerosos estudos dos diversos fatores, usando-se coulometria galvamostática e potenciostática, para que se pudessem analisar os produtos da reação de eletrodo. Cobalto(I) é o intermediário que reage rapidamente com HN3, dando origem à primeira onda catalítica. A segunda onda está associada com a modificação da velocidade de reação de eletrodo do HN3, como principal fator. A cinética da reação do cobalto(II) foi estudada, obtendo-se a seguinte constante de velocidade para o processo catódico global, em azoteto 0,40 M: k0 = 9,9 x 10-7 cm-1 seg-1 Níquel(II) dá duas ondas catalíticas a primeira de pequena intensidade, ocorre justamente com a descarga de níquel(II). A segunda onda ocorre em potenciais mais negativos e tem como causa a formação de nucleos ativos que aceleram a reação de eletrodo à semelhança com os metais do grupo da platina. / The polarographic reduction of hydrazoic acid, HN3, occurs with the formation of NH+4 cations as the main product, with others side reactions. This reduction takes place at more anodic potentials than the hydrogen discharge from acetate/acetic acid buffers mixtures. The presence of cobalt(II) in N-3/HN3 buffers solutions cause the antecipation of HN3 reductions, with increase in the NH+4 yield. A number of factors has been studied, by use of galvanostatic and potentiostatic coulometry, as auxiliary tools, in order to analyse the products from electrode reactions. Cobalt(I) is the intermediate which fastly reacts with HN3 giving rise to the first catalytic wave. The second one is joined with change of the reaction rate of HN3 at mercury electrode, as the main factor. The kinetics of electrode reduction of cobalt(II) was studied and the following rate constant for the overall cathodic process in sodium azide 0,40 M, was determined: k0 = 9,9 x 10-7 cm-1 seg-1. Nickel(II) gives two catalytic Wawes. The first one occurs together with the niekel discharge and is of low intensity. The second catalytic wave occurs at more negative potentials and is based upon the formation of active nuclei at the mercury surface wich acelerate.

Neste trabalho, foram realizados estudos sobre a modelagem e simulação do núcleo morto em partículas catalíticas contendo enzimas imobilizadas. Tais estudos envolveram a resolução de problemas de valor de contorno gerados pela modelagem dos fenômenos de difusão-reação no interior da partícula. Os principais parâmetros que determinam a ocorrência do núcleo morto foram investigados e os perfis de concentração de substrato e produto, bem como a posição do núcleo morto para a cinética de Michaelis-Menten e outras, foram calculados para catalisadores com geometrias clássicas de placa plana infinita, cilindro infinito e esfera. Para este fim, os seguintes métodos numéricos foram utilizados: shooting, colocação ortogonal global e colocação ortogonal em elementos finitos. Entre os métodos avaliados, o método da colocação ortogonal em elementos finitos foi o único capaz de representar os perfis de concentração de substrato e de produto, e os valores do fator de efetividade obtidos com as soluções analíticas para cinéticas de ordem zero e de primeira ordem, as quais foram usadas como referência. Assim, este método foi empregado para resolver os problemas de valor de contorno envolvendo as cinéticas de Michaelis-Menten e aquelas com inibição competitiva, não competitiva e acompetitiva por produto, e com inibição acompetitiva por substrato, sendo os resultados obtidos consistentes para todas as cinéticas analisadas. A metodologia proposta foi então usada para estudos de projeto e operação de reatores enzimáticos contínuos de mistura perfeita e de fluxo pistonado, sendo que os resultados obtidos foram coerentes. Assim, a metodologia apresentada neste trabalho pode ser avaliada em condições reais de projeto e operação de reatores enzimáticos heterogêneos contínuos. / This work dealt with studies on the modeling and simulation of the dead core in porous catalytic particles containing immobilized enzymes. Such studies involved the solution of boundaryvalue problems generated by the modeling of the diffusion-reaction phenomena inside the particle. The main parameters that determine the occurrence of dead core were investigated and the concentration profiles of substrate and product, as well as the position of the dead core for Michaelis-Menten\'s and other kinetics in catalysts with classical geometries of infinite slab, infinite cylinder and sphere were calculated. For this purpose, the following numerical methods were used: shooting, global-orthogonal-collocation and orthogonal-collocation in finite elements. Among these methods, only the orthogonal-collocation in finite elements simulated all substrate and product-concentration profiles and the effectiveness-factor values obtained with the analytical solutions for zero and first-order kinetics, which were used as reference. Therefore, this method was employed to solve the problems including the Michaelis-Menten kinetics, the competitive-, non-competitive- and acompetitive-product-inhibition kinetics, and the acompetitive-substrate-inhibition kinetics. The results obtained for all kinetics analyzed were consistent. Thus, the proposed methodology was used for studies on the design and operation of both continuous-stirred-tank and plug-flow reactors, and the results obtained were coherent. Thus, the methodology presented in this work can be evaluated under real conditions of design and operation of continuous heterogeneous enzymatic reactors.