Diss. Linköping : Univ., 2003.

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Abstract In mammalian cells the pH gradient between the organelles, cytoplasm and extracellular space is strictly regulated. Maintenance of pH homeostasis is crucial for the normal function of the cell and its organelles. In solid tumours, cells often suffer from hypoxia, deprivation of nutrients and acidic extracellular milieu as a result of inadequate vascularisation. Cancer cells are also known to suffer from other pH abnormalities. Defective acidification of intracellular organelles as well as a reversed pH gradient across the plasma membrane have been detected in numerous tumour tissues and cells. Aberrant secretion of lysosomal hydrolases, loss of cell polarity and increased expression of tumour-specific proteins are common phenotypic changes of cancer cells. In this study, secretion of cathepsin D, a lysosomal aspartic hydrolase, was shown to result from the acidification defect of cancer cells. In normal cells cathepsin D is sorted in the Golgi complex by mannose-6-phosphate receptors and transported via endosomes to lysosomes. In breast and colorectal cancer cells having abnormally neutral endosomes receptors were shown to accumulate in endosomes resulting in the aberrant secretion of newly synthesised cathepsin D from the cells. Carcinoembryonic antigen (CEA) is an oncofetal protein widely used as a tumour follow-up marker. It is normally expressed at low levels and is localised at the apical surface of epithelial cells via a glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) anchor. In cancer cells the expression of CEA is increased and the protein is found over the entire surface of cells. In this study, the tumour microenvironmental factors, hypoxia and abnormal pH homeostasis, were shown to increase the expression of carcinoembryonic antigen in cancer cells. In addition, the absence of acidic organelles was shown to induce mistargeting of CEA to the basolateral membrane in polarised cells. The abnormally neutral Golgi was found to interfere with the complex formation of carcinoembryonic antigen, a phenomenon recently associated with the apical sorting of other GPI-anchored proteins. Altogether these results emphasise the role of tumour-related factors – altered pH homeostasis and hypoxia – in the phenotypic changes of cancer cells.

La Cathepsine D (CathD) est une protéase lysosomale surexprimée et sécrétée par de nombreuses tumeurs solides. Cette enzyme favorise la prolifération tumorale et le processus métastatique, faisant d’elle une cible intéressante pour la thérapie anticancéreuse. Il existe un très bon inhibiteur de la CathD, la pepstatine, mais celui-ci traverse trop difficilement la membrane cellulaire pour être actif. C’est pourquoi des vecteurs de pénétration cellulaire, basés sur l’oligomérisation de mimes contraints de dipeptide, ont été développés au laboratoire. De ce travail, un bioconjugué, le JMV4463, a été développé. Composé d’un vecteur AMPA4 (tétramère de l’acide 2-(aminométhyl)phénylacétique), de la pepstatine, et d’une partie hydrophile aidant à la solubilisation du conjugué, ce bioconjugué est capable d’entrer dans les cellules et possède une activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Partant de ce travail, la synthèse de nouveaux vecteurs potentiels de pénétration cellulaire, oligomères de mimes contraints de dipeptide, a été réalisée. Leur capacité d’internalisation a été établie sous la forme de conjugués avec la pepstatine. Les monomères envisagés étaient des analogues des motifs AMPA et acide (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acétique (DBT), motif ayant également montré une importante capacité d’internalisation. Ainsi, des analogues de l’AMPA en série indole, pyrrole et cyclohexane ont été préparés. De plus, la synthèse d’analogues de l’AMPA possédant différentes substitutions a été réalisée, tels que les méta- et para-AMPA, un homologue inférieur ou les 4,5-diméthoxy-, 4,5-dihydroxy- et 4-bromo-AMPA. Un analogue en série benzodiazépine du DBT a également été étudié. Tous les vecteurs correspondants sont capables d’internaliser la pepstatine dans les cellules mais, de façon surprenante, aucun des conjugués n’a montré d’activité anti-proliférative, indiquant un rôle essentiel du vecteur AMPA4. Une étude des relations structure / activité du JMV4463 a confirmé que le vecteur AMPA4 possédait un mode d’action unique mais celui-ci n’a pu être identifié à ce jour. Dans cette étude, il a également été montré qu’il était possible de simplifier la structure de la pepstatine, en remplaçant un de ses motifs statine par un motif gamma-alanine, permettant un coût de production réduit. Enfin, une étude in vivo sur un modèle xénogreffé de souris a montré un fort potentiel anti-tumoral du conjugué JMV4463. / Cathepsin D (CathD) is an overexpressed lysosomal protease secreted by several solid tumors. This enzyme is involved in tumor proliferation and metastasis, which makes it a promising target for cancer therapy. There exists a potent CathD inhibitor called Pepstatin, but it presents a too poor ability to cross the plasmic membrane in order to be active. To overcome this drawback, the development of cell penetrating vectors based on the oligomerization of constrained dipeptide mimetics has been undertaken in our lab. From this work, the bioconjugate JMV4463 has been developed. This bioconjugate is made of an AMPA4 (2-(aminomethyl)phenylacetic acid) vector, the pepstatin and a hydrophilic part which increases its solubility. This bioconjugate is able to penetrate the cells and has an antiproliferative effect on different cancer cell lines. Based on this work, synthesis of new potential cell penetrating vectors, oligomers of constrained dipeptide mimetics, was performed. Their internalization ability was established as their conjugate with pepstatin. We developed analogues of AMPA scaffold and (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acetic acid (DBT), which showed an important internalization ability. Thus, AMPA derivatives in indole, pyrrole and cyclohexane series were prepared. Furthermore, the synthesis of AMPA analogues having different substitutions on its aromatic part was performed, such as meta- and para- AMPA, an inferior homologue or 4,5-dimethoxy-, 4,5-dihydroxy- and 4-bromo-AMPA. An analogue of DBT in the benzodiazepin series has also been studied. All the corresponding vectors were able to internalize the pepstatin into the cells. Surprisingly, none of the conjugates showed an anti-proliferative activity, indicating the essential role of the AMPA vector. A structure/activity relationships study was performed for JMV4463. The obtained results confirmed that the AMPA vector has a unique mode of action that has not been identified yet. Furthermore, it has been demonstrated that it was possible to simplify the pepstatin structure by replacing one of its statin residues by a gamma alanine, which allows decreasing the production cost. Finally, an in vivo study on a xenografted mouse model showed a high anti-tumour potential for the JMV4463 conjugate.

Le cancer du sein triple-négatif est un sous-type représentant environ 15 % des cancers du sein, qui est caractérisé par l'absence de récepteurs hormonaux aux œstrogènes et à la progestérone et l'absence d'expression du facteur de croissance HER-2. Le cancer du sein triple-négatif est également associé à un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique précoce. Actuellement, de nombreuses molécules sont testées comme cible thérapeutique dans ce type de cancer. La cathepsine D, une aspartyl protéase lysosome, est un marqueur de mauvais pronostic du cancer du sein associé au risque métastatique. Cette protéase est surexprimée par les cellules cancéreuses mammaires et hypersécrétée dans le microenvironnement tumoral. Notre équipe a apporté des contributions importantes pour élucider le rôle de la cath-D dans le cancer du sein. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance et l'angiogenèse tumorales ainsi que la formation des métastases. Au niveau moléculaire, le proenzyme sécrété par la cellule tumorale stimule la croissance invasive du fibroblaste mammaire via le récepteur LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1). De plus, au pH extracellulaire acide des tumeurs, la pro-cathepsine D secrétée dégrade un des plus puissants inhibiteurs des cystéines cathepsines, la cystatine C, stimulant ainsi leurs activités protéolytiques.Mon travail a consisté à développer des anticorps anti-cath-D, présentant un effet thérapeutique dans le cancer du sein triple-négatif. Nous avons utilisé deux approches l'une par la technologie des hybridomes qui a permis d'isoler 50 anticorps, qui se sont avérés être des IgM. L'autre, par phage display, où 8 anticorps fragments scFv anti-cath-D ont été sélectionnés par ELISA. Ces 8 scFv ont été criblés pour leur capacité à bloquer l'activité biologique de la cathepsine D : inhibition de l'interaction avec LRP1 et inhibition du clivage d'un substrat fluorescent. Les anticorps E2 et F1 reformatés en IgG1 inhibent in vitro le phénomène de cicatrisation, la clonogénéicité, la croissance tridimensionnelle dans le matrigel et in vivo la croissance tumorale des cellules de cancer du sein triple-négatif MDA-MB-231. Cette étude est une première étape vers le développement de thérapie anti-cath-D dans le cancer du sein. / Cancer is the leading cause of death in the developed world. This project focuses t on the high incidence triple-negative breast cancers (ER- and PR-negative, HER2-non amplified) who present unsatisfactory treatments. Tumor progression is known to be due to cross-talk between cancer cells and their surrounding supporting tissue, the tumor stroma. The lysosomal aspartic protease cathepsin D is over-produced and abnormally hypersecreted by epithelial breast cancer cells. This protease is an independent marker of poor prognosis in breast cancer correlated with the incidence of clinical metastasis. Cathepsin D stimulates tumor progression by both proteolytic and non-proteolytic molecular mechanisms. Our team has shown that secreted pro-cathepsin D can alter the tumor microenvironment by interacting with partners such as the LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1) receptor, and/or by cleaving endogenous substrates like cystatin C. My pHD project aimed to target extracellular procathepsin D released in breast cancer by developing specific therapeutic antibodies to block its catalytic and binding capacities. We have isolated 50 hybridomas, that secreted IgM, a pentameric antibody format with high avidity but low affinity, and 8 anti-cath-D scFv by phage display. The anti-human cath-D scFv were selected by functional screenings for their ability to inhibit both the proteolytic activity of Cath-D and its binding to the fibroblastic LRP1 receptor. Two scFv cloned under IgG1 format (F1 and E2) inhibited wound healing, colony formation and three-dimensional outgrowth in Matrigel of MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells, and their tumor growth in athymic nude mice. Our findings strongly suggest that antibody-based targeting of Cath-D within the breast tumor microenvironment may have therapeutic efficacy for breast cancer treatment.

L’aspartyl protéase cathepsine D, surexprimée et hyper-sécrétée par les cellules épithéliales cancéreuses mammaires est un facteur de mauvais pronostic des cancers du sein et stimule la prolifération des cellules cancéreuses et la formation des métastases. Elle affecte également le micro-environnement tumoral en induisant la croissance invasive des fibroblastes. Les travaux de l’équipe ont montré que le LDL-receptor related protein 1, LRP1, est le récepteur fibroblastique de la cathepsine D. LRP1 est fortement exprimé par les adipocytes. Les études cliniques indiquent que l’obésité est un facteur de risque dans de nombreux cancers, dont le cancer du sein chez la femme ménopausée.Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la cathepsine D et du LRP1 dans les adipocytes, type cellulaire prédominant du micro-environnement tumoral mammaire. Nos résultats indiquent une surexpression de la cathepsine D et du LRP1 dans le tissu adipeux humain et murin obèse. De plus, l’expression de la cathepsine D est augmentée pendant la différenciation adipocytaire. Finalement, l’extinction de l’expression de la cathepsine D et du LRP1 inhibe l’adipogenèse indiquant leurs rôles clefs dans ce processus.L’ensemble de ces résultats suggère que la cathepsine D et son récepteur LRP1 pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de l’obésité. / The aspartyl protease cathepsin D, overexpressed and hyper-secreted by epithelial breast cancer cells is a poor prognosis factor in breast cancers and stimulates cancer cell growth and metastasis formation. It also affects the tumor microenvironment, inducing the fibroblasts invasive outgrowth. Our works have shown that the LDL receptor-related protein1, LRP1, is the fibroblastic receptor for cathepsin D. LRP1 is highly expressed in adipocytes. Clinical studies indicate that obesity is a risk factor in many cancers, including breast cancer in postmenopausal women.During this thesis, we studied the role of cathepsin D and LRP1 in adipocytes, which are the prominent cell type in the tumor microenvironment of breast cancers. Our results indicate that cathepsin D and LRP1 are overexpressed in human and mouse obese adipose tissue. Furthermore, the expression of cathepsin D is increased during adipocyte differentiation. Finally, the inhibition of the cathepsin D and LRP1 expression inhibits adipogenesis indicating their key role in this process.All these results suggest that cathepsin D and its receptor LRP1 could be potential therapeutic targets in the treatment of obesity.

Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) is an economically important herbivorous pest. Cathepsin D-like aspartic peptidase (LdCD) plays an important role during protein degradation in the midgut of Colorado potato beetle. This work describes the preparation of two expression systems, namely in Escherichia coli and Pichia pastoris, for the production of recombinant LdCD. The protocol for refolding of denatured LdCD was designed and optimized. Activation of the inactive LdCD zymogen and cleavage of the propetide (activation peptide) were investigated. This process proceeds autocatalytically at acidic pH or with the assistance of the cysteine peptidase legumain. The proteolytic activity of LdCD was characterized using fluorogenic peptidic substrate and protein substrates, and kinetic parameters and pH optimum were determined. The inhibition specificity of LdCD was analyzed using a panel of peptidase inhibitors. LdCD was significantly inhibited by PDI (potato cathepsin D inhibitor), a protein inhibitor produced in potato leaves. This suggests that PDI is a natural defense protein, which is directed against LdCD in the midgut of Colorado potato beetle in order to block the digestion. The potential application of PDI in the construction of transgenic crops resistant against insects is discussed.

The blood fluke Schistosoma mansoni and the hard tick Ixodes ricinus produce an aspartic protease cathepsin D which initiates degradation of hemoglobin, their key nutrient. First, in the presented work, the protocol for refolding and activation of the zymogen of cathepsin D from I. ricinus (IrCatD) was developed and optimized. In acidic pH the propeptide of IrCatD zymogen was removed by an auto-activation mechanism. Further, a kinetic assay with fluorogenic substrates was employed to study functional properties of IrCatD including pH optimum, substrate and inhibition specificities. Second, two isoforms of cathepsin D from S. mansoni (SmCatD) were produced using recombinant expression in E. coli. These recombinant proteases were isolated from inclusion bodies using affinity chromatography under denaturating conditions, and protocol for their refolding was developed and optimized. The studied aspartic proteases are pharmacological targets: inhibitors of SmCatD represent potential chemotherapeutics for the treatment of schistosomiasis, and IrCatD is a candidate antigen for the development of novel anti-tick vaccines.

Les cancers du sein triple-négatif (TNBC) (RE-, RP-, HER2) représentent 15% des cas de cancer du sein. Les patientes atteintes de TNBC sont traitées uniquement par chimiothérapie. A l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie ciblée efficace. Malgré une chimiosensibilité initiale, les rechutes sont fréquentes. Ainsi de nouveaux traitements sont nécessaires pour soigner ces patientes. Dans le cancer du sein, l’aspartyl protéase cathepsine D (cath-D), un marqueur de mauvais pronostic, est surexprimée par les cellules cancéreuses et est hyper-secrétée dans le microenvironnement tumoral. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance invasive des fibroblastes, la croissance tumorale, l’angiogenèse tumorale et la formation des métastases. Différentes études ont mis en exergue le rôle oncogénique de la cath-D extracellulaire dans le cancer du sein, suggérant qu’elle serait une cible thérapeutique d’intérêt. Afin de neutraliser sélectivement la forme sécrétée de la cath-D, le laboratoire a généré des anticorps humains IgG1 dirigés contre la cath-D par un crible de phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454).Les principaux objectifs de ma thèse ont été i) de valider la cath-D comme une cible extracellulaire d’intérêt pour les patientes atteintes de TNBC, ii) d’évaluer les effets thérapeutiques et iii) de caractériser les mécanismes d’action des anticorps humains anti-cath-D.Nous avons montré que des niveaux élevés d'ARNm de CTSD sont corrélés à une survie sans récidive plus courte. Par analyse protéomique et étude immunohistochimique anti-cath-D réalisée sur Tissue Micro-Array, nous avons observé que la cath-D extracellulaire est détectée dans le microenvironnement tumoral des TNBC contrairement au tissu mammaire normal. Nos résultats mettent ainsi en exergue que la cath-D serait un biomarqueur tumoral extracellulaire, suggérant que les patientes atteintes de TBNC pourraient bénéficier d’une thérapie par des anticorps anti-cath-D. Par des analyses de SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) et de biodistribution, nous avons validé que les anticorps humains anti-cath-D, F1 et E2, s’accumulent dans les xénogreffes de la lignée TNBC MDA-MB-231 chez la souris athymique. Les anticorps F1 et E2 inhibent la croissance tumorale des xénogreffes MDA-MB-231 et améliorent la survie des souris athymiques. Notre meilleur anticorps anti-cath-D, F1, inhibe également la croissance tumorale de deux lignées de TNBC PDX (patient-tumor derived xenografts). Au niveau mécanistique, l’anticorps F1 module le microenvironnement immunitaire dans les tumeurs issues des xénogreffes MDA-MB-231. L’ensemble de nos résultats suggèrent qu’une immunothérapie avec des anticorps humains anti-cath-D pourrait être une nouvelle approche thérapeutique pour les patientes atteintes de TNBC. / Triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for 15-20% of all breast cancer cases, and chemotherapy is the only available treatment. Thus identification of new therapeutic targets is required to improve TNBC outcome. In breast cancer, the aspartic protease cathepsin D (cath-D) is a marker of poor prognosis associated with metastatic risk. This protease is overexpressed by breast cancer cells and is abnormally hypersecreted into the tumor microenvironment. Cath-D affects both cancer and stromal cells in the breast tumor microenvironment by increasing the proliferation of breast cancer cells, fibroblast invasive outgrowth, tumor growth and angiogenesis, and metastasis formation. Many studies indicated that extracellular cath-D displays oncogenic activities, suggesting it could represent a novel therapeutic target in TNBC. In order to block its oncogenic actions, the laboratory generated human IgG1 antibodies against extracellular cath-D by phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454). The aims of my PhD project was i) to validate the potential value of cath-D as a tumor-specific extracellular target in TNBC, ii) to evaluate the therapeutic activity, and iii) to characterize the mechanisms of action of these anti-cath-D human antibodies.We showed that elevated CTSD mRNA levels correlated with shorter recurrence-free survival. Using proteomics analysis and anti-cath-D immunohistochemistry performed on Tissue Micro-Array, we observed that extracellular cath-D was detected in the tumor microenvironment of TNBC, but not in matched normal breast stroma samples. Our results thus indicate that cath-D is a tumor cell-associated extracellular biomarker and strongly suggest that it could be a good candidate for antibody-based therapy in TNBC. We found that anti-cath-D human antibodies, F1 and E2, accumulated in TNBC MDA-MB-231 tumor xenografts in athymic mice by SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) and biodistribution analysis. F1 and E2 antibodies inhibited tumor growth of MDA-MB-231 tumor xenografts and improved mice survival without apparent toxicity. F1, the best antibody candidate, inhibited tumor growth of two TNBC patient-derived xenografts (PDX). Mechanistically, F1 treatment modulates immune tumor microenvironment in the MDA-MB-231 tumor cell xenograft model. Together, our results indicate that antibody-based targeting of cath-D may have therapeutic efficacy for TNBC treatment.

Les Glycosaminoglycannes (GAGs) sont une famille de polysaccharides principalement localisés au niveau de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique. Ils peuvent interagir avec des facteurs de croissance et des cytokines pour réguler leurs activités, participer à des transports protéiques à travers la membrane cellulaire, moduler les activités de certaines enzymes telles que les cathepsines (enzymes lysosomales). Toutes ces activités démontrent que les GAGs jouent des rôles primordiaux dans la régulation de la croissance, la différenciation, l'adhésion, l'inflammation et la mort cellulaire.L'implication de ces polysaccharides dans la régulation de l'apoptose via la voie mitochondriale n'a toujours pas été déterminée. Ici, nous démontrons dans un modèle cellulaire de fibroblastes de peau en culture primaire, soumis à un stress oxydatif par de l'H2O2, qu'un mimétique des GAGs, l'OTR4120, est capable de protéger la membrane du lysosome, de réduire le taux de ROS intracellulaires et d'inhiber la chute du potentiel de membrane mitochondrial et ainsi d'empêcher la libération du cytochrome c et l'activation des activités caspases-9 et -3 sans affecter la voie extrinsèque de l'apoptose. Les héparanes sulfates et les chondroïtines sulfates au contraire de l'héparine, ont montré un effet protecteur de l'apoptose en inhibant les protéines clefs de ce processus de mort cellulaire. Ainsi, les GAGs naturels et l'OTR4120 sont capables s'opposer à l'apoptose, en inhibant l'activité de la cathepsine D libérée dans le cytosol, empêchant ainsi l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose via la mitochondrie. Ces résultats ouvrent de nouveaux horizons notamment dans certaines maladies où le stress oxydatif est impliqué comme c'est le cas de certaines maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson.La cause de la maladie de Parkinson (MP) qui affecte les neurones dopaminergiques demeure encore mystérieuse, bien que différentes preuves soutiennent les hypothèses impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux et une accumulation d'α-synucléine comme étant les événements majeurs dans cette physiopathologie. Récemment, la cathepsine D a été impliquée dans des processus de mort cellulaire et montrée comme étant surexprimée dans des modèles de la MP. De plus, apparait être l'une des principales enzymes responsables de la dégradation de l'α-synucléine. Puisque les glycosaminoglycannes (GAGs) sont capables de réguler l'activité de la cathepsine D dans des cellules en culture dans une condition de stress, nous avons cherché à démontrer si GAGs pouvaient être localisés à un niveau intracellulaire, où ils pourraient interagir avec la cathepsine D et s'ils étaient capables de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine. Ainsi nous avons mis en place un modèle cellulaire de la MP induit par le MPP+. Nous avons observé que l'expression génétique des enzymes de la biosynthèse des GAGs (HS2ST, HS6ST et CHST8) a été modifiée dans les cellules stressées par la neurotoxine et que leurs taux mesurés par leurs sulfates étaient augmentés plus précisément au niveau des HS. Au contraire, l'absence de GAGs sulfatés induit par le chlorate de sodium, un inhibiteur de la PAPs (donneur de sulfates), a permis d'augmenter l'activité de l'activité cathepsine D et également d'inhiber l'accumulation ou d'induire la dégradation de l'α-synucléine. Pour la première fois, il a été montré que les GAGs sont capables d'agir sur l'activité cathepsine D à l'intérieur de la cellule et de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine. / Pas de résumé anglais