Les cavéoles sont des invaginations en forme de coupelle à la membrane plasmique. Ces organelles multifonctionnelles jouent entre autres, un rôle clé dans la mécano-protection et la signalisation cellulaire. En effet, les cavéoles ont la faculté de s’aplanir en réponse à l’augmentation de la tension membranaire, afin de protéger la cellule des contraintes mécaniques. Les cavéoles jouant un rôle clé dans la signalisation cellulaire, nous avions émis l’hypothèse que le cycle mécano-dépendent de désassemblage/réassemblage des cavéoles constitue un interrupteur mécanique de certaines voies de signalisation. Ce projet consiste à élucider le mécanisme moléculaire responsable du contrôle de la voie de signalisation JAK-STAT par la mécanique des cavéoles. Dans ces travaux, nous avons pu démontré que la cavéoline-1 (Cav1), un constitutant essentiel des cavéoles est libérée et devient hautement mobile au niveau de la membrane plasmique. Considérant les propriétés de signalisation de Cav1, Nous avons testé l’effet du désassemblage des cavéoles sur la signalisation cellulaire. Un criblage à haut débit, nous a permis identifié la voie de signalisation JAK- STAT stimulée par l’IFN-α comme voie modèle pour cette étude. En effet, la transduction du signal JAK-STAT induit par l’IFN-α est modulée par la mécanique des cavéoles. Afin de disséquer le mécanisme moléculaire responsable du contrôle de la signalisation JAK-STAT par la mécanique des cavéoles, nous avons déterminé le rôle de Cav1 dans ce contrôle. Nous avons observé que Cav1 est un régulateur négatif de la phosphorylation de STAT3 dépendante de la kinase JAK1. De plus, nous avons démontré que Cav1 interagit avec JAK1 en fonction de la tension membranaire. Nous avons également démontré que cette interaction Cav1-JAK1 fait intervenir le « scaffolding domain » de Cav1 (CSD), et que celui-ci est responsable de l’abolition de l’activité kinase de JAK1. Par conséquent, l’interaction de Cav1 avec JAK1 empêche l’activation de STAT3 par la kinase JAK1. Ces résultats démontrent que les cavéoles sont des organelles de mécano-signalisation, qui, lors d’un stress mécanique, libèrent de la Cav1 non cavéolaire capable d’inactiver la kinase JAK1, empêchant ainsi, la transduction du signal JAK-STAT. / Caveolae are small cup-shaped plasma membrane invaginations. These multifunctional organelles play a key role in cell mechanoprotection and cell signaling. Indeed our laboratory reported that caveolae have the ability to flatten out upon membrane tension increase, protecting cells from mechanical strains. Since caveolae play a key role in cell signaling we hypothesized that the mechano-dependent cycle of caveolae disassembly/reassembly may constitute a mechanical switch for signaling pathways. In this project, we elucidated the molecular mechanism underlying the control of JAK-STAT signaling by caveolae mechanics. We showed that caveolin-1 (Cav1), an essential caveolar component is released and become highly mobile at the plasma membrane under mechanical stress. Considering that caveolae are important signaling hubs at the plasma membrane, we addressed the effects of the mechanical release of Cav1 on cell signaling. Using high throughput screening, we identified the JAK-STAT signaling pathway as a candidate. To further dissect the molecular mechanism underlying the control of JAK-STAT signaling by caveolae mechanics, we addressed the role of Cav1 in the control of JAK-STAT signaling stimulated by IFN-α. We found that Cav1 was a specific negative regulator of the JAK1 dependent STAT3 phosphorylation. Furthermore, the level of Cav1 interaction with JAK1 depended on mechanical stress. We could show that Cav1-JAK1 interaction was mediated by the caveolin scaffolding domain (CSD), abolishing JAK1 kinase activity, hence, interfering with STAT3 activation upon IFN-α stimulation. Altogether our results show that caveolae are mechanosignaling organelles that disassemble under mechanical stress, releasing non-caveolar Cav1, which binds to the JAK1 kinase and inhibits its catalytic activity, preventing thereby JAK-STAT signal transduction.

La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l’homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l’apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L’expression de ces propriétés est induite par l’environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d’être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides β-amyloïde (Aβ) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d’être à l’origine de l’accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d’Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l’implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l’implication du récepteur « receptor for advanced glycation end-products » (RAGE) dans l’entrée vers le compartiment cérébral des peptides Aβ. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L’implication de pompes d’efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la « breast cancer resistance protein » (BCRP) dans la restriction de l’influx des peptides Aβ a également été mise en évidence. D’autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur « low density lipoprotein receptor-related 1 » (LRP1) n’est pas impliqué dans l’efflux des peptides Aβ. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques. / The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid β (Aβ) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of « receptor for advanced glycation end products » (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae’s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and « breast cancer resistance protein » (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Aβ peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that « low density lipoprotein receptor related-1 » (LRP1) is not involved in the efflux of Aβ peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.

La sarcopénie est une maladie dégénérative liée à l’âge qui se caractérise par une perte progressive et involontaire de la masse et de la force musculaire. Elle s’accompagne d’une atteinte de la régénération musculaire et d’une accumulation des espèces réactives de l’oxygène. Les cavéoles sont des invaginations de la membrane plasmique. Dans le muscle, elles jouent un rôle dans la différenciation des cellules satellites et dans le maintien de l’unité contractile dans le muscle différencié. Certaines formes de myopathies sont consécutives à l’absence de cavéoles dans le muscle. Elles sont également impliquées dans la médiation de signaux liés à la régulation du stress oxydant. Afin de mieux comprendre les mécanismes régulant la mise en place de la sarcopénie, nous avons étudié ici les relations existant entre le stress oxydant et les cavéoles. Des cellules musculaires de souris ont été traitées par l’H2O2 et une diminution du taux des cavéolines-1et -3 a été mise en évidence dans des myoblastes et les myotubes, respectivement. Il apparaît donc que les protéines constitutives des cavéoles sont effectivement sensibles au stress oxydant dans les cellules musculaires. En présence d’H2O2, la fonction des cavéoles (endocytose et résistance au stress mécanique) était également significativement altérée dans des myoblastes. L’ensemble des résultats obtenus suggère que le stress oxydant aurait un effet sur les cavéoles, ce qui pourrait entraîner des conséquences sur la régénération et le maintien de l’intégrité musculaire au cours du vieillissement. / Sarcopenia is an age-related degenerative disease which is characterized by a progressive and involuntary loss of muscle mass and strength. It is accompanied by an impairment of muscle regeneration and accumulation of reactive oxygen species. Caveolae are invaginations of the plasma membrane. In muscle, they play a role in the differentiation of satellite cells and in maintaining the contractile unit of the differentiated skeletal muscle. Some myopathies are resulting from the absence of caveolae in muscle. Caveolae are also involved in mediating signals related to the regulation of oxidative stress. To better understand the mechanisms involved in the development of sarcopenia, we investigated here the relationship between oxidative stress and caveolae. Mouse muscle cells were treated with H2O2 and decreased levels of caveolin-1 and -3 were demonstrated in myoblasts and myotubes, respectively. It therefore appears that caveolae constituent proteins are actually sensitive to oxidative stress in muscle cells. In the presence of H2O2, caveolae functions (endocytosis and resistance to mechanical stress) were also significantly degraded in myoblasts. Altogether, these data suggest that oxidative stress would affect caveolae, which could have consequences on regeneration and maintenance of muscle integrity during aging.

Le peptide antimicrobien LL-37 a été retrouvé surexprimé dans différents types de cancer et plus particulièrement dans le cancer du sein dans lequel il est associé au développement des métastases. Nous avons observé, in vitro, que la migration de trois lignées cancéreuses mammaires est augmentée par le peptide LL-37 et son énantiomère (D)-LL-37, excluant la fixation du peptide à un récepteur protéique. Sur les cellules cancéreuses mammaires MDA-MB-435s, le peptide se fixe à la membrane plasmique et diminue sa fluidité. La microscopie électronique localise LL-37 dans les cavéoles et à la surface de structures impliquées dans la migration cellulaire, les pseudopodes. LL-37 induit une entrée de calcium via le canal TRPV2 dont l’activité est augmentée par son recrutement dans les pseudopodes. Ce recrutement est dépendant de l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT induite par LL-37. L’entrée de calcium via TRPV2 est potentialisée par l’activation du canal potassique BKCa, localisé aussi dans les pseudopodes. Des ARN interférents contre TRPV2 inhibent à 70% la migration induite par LL-37, donnant un rôle prépondérant à ce canal dans les effets pro-migratoire du peptide. La fixation du peptide LL-37 aux membranes des cellules cancéreuses et l’activation de canaux ioniques constituent un nouvel axe de recherche pour comprendre le rôle du peptide dans la progression tumorale. / The antimicrobial peptide LL-37 is overexpressed in several types of cancer, among which breast cancer were it is associated with metastasis development. Our experiments on three mammary cancer cell lines have shown that LL-37 increases cell migration. Both its natural (L)-form and its (D)-enantiomer are equally active, excluding a specific binding to a protein receptor. On the MDA-MB-435s cell line, LL-37 attaches to plasma membrane and reduces its fluidity. Electron microscopy localized LL-37 on the surface of pseudopodia, structures implicated in cell migration, and in caveolae. LL-37 induces calcium entry via the TRPV2 channel, which is recruited to pseudopodia. Recruitment depends on activation of PI3K/AKT signaling induced by LL-37. Calcium entry via TRPV2 is potentiated by activation of the BKCa potassium channel also located in pseudopodia. TRPV2 suppression by RNA interference results in 70% reduction of cell migration induced by LL-37, attributing a crucial role of this channel to the promigratory effects of the peptide. Binding of LL-37 to cancer cell membranes and in consequence the activation of ion channels constitutes a novel research field to understand its role in tumor progression.

Les cavéoles sont des invaginations de la membrane plasmique qui nécessitent les cavéolines pour leur biogénèse. Récemment, mon laboratoire d’accueil a décrit un nouveau rôle pour les cavéoles dans la réponse au stress mécanique (Sinha et al, Cell, 2011). Des mutations de la Cavéoline-3 (Cav3), isoforme spécifique du muscle, qui mènent à la rétention de la protéine dans l’appareil de Golgi, ont été décrites dans certaines dystrophies musculaires (DM). Mon projet consiste en l’identification du lien fonctionnel entre les mutations de la Cavéoline-3 et les dystrophies musculaires, qui ont comme phénotype principal un défaut d’intégrité et de réparation membranaire et des dérégulations dans l’homéostasie du muscle.Dans des myotubes humains provenant d’un patient portant la mutation Cav3-P28L ou Cav3-R26Q, j’ai pu montré une diminution de la quantité de cavéoles à la membrane plasmique. En conséquence, les myotubes mutants ne sont plus capables de tamponner l’augmentation de la tension membranaire provoquée par un stress mécanique, ce qui conduit à un défaut d’intégrité membranaire. J’ai aussi montré que la voie de l’interleukin-6 (IL6), importante pour l’homéostasie du muscle, est hyperactivée dans les myotubes mutants, révélant un rôle de régulateur négatif de la voie IL6 par Cav3. De plus, cette voie n’est plus régulée négativement quand un stress mécanique est appliqué comme c’est le cas dans les myotubes sauvages (WT). De manière intéressante, les myotubes mutés phénocopient une déplétion de Cav3 et ce phénotype est réversible lorsque l’on reforme des cavéoles à la membrane plasmiques des myotubes mutés en exprimant la forme WT de Cav3. Ceci confirme un lien direct entre les mutations de Cav3 induisant l’absence de cavéoles et le défaut de mécano-protection et mécano-signalisation de la voie IL6. / Caveolae are plasma membrane invaginations that require caveolin proteins for their biogenesis. Recently, our laboratory reported a new role for caveolae in the cell response to mechanical stress (Sinha et al, Cell, 2011). Mutations in the CAV3 gene (muscle isoform), which lead to Cav3 retention in the Golgi apparatus, are associated with muscular dystrophies (MD). My project consists in identifying the functional link between Cav3 mutations and MDs, which exhibit defects in membrane integrity and repair, and in muscle homeostasis.In Cav3-P28L and Cav3-R26Q mutated human myotubes, I showed a lack of caveolae structures at the plasma membrane. This results in a failed buffering of membrane tension increase upon mechanical stress, which leads to membrane integrity defects. I also showed that the interleukin-6 (IL6) pathway, important for muscle homeostasis, is overactivated in mutant myotubes, showing evidence of a negative regulation of the pathway by Cav3. Furthermore, the IL6 pathway is no longer negatively regulated upon mechanical stress, as it is the case in wild-type (WT) myotubes. Interestingly, mutated myotubes phenocopy Cav3 depletion, and the phenotype is reversible with caveolae reformation upon expression of the WT form of Cav3. This confirms the direct link between Cav3 mutations and the absence of caveolae with failed mechano-protection and IL6/STAT3 mechano-signaling.

Toutes les actions biologiques de l'hormone de croissance (GH) sont initiées par l'interaction de l'hormone avec un homodimère de son récepteur spécifique (GHR2) présent au niveau de la surface de ses cellules-cibles. Cette association conduit à l'activation de différentes voies de transduction du signal intracellulaire ainsi qu'à l'internalisation du complexe GH-GHR2, notamment au niveau de la mitochondrie. L'objectif de cette étude est de montrer le mécanisme et l'implication de l'internalisation par les cavéoles dans la régulation de l'action de la GH au niveau de la fonction mitochondriale. Nous avons montré l'importance de la boîte 1 du GHR dans la stimulation de l'activité respiratoire globale ; le transport de la GH par la voie des cavéoles dans la mitochondrie ; l'importance de la localisation intramitochondriale de la GH dans la régulation des complexes II et IV de la chaîne respiratoire. Ces résultats suggèrent une nouvelle voie d'action directe de la GH sur la mitochondrie