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Etude structurale de la Whirline, protéine modulaire cruciale dans les mécanismes de la vision et de l'audition / Structural study of whirlin, a modular protein pivotal in the function of vision and hearingDelhommel, Florent 29 June 2017 (has links)
La vue et l'ouïe font intervenir des cellules capables de rapidement traduire une onde, lumineuse ou sonore, en un message électrochimique transmissible au cerveau. La fonction de ces cellules sensitives repose sur leurs morphologies uniques. Les mutations de onze gènes sont la cause des syndromes Usher, associant cécité et surdité. Les protéines Usher sont indispensables à l'architecture de ces deux types cellulaires ; elles forment des complexes dont les interactions clés sont maintenues principalement par des domaines PDZ. L'une des protéines centrales de ce réseau est la Whirline, une protéine multi-domaine contenant trois domaines PDZ. Pour comprendre les bases moléculaires des syndromes Usher, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation biochimique et biophysique de la Whirline. Nous avons identifié un nouveau domaine HHD2 de la Whirline dont nous avons obtenue la structure à haute résolution et déterminé le comportement en solution, isolé et avec les domaines adjacents. Nous avons ensuite caractérisé un supramodule transitoire entre deux domaines PDZ, maintenu par des extensions structurées de chacun des domaines. Nous avons résolu la structure de la conformation compacte unique de ce complexe et étudié son équilibre avec un ensemble de conformations étendues. Nous avons enfin caractérisé in vitro le réseau d'interaction des domaines PDZ de la Whirline avec les protéines Usher. L'ensemble de nos résultats sur la structure modulaire et l'interactome de la Whirline permet de mieux comprendre le rôle de la Whirline dans les différents complexes Usher et d'expliquer les conséquences de ses mutations sur les mécanismes moléculaires de l'audition et de la vision. / Vision and hearing rely on the capacity of cells to rapidly transduce electromagnetic waves or sound waves into chemical messages that are transmissible to the brain. The function of these sensory cells requires unique morphologies. The mutations of eleven genes are responsible for Usher syndromes, associating blindness and deafness. The Usher proteins are pivotal to the architecture of the photoreceptor and hearing cells. They form complexes in which the critical interactions are mainly maintained by PDZ domains. One of these central proteins is Whirlin, a multi-domain protein encompassing three PDZ domains. To understand the molecular basis of the Usher syndromes, we focused our project on the biochemical and biophysical characterization of Whirlin. We identified a new HHD2 domain on Whirlin, for which we solved the structure at high resolution and determined the behavior in solution, isolated or with adjacent domains. We then identified a transient supramodule between two PDZ domains, maintained by PDZ structured extensions. We determined the structure of the compact and unique conformation of this tandem and we characterized its equilibrium with an ensemble of more extended conformations. Finally, we characterized in vitro the network of interaction of the PDZ domains of Whirlin, with the majority of the Usher proteins. Our results on the modular structure and the interactome of Whirlin get insight into the role of Whirlin in the numerous complexes formed by the Usher proteins and allow to better explain the consequences of its mutation on the molecular mechanisms of hearing and vision.
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Les nouvelles stratégies thérapeutiques du traumatisme sonore par bruit d'arme chez le cobaye.Abaamrane, Loubna 18 June 2010 (has links) (PDF)
Ce travail de recherche regroupe plusieurs études portant sur de nouvelles stratégies thérapeutiques après traumatisme sonore par bruit impulsionnel (arme) chez le cobaye. Il a pour objectif d'évaluer différents protocoles thérapeutiques (traitement, voie d'administration et durée). La première étude s'intéresse au traitement commun actuellement utilisé chez l'Homme: l'administration de corticoïdes. Ceux-ci sont connus pour passer difficilement la barrière hémato-cochléaire. Le but de l'étude est d'évaluer leur administration intra-cochléaire directe. La méthylprednisolone, administrée en continu durant 7 jours, après un traumatisme sonore par bruit d'arme, accélère la récupération et préserve en partie la survie des cellules ciliées auditives. La seconde étude porte sur l'efficacité du magnésium à long terme (1 mois) administré par voie systémique. Le magnésium durant un mois est le traitement le plus efficace en termes de préservation des cellules ciliées. La dernière étude s'intéresse à la mort des cellules ciliées consécutive au traumatisme sonore. La mort cellulaire apparaît dans les 24 premières heures après l'exposition au bruit (bruit d'arme/bruit continu). Suite à ce résultat, deux traitements utilisant des anti-apoptotiques (leupeptine et z-VAD-FMK) ont été testés par voie intra-cochléaire directe 1 heure après le traumatisme et leur diffusion a duré 7 jours. L'efficacité du traitement a été évaluée sur la fonctionnalité des cellules auditives (audiogrammes) et sur la survie de ces cellules en fin d'expérimentation (histologie, comptage des cellules apoptotiques). L'administration intra-cochléaire de z-VAD-FMK de façon continue pendant 7 jours après un traumatisme sonore par bruit d'arme accélère la récupération auditive et permet la survie des cellules ciliées. A contrario, la leupeptine n'a pas été efficace dans notre modèle. Ces résultats suggèrent qu'une des premières étapes dans la physiopathologie du traumatisme sonore par bruit d'arme implique la mort des cellules ciliées par la voie des caspases plutôt que par la voie des calpaines. Les inhibiteurs de caspases sont donc de bons candidats thérapeutiques pour limiter les pertes cellulaires consécutives au bruit d'arme. Les résultats de ce travail de thèse permettent de mieux comprendre la physiopathologie auditive après traumatisme sonore par bruit d'arme et d'évaluer les différentes fenêtres thérapeutiques afin de tirer la meilleure stratégie utilisable chez l'Homme.
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Rôle du transporteur vésiculaire du glutamate de type 3 (VGLUT3) dans la réponse au stress hypoxique néonatal et la surdité DFNA25 / Atypical vesicular glutamate transporter type 3 (VGLUT3) function in the response to neonatal hypoxic stress, and the DFNA25 deafnessMiot, Stéphanie 24 February 2017 (has links)
Avant d'être libéré dans la fente synaptique, le glutamate est accumulé dans les vésicules présynaptiques par les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Il existe 3 types de VGLUTs. VGLUT3 possède une distribution anatomique et des fonctions atypiques. Au sein du système nerveux central, VGLUT3 est exprimé dans des neurones glutamatergiques mais aussi non glutamatergiques, dans lesquels il assure les fonctions de co-transmission ou de synergie vésiculaire. On le retrouve notamment dans certains neurones sérotoninergiques du raphé. Au sein de l'oreille interne, VGLUT3 est l'unique VGLUT décrit dans les cellules ciliées internes (CCI). La sérotonine joue un rôle essentiel dans le contrôle respiratoire néonatal. En étudiant la respiration de souriceaux n'exprimant plus le VGLUT3, nous avons démontré le rôle de VGLUT3 dans l'adaptation au stress hypoxique néonatal. Une mutation de VGLUT3 a été mise en évidence dans une surdité humaine très proche cliniquement de la presbyacousie et appelée DFNA25. En étudiant le phénotype auditif de souris exprimant cette mutation, nous avons prouvé l'implication de cette mutation dans l'atteinte des CCI à l'origine de la surdité DFNA25. L'étude des processus biochimiques mis en jeu nous a permis d'envisager un rôle indirect de VGLUT3 dans l'activation de la mort autophagique, via la protéine Becline 1 et une possible interaction au sein de la voie de la Culline 3. L'ensemble de ce travail nous a permis de mettre en évidence un rôle de VGLUT3 dans l'adaptation aux conditions extrêmes telles que le développement néonatal ou le processus de vieillissement. Il ouvre de nouvelles perspectives sur les diverses fonctions des VGLUTs. / Before its release into synaptic cleft, glutamate is accumulated in presynaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs). There are 3 types of VGLUTs. VGLUT3 presents atypical functions and anatomical distribution. In the central nervous system, VGLUT3 is expressed in glutamatergic and non glutamatergic neurons, in which it performs the co-transmission and the vesicular synergy. Particularly, we can observe VGLUT3 in serotoninergic neurons of raphe. In the inner ear, VGLUT3 is the unique VGLUT described in the inner hair cells (IHCs). Serotonin plays a key role in the neonatal respiratory control. By exploring the respiration of VGLUT3 knock out mice pumps, we have demonstrated the role of VGLUT3 in the response to neonatal hypoxic stress. One VGLUT3 mutation has been described in a human deafness clinically very close to presbycusis, the DFNA25 deafness. By studying the auditory phenotype of mice expressing this VGLUT3 mutation, we have proved the implication of this mutation in the IHCs impairment at the origin of DFNA25 deafness. Biochemical analysis have helped us to consider an indirect role of VGLUT3 in the autophagic death. Beclin 1 and a possible interaction between VGLUT3 and the Cullin3 pathways could be implicated. All of our results allowed us to highlight a role of VGLUT3 in the adaptation to extreme conditions like neonatal development or aging process. They open new perspectives on the various functions of VGLUTs.
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Mesures non invasives de l'activité electrophysiologique des cellules sensorielles et des neurones auditifs. Applications au diagnostic de pathologies de l'oreille interne. / Noninvasive measurements of the electrophysiological activity of sensory cells and auditory neurons. Applications to the diagnosis of diseases of the inner ear.Gerenton, Grégory 07 December 2015 (has links)
Grâce à la miniaturisation de la technologie ainsi qu'a l'augmentation constante des capacités de calcul numérique, les méthodes objectives et les appareils de mesures de la physiologie auditive évoluent. C'est dans l'optique de créer de nouveaux outils diagnostics que la société Echodia a été créée en 2009. Celle-ci finance aujourd'hui mes recherches sous convention CIFRE.Les présents travaux proposent, dans une première partie, de présenter comment deux méthodes de mesures non invasives ont été mises en oeuvre pour être applicables au diagnostic de l'hydrops cochléaire. Les méthodes sont basées sur le fait que les réponses des cellules ciliées de la cochlée à des stimuli sonores dépendent de la position au repos de leur touffe de stéréocils. Or, l'hydrops cochléaire, l'une des principales caractéristiques de la maladie de Menière, est susceptible de venir perturber cet environnement. Une variation chimique ou mécanique de celui-ci peut ainsi être mise en évidence par différentes méthodes d'exploration objectives. La première est basée sur un enregistrement électrophysiologique. En étudiant le Potentiel de sommation (SP) de l'ÉlectroCochléoGraphie (ECochG), nous allons recueillir une image du tour basal de la cochlée. La deuxième méthode est basée sur un enregistrement acoustique dans le méat acoustique externe. En monitorant le déphasage des Produits de distorsion desoto-émissions acoustiques (DPOAE), nous allons enregistrer les réponses du tour apical de la cochlée.La deuxième partie est consacrée à une étude au cours de laquelle nous avons enregistré de manière concomitante le SP (basal) ainsi que le DPOAE (apical) chez 73 patients souffrant de vertiges de Menière, à proximité d'une attaque (n = 40) ou entre les attaques, sans symptômes cliniques (n = 33). Dans le cas des DPOAE, c'est la phase du produit de distorsion (PDA) à 2*f1-f2 qui a été étudiée en réponse à des sons stimulants de fréquence f1 = 1 kHz et f2 = 1,2 kHz. La puissance des deux fondamentaux a été fixée entre 70 et 75dB SPL en fonction du niveau du DPOAE. Le rapport entre SP et le Potentiel d’action global (AP) a, quant à lui, été mesuré de manière extra-tympanique en réponse à des clics de 95dB nHL. Ces deux mesures ont été effectuées plusieurs fois pendant un test de posture afin d'évaluer leur stabilité.Les limites normales de déphasage du DPOAE en réponse à la posture [-18 °, +38 °] ont été dépassées chez 75% des patients étant venus consulter à proximité d'une crise. Sur ces mêmes sujets, l'étude du ratio entre SP et AP a dépassé la valeur normale (<0,40) dans 60% des cas. De plus, chez les patients à proximité d'une crise de vertige, les deux types de mesures révèlent des fluctuations entre deux répétitions. Ces écarts mettent en évidence combien l'hydrops entrave le bon fonctionnement de la mécanique cochléaire. Le fait de constater des variations sur des échelles de temps aussi courtes pourrait expliquer la sensibilité imparfaite des tests diagnostics. En effet, les protocoles de mesure du SP ou des DPOAE nécessitent un moyennage des acquisitions qui, par définition, a tendance à niveler les fluctuations transitoires. / Thanks to technology miniaturization as well as digital computing abilities steadily increasing, objective measurement methods and their related devices evolve. Echodia company was created in 2009 with the goal to create new diagnostic tools. The company currently supports my research work through a CIFRE convention.The first part of this thesis presents two non-invasive measurement methods that have been implemented to the diagnosis of cochlear hydrops. The methods are based on the responses of cochlear hair cells to sound stimuli, depending themselves on the resting position of their stereocilia bundles. Cochlear hydrops, a hallmark of Meniere's disease, is likely to disturb this environment. A chemical or mechanical variation of this environment may be observed by various objective exploration methods. The first method is based on an electrophysiological recording. By studying the Summating Potential (SP) of the Electrocochleography (ECOG) we will register activity in the basal part of the cochlea. The second method is based on a sound recording in the external acoustic meatus. By monitoring the phase shifts of Distortion-Product OtoAcoustic Emissions (DPOAE), we will record the apical responses of the cochlea.The second part of this thesis focuses on a study in which we recorded concomitantly the SP (basal) and the DPOAE (apical) in 73 patients with Menière's disease, close to an attack (n = 40) or between attacks without clinical symptoms (n = 33). In the case of DPOAE, the phase at 2*f1-f2 has been studied in response to pure sinusoidal sounds at frequency f1 = 1 kHz and f2 = 1,2 kHz. The power of the two primary was set between 70 and 75dB SPL based on the level of the DPOAE. The SP to Action Potential (AP) ratio has been measured by extra-tympanic electrode in response to 95dB nHL clicks. These two measurements were performed several times during a postural test to evaluate their stability.The normal limit of the phase shift of the DPOAE during a postural test [-18 °, +38 °] was exceeded in 75% of patients near an attack. On these subjects, the study of the SP/AP ratio exceeded the normal value (<0.40) in 60% of cases. In addition, the two types of measurements made on patients near a vertigo attack reveal fluctuations between reiteration. These differences highlight how hydrops hinders the proper functioning of the cochlear mechanics. This short time scales fluctuations might explain the imperfect diagnostic sensitivity of SP and DPOAE tests, as averaging procedures would tend to level out transient fluctuations characteristic of hydrops.
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Génération de progéniteurs otiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) : application à la thérapie cellulaire dans l'oreille interne / Generation of otic progenitors from human induced pluripotent stem cells : cell-based therapy for inner earLahlou, Hanae 09 October 2017 (has links)
La surdité neurosensorielle est définie par une atteinte de l’oreille interne, il résulte principalement d’une perte de cellules ciliées (CC). Chez les mammifères, ce processus est malheureusement irréversible. Le développement de la thérapie cellulaire a fait naître de nouveaux espoirs pour le traitement des surdités neurosensorielles. Les cellules souches d’origine embryonnaire ou adulte seraient capables de se différencier in vitro en progéniteurs otiques et de restaurer partiellement les fonctions auditives in vivo après transplantation. Cependant, les protocoles de différenciation in vitro des CC à partir de cellules souches sont insatisfaisants, et les signaux qui contrôlent ce phénomène restent mal connus. Ainsi, l’objectif de ce travail de thèse était d’étudier in vitro la différenciation des CC à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous nous sommes intéressés à deux voies de signalisation majeures impliquées dans le développement de l’oreille interne in vivo, la voie Notch et la voie Wnt. Dans une première partie, nous avons montré que l’inhibition tardive de la voie Notch favorise la différenciation des hiPSC en CC. Dans une seconde partie, nous avons étudié le rôle de la voie Wnt dans la différenciation des hiPSC en cellules otiques. Nos résultats indiquent que l'inhibition de la voie Wnt durant la première phase d’induction favorise l'expression des marqueurs de la placode otique et initie la spécification des CC.Les travaux présentés dans cette thèse améliorent ainsi les protocoles de différenciation des hiPSC et suggèrent que ce type de cellules serait parfaitement adapté pour traiter les surdités neurosensorielles. / Neurosensory hearing loss is associated to inner ear disorders and degeneration of hair cells (HCs). Unfortunately, this process is irreversible in mammals. Currently, no curative treatment allows these cells to regenerate. For this reason, the development of cell therapy arose new hopes for the treatment of neurosensory hearing loss. Stem cells, either of embryonic or adult origin, seem able to differentiate in vitro into otic progenitors and to partially restore auditory functions in vivo. However, current protocols for in vitro differentiation of stem cells into HCs are unsatisfactory, and the signals that control this phenomenon remain poorly understood. Thus, the objective of this thesis was to study in vitro HC differentiation from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). We were particularly interested in two major signaling pathways involved in vivo in inner ear development, the Notch and Wnt signaling pathways.In a first part, we demonstrated that Notch inhibition during late otic differentiation enhances hiPSC differentiation into hair cell-like cells. In a second part, we studied the role of the Wnt signaling pathway during otic induction and HC specification. Our results indicate that Wnt inhibition during early otic induction promotes the expression of otic placode markers and initiate HC specification. The work presented here thus propose improved protocols to obtain HCs from hiPSCs, and suggest that this cell type is perfectly adapted for the treatment of neurosensory hearing loss.
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Biologie des cellules souches cochléaires : perspectives dans le traitement de la surdité sensorielle / Stem cell biology of the inner ear : potential therapeutic application of sensory deafnessSavary, Etienne 14 December 2010 (has links)
La destruction des cellules ciliées de la cochlée entraine des surdités sensorielles. Chez les mammifères ces cellules ne se régénèrent pas et les déficits auditifs occasionnés sont définitifs. Aucune thérapie visant à remplacer les cellules ciliées détruites n'est actuellement proposée.L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement d'une thérapie cellulaire basée sur la greffe de cellules souches / progénitrices cochléaires et destinée à promouvoir la régénération des cellules ciliées.Au cours de nos travaux, nous avons isolé une population de cellules souches cochléaires chez des souris néonatales appartenant à la « side population » (Savary et al. 2007). Nous avons également montré, par des expériences de perte et de gain de fonction in vitro, que la voie de signalisation Notch est nécessaire pour l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules (Savary et al., 2008). Des lignées de souris transgéniques exprimant la GFP sous le promoteur de la GFAP et de la Nestine nous ont permis de suivre l'expression de ces marqueurs de cellules souches dans des cochlées de souris P3 et adultes. En étudiant l'expression combinée d'autres marqueurs comme Sox2 et Abcg2, nous avons montré que les cellules progénitrices cochléaires sont réparties différemment chez les souris néonatales et les souris adultes (Smeti, Savary et al 2010).Nos expériences préliminaires de transplantation in vitro dans un modèle murin de surdité génétique humaine de type DFNA15 démontrent que les cellules souches / progénitrices greffées sont capables d'intégrer l'épithélium sensoriel lésé et de se différencier en cellules exprimant un marqueur de cellules ciliées. / The destruction of cochlear hair cells causes sensory deafness. In Mammals these cells do not regenerate and damages are irreversible. Currently, there is no proposed therapy to replace the destroyed hair cells.The focus of this thesis is to develop a novel cell therapy based on transplantation of cochlear progenitor cells in order to promote regeneration of hair cells.We first isolated a population of cochlear stem cells from neonatal mice by using the side population analysis technique (Savary et al. 2007). Then, we showed, by in vitro loss and gain of function experiments, that the Notch signaling pathway is necessary for cellular self-renewal and differentiation (Savary et al., 2008).Transgenic mice strains expressing GFP under the control of GFAP and Nestin promotors allowed us to monitor the expression of these markers of stem cells in the P3 and adult mice cochleae. By studying the combined expression of other stem cells markers such as Sox2 and ABCG2, we showed that the niches of cochlear progenitor cells are differently distributed in neonatal and adult mice (Smati, Savary et al 2010).Our preliminary in vitro transplantation experiments in a mouse model that mimics human genetic deafness DFNA15 show that the transplanted stem / progenitor cells are able to migrate to the lesion site, to integrate the damaged sensory epithelium and to differentiate into cells expressing a marker of hair cells.
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The effect of Nystatin on the inner ear : an experimental guinea pig studyWoods, Owen 08 1900 (has links)
Objectifs:
Le Nystatin est un antibiotique efficace pour le traitement d’otomycose. Bien que sa
sécurité au niveau de l’oreille externe soit bien établie, son utilisation n’est pas
recommandée lorsqu’il y a une perforation tympanique. L’objectif de cette étude est
d’évaluer le potentiel ototoxique du Nystatin lorsque celui-ci est appliqué directement au
niveau de l’oreille moyenne.
Méthodes:
Nous avons fait une étude expérimentale avec 18 cochons d’Indes de souche Hartley que
nous avons divisés en deux groupes. En exposant l’oreille moyenne de chaque animal au
Nystatin (groupe I) ou à la néomycine (groupe II) et chaque oreille controlatérale à une
solution physiologique (NaCl), la fonction auditive a été évaluée avec un test de
potentiels évoqués auditif du tronc cérébral avant et après les injections. Une étude par
microscopie électronique a permis une comparaison histologique de l’état des cellules
ciliées cochléaires entre les 2 groupes.
Résultats:
Les pertes auditives moyennes du groupe « Nystatin » étaient de 13.0 dB et comparables
aux pertes moyennes observées dans les oreilles ayant été injectées avec du NaCl (4.0 dB
dans le groupe I et 15.1 dB dans le groupe II). Le groupe de contrôle « néomycine » a
subi une perte auditive moyenne de 39.3 dB, ce qui représente une différence
cliniquement et statistiquement significative (p<0.001). L’étude histologique avec une
microscopie à balayage électronique a démontré une conservation de l’architecture des
cellules ciliées cochléaires dans les groupe Nystatin et NaCl. La néomycine a causé une
destruction marquée de ces structures.
Conclusions:
Le Nystatin ne provoque pas d’atteinte auditive ni de destruction des cellules ciliées
externes après injection directe dans l’oreille moyenne chez le cochon d’Inde. / Objective:
Nystatin is an effective topical antifungal agent widely used in the treatment of
otomycosis. Though it is safe for external ear use, current recommendations are to avoid
its use in cases of tympanic membrane perforation. The objective of our study was to test
the security of Nystatin when applied directly to the middle ear of a guinea pig model.
Methods:
We performed an experimental study with 18 Hartley guinea pigs that were divided into
two groups. Exposing middle ears from one group to Nystatin (group I) and from the
other to the ototoxic neomycin (group II), we compared results of auditory brainstem
response (ABR) testing at three intervals during the study. Each animal’s contralateral
ear was injected with a physiological solution (NaCl). At the end of the study, we
performed a histological analysis of the animals’ cochleae using a scanning electron
microscope.
Results:
Average hearing loss in the Nystatin group was 13.0 dB which was similar to the results
obtained in the NaCl-exposed ears (4.0 dB in group I and 15.1 dB in group II). Average
hearing loss in the neomycin group was 39.3 dB, which represents a clinically significant
difference (p<0.001). Scanning electron microscope evaluation revealed intact cochlear
hair cell architecture in the Nystatin and normal saline groups, compared to important
destruction in the neomycin group.
Conclusion:
Nystatin does not cause hearing impairment or cochlear hair cell damage when exposed
directly to the middle ear of a guinea pig model.
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Exploration du rôle des différents domaines C2 de l'otoferline et des isoformes des canaux calciques CaV1.3 dans la transmission synaptique des cellules ciliées auditives / Exploring the role of the various C2 domains of otoferlin and isoforms of calcium channels CaV1.3 in synaptic transmission of auditory hair cellsTertrais, Margot 19 December 2018 (has links)
L'encodage du signal acoustique en impulsions nerveuses se réalise au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée. Une dépolarisation déclenche l'exocytose des vésicules synaptiques suite à l'activation des canaux calciques CaV1.3 et à l'action d'un senseur calcique particulier, l'otoferline, une grande protéine se composant d'un domaine transmembranaire en C-terminal et de six domaines C2 (A-F) pouvant lier le Ca2+ et les phospholipides. Afin de caractériser le rôle de ces différents domaines C2, nous avons utilisé des vecteurs viraux (AAV) permettant l'expression de formes raccourcies de l'otoferline (mini-Otof) in vivo dans les CCI de souris dépourvues d'otoferline (Otof -/-). Nous montrons que les mini-Otof contenant les domaines C2-EF, C2-DEF ou C2-ACEF sont suffisantes pour restaurer l'exocytose rapide des CCI Otof -/-, sans toutefois restaurer l'audition car le recrutement des vésicules synaptiques reste altéré. Nous révélons pour la première fois la présence d'une endocytose ultra-rapide (t < 20 ms) dynamine- et otoferline-dépendante, une fonction certainement essentielle à l'homéostasie membranaire des CCI. L'expression des mini-Otof C2-EF et C2-DEF a également permis de restaurer partiellement la composante rapide de l'inactivation du courant calcique des CCI, celle-ci étant absente chez les souris Otof -/-. Cette inactivation rapide est réalisée par les isoformes courtes Cav1.3S qui ont leur partie C-terminale régulatrice tronquée, contrairement aux isoformes longues Cav1.3L dépourvues d'inactivation. Afin de différencier les rôles spécifiques de ces isoformes dans le cycle des vésicules synaptiques, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9, nous permettant d'éditer spécifiquement la partie C-terminale régulatrice des canaux Cav1.3L. Nos résultats montrent que les souris CRISPR-Cav1.3L présentent une surdité sévère expliquée au niveau des CCI par un défaut de recrutement vésiculaire aux zones actives, alors que les Cav1.3S inaltérés contrôlent la fusion rapide des vésicules synaptiques. / The precise encoding of acoustic signals into nerve impulses is achieved at the ribbon synapses of inner hair cells (IHC) of the cochlea. Exocytosis of synaptic vesicles by IHC is triggered by voltage-activation of Cav1.3 calcium channels and the action of a specific calcium sensor, otoferlin, a large protein with a single C-terminal transmembrane domain and six C2 (A-F) domains which binds Ca2+ and interacts with phospholipids. In order to characterize the function of the various otoferlin C2 domains, we used viral vectors (AAV) allowing the expression of shortened forms of otoferlin (mini-Otof), in vivo, in IHC from mice lacking otoferlin (Otof -/-). We show that mini-Otof containing C2-EF, C2-DEF or C2-ACEF domains are sufficient to restore fast synaptic vesicle exocytosis in Otof -/- IHC, but without restoring hearing because vesicular replenishment remains impaired. For the first time, we also uncover an ultra-fast endocytosis (t < 20 ms) dynamin- and otoferlin-dependant, a function that is certainly essential for a fast regulation of IHC membrane homeostasis. Furthermore, the expression of the mini-Otof C2-EF and C2-DEF also partially restored the fast component of the Ca2+ current inactivation in Otof -/- IHC. This rapid inactivation is carried out by Cav1.3S short isoforms which have a truncated C-terminal regulatory domain, unlike Cav1.3L long isoforms which display no inactivation. To characterize the specific role of these Cav1.3 isoforms, we used CRISPR-Cas9 technology, allowing a specific removal of the C-terminal regulatory part of the Cav1.3L channels in IHC. Our results show that CRSIPR- Cav1.3L mice display severe deafness explained at the IHC level by a defect in vesicular replenishment of the active zones, while Cav1.3S are sufficient to ensure fast and transient exocytosis of docked synaptic vesicles.
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The effect of Nystatin on the inner ear : an experimental guinea pig studyWoods, Owen 08 1900 (has links)
Objectifs:
Le Nystatin est un antibiotique efficace pour le traitement d’otomycose. Bien que sa
sécurité au niveau de l’oreille externe soit bien établie, son utilisation n’est pas
recommandée lorsqu’il y a une perforation tympanique. L’objectif de cette étude est
d’évaluer le potentiel ototoxique du Nystatin lorsque celui-ci est appliqué directement au
niveau de l’oreille moyenne.
Méthodes:
Nous avons fait une étude expérimentale avec 18 cochons d’Indes de souche Hartley que
nous avons divisés en deux groupes. En exposant l’oreille moyenne de chaque animal au
Nystatin (groupe I) ou à la néomycine (groupe II) et chaque oreille controlatérale à une
solution physiologique (NaCl), la fonction auditive a été évaluée avec un test de
potentiels évoqués auditif du tronc cérébral avant et après les injections. Une étude par
microscopie électronique a permis une comparaison histologique de l’état des cellules
ciliées cochléaires entre les 2 groupes.
Résultats:
Les pertes auditives moyennes du groupe « Nystatin » étaient de 13.0 dB et comparables
aux pertes moyennes observées dans les oreilles ayant été injectées avec du NaCl (4.0 dB
dans le groupe I et 15.1 dB dans le groupe II). Le groupe de contrôle « néomycine » a
subi une perte auditive moyenne de 39.3 dB, ce qui représente une différence
cliniquement et statistiquement significative (p<0.001). L’étude histologique avec une
microscopie à balayage électronique a démontré une conservation de l’architecture des
cellules ciliées cochléaires dans les groupe Nystatin et NaCl. La néomycine a causé une
destruction marquée de ces structures.
Conclusions:
Le Nystatin ne provoque pas d’atteinte auditive ni de destruction des cellules ciliées
externes après injection directe dans l’oreille moyenne chez le cochon d’Inde. / Objective:
Nystatin is an effective topical antifungal agent widely used in the treatment of
otomycosis. Though it is safe for external ear use, current recommendations are to avoid
its use in cases of tympanic membrane perforation. The objective of our study was to test
the security of Nystatin when applied directly to the middle ear of a guinea pig model.
Methods:
We performed an experimental study with 18 Hartley guinea pigs that were divided into
two groups. Exposing middle ears from one group to Nystatin (group I) and from the
other to the ototoxic neomycin (group II), we compared results of auditory brainstem
response (ABR) testing at three intervals during the study. Each animal’s contralateral
ear was injected with a physiological solution (NaCl). At the end of the study, we
performed a histological analysis of the animals’ cochleae using a scanning electron
microscope.
Results:
Average hearing loss in the Nystatin group was 13.0 dB which was similar to the results
obtained in the NaCl-exposed ears (4.0 dB in group I and 15.1 dB in group II). Average
hearing loss in the neomycin group was 39.3 dB, which represents a clinically significant
difference (p<0.001). Scanning electron microscope evaluation revealed intact cochlear
hair cell architecture in the Nystatin and normal saline groups, compared to important
destruction in the neomycin group.
Conclusion:
Nystatin does not cause hearing impairment or cochlear hair cell damage when exposed
directly to the middle ear of a guinea pig model.
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L’organisation spatiale des canaux calciques cav1.3 détermine l’efficacité de l’exocytose des synapses à ruban dans les cellules ciliées de l’oreille interne / Spatial organization of the Cav1.3 channels underlies the exocytosis efficiency of hair cell ribbon synapses in the inner earVincent, Philippe 16 December 2015 (has links)
Les cellules ciliées internes (CCIs) de la cochlée encodent les signaux acoustiques en impulsions électriques au niveau des synapses à ruban formées avec les fibres afférentes du nerf auditif. L'exocytose des vésicules glutamatergiques par les CCIs est déclenchée par l'activation des canaux calciques Cav1.3 et par l'otoferline, le senseur calcique intracellulaire présumé. Les mécanismes moléculaires précis régulant cette exocytose restent encore mal compris, notamment ceux à l’origine de sa précision temporelle, sa vitesse élevée en phase avec le signal acoustique("phase-locking" jusqu'à 1-2 kHz) et son infatigabilité. Nous montrons que la spécificité des synapses à ruban auditive et vestibulaire passe par une organisation spatiale spécifique des canaux Cav1.3 dans les zones actives. Les CCIs utilisent différentes isoformes de canaux Cav1.3, notamment des isoformes courtes tronquées dans leur partie C-terminale. Ces isoformes courtes (Cav1.343S et Cav1.342A) sont essentiellement impliquées dans le déclenchement et dans l'adaptation rapide de l'exocytose. Cette adaptation se réalise au niveau des canaux Cav1.3 à la fois en intracellulaire par le Ca2+ et en extracellulaire parles protons secrétés lors de l'exocytose. Les isoformes longues (Cav1.342L et Cav1.3∆44),positionnées en périphérie du ruban, réguleraient le recrutement vésiculaire. Par ailleurs, nous montrons que l'organisation spatiale des canaux Cav1.3 est dépendante d'un cytosquelette d'actine-F au ruban synaptique. La clarine 1 (protéine Usher IIIA) interagirait avec l'actine-F, l'harmonine (protéine PDZ, Usher IC) et la sous-unité β2 des canaux calciques pour organiser les canaux Cav1.3 dans les zones actives. / Cochlear inner hair cells (IHCs) encode acoustic signals into nerve impulses at their ribbon synapses formed with the auditory afferent fibers. The exocytosis of glutamatergic vesicles is triggered by voltage activation of Cav1.3 channels and requires otoferlin, the putative intracellular Ca2+ sensor. The precise molecular mechanisms of exocytosis still remain elusive, notably the mechanisms allowing the temporal precision, the high rates of vesicular fusion (high frequency phase-locking with sound) and the indefatigability of the process. We show here that exocytosis in auditory and vestibular hair cells relies on a specific tight spatial organization of Cav1.3 channels at the active zones. Auditory IHCs use different Cav1.3isoforms, notably short C-terminal isoforms (Cav1.343S et Cav1.342A). These short Cav1.3isoforms essentially trigger the RRP exocytosis (Readily Releasable Pool of vesicles) and are at the origin of its fast adaptation. This fast exocytotic adaptation is based both on an intracellularCa2+ dependant inactivation of the Ca2+ current and on its extracellular block by exocytosed protons. Long Cav1.3 isoforms (Cav1.342L et Cav1.3∆44) regulate the vesicular recruitment at the active zones. Furthermore, our results show that a synaptic actin cytoskeleton is essential for the tight spatial organization of the Cav1.3 channels at the ribbons. Clarin 1 (Usher IIIA protein),through its interactions with the F-actin network, harmonin (PDZ protein, Usher IC) and the Ca2+channel β2 subunit, is required to maintain the tight organization of Cav1.3 channels at the ribbon synapses.
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