L'encodage du signal acoustique en impulsions nerveuses se réalise au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée. Une dépolarisation déclenche l'exocytose des vésicules synaptiques suite à l'activation des canaux calciques CaV1.3 et à l'action d'un senseur calcique particulier, l'otoferline, une grande protéine se composant d'un domaine transmembranaire en C-terminal et de six domaines C2 (A-F) pouvant lier le Ca2+ et les phospholipides. Afin de caractériser le rôle de ces différents domaines C2, nous avons utilisé des vecteurs viraux (AAV) permettant l'expression de formes raccourcies de l'otoferline (mini-Otof) in vivo dans les CCI de souris dépourvues d'otoferline (Otof -/-). Nous montrons que les mini-Otof contenant les domaines C2-EF, C2-DEF ou C2-ACEF sont suffisantes pour restaurer l'exocytose rapide des CCI Otof -/-, sans toutefois restaurer l'audition car le recrutement des vésicules synaptiques reste altéré. Nous révélons pour la première fois la présence d'une endocytose ultra-rapide (t < 20 ms) dynamine- et otoferline-dépendante, une fonction certainement essentielle à l'homéostasie membranaire des CCI. L'expression des mini-Otof C2-EF et C2-DEF a également permis de restaurer partiellement la composante rapide de l'inactivation du courant calcique des CCI, celle-ci étant absente chez les souris Otof -/-. Cette inactivation rapide est réalisée par les isoformes courtes Cav1.3S qui ont leur partie C-terminale régulatrice tronquée, contrairement aux isoformes longues Cav1.3L dépourvues d'inactivation. Afin de différencier les rôles spécifiques de ces isoformes dans le cycle des vésicules synaptiques, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9, nous permettant d'éditer spécifiquement la partie C-terminale régulatrice des canaux Cav1.3L. Nos résultats montrent que les souris CRISPR-Cav1.3L présentent une surdité sévère expliquée au niveau des CCI par un défaut de recrutement vésiculaire aux zones actives, alors que les Cav1.3S inaltérés contrôlent la fusion rapide des vésicules synaptiques. / The precise encoding of acoustic signals into nerve impulses is achieved at the ribbon synapses of inner hair cells (IHC) of the cochlea. Exocytosis of synaptic vesicles by IHC is triggered by voltage-activation of Cav1.3 calcium channels and the action of a specific calcium sensor, otoferlin, a large protein with a single C-terminal transmembrane domain and six C2 (A-F) domains which binds Ca2+ and interacts with phospholipids. In order to characterize the function of the various otoferlin C2 domains, we used viral vectors (AAV) allowing the expression of shortened forms of otoferlin (mini-Otof), in vivo, in IHC from mice lacking otoferlin (Otof -/-). We show that mini-Otof containing C2-EF, C2-DEF or C2-ACEF domains are sufficient to restore fast synaptic vesicle exocytosis in Otof -/- IHC, but without restoring hearing because vesicular replenishment remains impaired. For the first time, we also uncover an ultra-fast endocytosis (t < 20 ms) dynamin- and otoferlin-dependant, a function that is certainly essential for a fast regulation of IHC membrane homeostasis. Furthermore, the expression of the mini-Otof C2-EF and C2-DEF also partially restored the fast component of the Ca2+ current inactivation in Otof -/- IHC. This rapid inactivation is carried out by Cav1.3S short isoforms which have a truncated C-terminal regulatory domain, unlike Cav1.3L long isoforms which display no inactivation. To characterize the specific role of these Cav1.3 isoforms, we used CRISPR-Cas9 technology, allowing a specific removal of the C-terminal regulatory part of the Cav1.3L channels in IHC. Our results show that CRSIPR- Cav1.3L mice display severe deafness explained at the IHC level by a defect in vesicular replenishment of the active zones, while Cav1.3S are sufficient to ensure fast and transient exocytosis of docked synaptic vesicles.

De plus en plus d'études désignent les canaux K+ et Ca2+ comme de nouvelles cibles très prometteuses pour des thérapies anticancéreuses. Parmi ces canaux, les canaux SK3 et CaV1.3 ont été identifiés comme des régulateurs de la migration des cellules cancéreuses. Lors de mes travaux de thèse, nous avons découvert une nouvelle voie de signalisation montrant que la protéine αlD du canal CaVl.3 est impliquée dans la régulation de l'homéostasie Ca2+ ainsi que dans la migration cellulaire, par un mécanisme indépendant de sa fonction canonique. En parallèle nous avons identifié des résidus sérines du canal SK3 qui sont importants dans la régulation négative du canal SK3 par l'activation de la voie AMPc-PKA. Ces résultats suggèrent également que l'Ohmline, un éther-lipide de synthèse, inhibiteur du canal SK3, ne réduit pas l' activité du canal SK3 en favorisant sa phosphorylation suite à l'activation de la voie AMPc-PKA. / Many studies show that K+ and Ca2+ channels are promising new targets for anticancer therapies. Among these channels, SK3 and Ca V 1.3 ion channels have been identified as regulators of cancer cell migration. Here, we have discovered a new signalization pathway showing that the αlD protein of the CaV1 .3 channel is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis and in cell migration by a mechanism independent of its canonical function. In parallel, we have identified serine residues of SK3 channel that are important in the negative regulation of the SK3 channel by activation of the cAMP-PKA pathway. These results also suggest that Ohmline, a synthetic ether-lipid, and inhibitor of SK3 channel, does not reduce the activity of SK3 channel by promoting its phosphorylation following the activation of the cAMP-PKA pathway.

Les cellules ciliées internes (CCIs) de la cochlée encodent les signaux acoustiques en impulsions électriques au niveau des synapses à ruban formées avec les fibres afférentes du nerf auditif. L'exocytose des vésicules glutamatergiques par les CCIs est déclenchée par l'activation des canaux calciques Cav1.3 et par l'otoferline, le senseur calcique intracellulaire présumé. Les mécanismes moléculaires précis régulant cette exocytose restent encore mal compris, notamment ceux à l’origine de sa précision temporelle, sa vitesse élevée en phase avec le signal acoustique("phase-locking" jusqu'à 1-2 kHz) et son infatigabilité. Nous montrons que la spécificité des synapses à ruban auditive et vestibulaire passe par une organisation spatiale spécifique des canaux Cav1.3 dans les zones actives. Les CCIs utilisent différentes isoformes de canaux Cav1.3, notamment des isoformes courtes tronquées dans leur partie C-terminale. Ces isoformes courtes (Cav1.343S et Cav1.342A) sont essentiellement impliquées dans le déclenchement et dans l'adaptation rapide de l'exocytose. Cette adaptation se réalise au niveau des canaux Cav1.3 à la fois en intracellulaire par le Ca2+ et en extracellulaire parles protons secrétés lors de l'exocytose. Les isoformes longues (Cav1.342L et Cav1.3∆44),positionnées en périphérie du ruban, réguleraient le recrutement vésiculaire. Par ailleurs, nous montrons que l'organisation spatiale des canaux Cav1.3 est dépendante d'un cytosquelette d'actine-F au ruban synaptique. La clarine 1 (protéine Usher IIIA) interagirait avec l'actine-F, l'harmonine (protéine PDZ, Usher IC) et la sous-unité β2 des canaux calciques pour organiser les canaux Cav1.3 dans les zones actives. / Cochlear inner hair cells (IHCs) encode acoustic signals into nerve impulses at their ribbon synapses formed with the auditory afferent fibers. The exocytosis of glutamatergic vesicles is triggered by voltage activation of Cav1.3 channels and requires otoferlin, the putative intracellular Ca2+ sensor. The precise molecular mechanisms of exocytosis still remain elusive, notably the mechanisms allowing the temporal precision, the high rates of vesicular fusion (high frequency phase-locking with sound) and the indefatigability of the process. We show here that exocytosis in auditory and vestibular hair cells relies on a specific tight spatial organization of Cav1.3 channels at the active zones. Auditory IHCs use different Cav1.3isoforms, notably short C-terminal isoforms (Cav1.343S et Cav1.342A). These short Cav1.3isoforms essentially trigger the RRP exocytosis (Readily Releasable Pool of vesicles) and are at the origin of its fast adaptation. This fast exocytotic adaptation is based both on an intracellularCa2+ dependant inactivation of the Ca2+ current and on its extracellular block by exocytosed protons. Long Cav1.3 isoforms (Cav1.342L et Cav1.3∆44) regulate the vesicular recruitment at the active zones. Furthermore, our results show that a synaptic actin cytoskeleton is essential for the tight spatial organization of the Cav1.3 channels at the ribbons. Clarin 1 (Usher IIIA protein),through its interactions with the F-actin network, harmonin (PDZ protein, Usher IC) and the Ca2+channel β2 subunit, is required to maintain the tight organization of Cav1.3 channels at the ribbon synapses.

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