Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09617.pdf: 5595560 bytes, checksum: 5a054c653d88ec87b2d3c979b79b00b5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Dissertacao [Mestrado] / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:00/09008-4

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:48:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09618.pdf: 4753745 bytes, checksum: f0c21d288bbe1bd9370a02c1b417d561 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:00/08457-0

The overarching objective of this thesis was the development of an improved expression cell line for recombinant proteins, in which a transgene of interest can be inserted into a highly active gene locus using recombinase mediated cassette exchange. Random integration of transgenic DNA is a common route to achieve transgene expression. However, randomly integrated transgenes are susceptible to gene silencing over time, and do not show stable expression for extended periods in culture. Furthermore, every new cell clone generated requires regulatory approval. The improvement of expression strategies may significantly reduce the time required to bring novel recombinant protein products to the market. In order to identify a suitable expression locus for the integration of transgene expression cassettes, total protein samples were derived from the production cell lines HEK293 and CHO. Highly expressed proteins were isolated via 2D PAGE, and identified via peptide mass fingerprinting. Their promoter regions were then validated to express a recombinant transgene in HEK293 cells. The long term stability of these promoter regions was also assessed. Direct gene targeting of the highly active gene loci may or may not be possible in typical producer cell lines. Targeting of a murine homologue to these highly expressed CHO/HEK293 loci may be more efficient in a murine stem cell line. The transfer of a modified allele from HM1 murine embryonic stem cells, into a somatic cell line (HC11) was demonstrated in this thesis. These validated methods were then explored for the generation of viable HM1-HEK293 and HM1-CHO fusion hybrids. For these experiments, a fluorescence based fusion assay was generated, validated and used for in-situ monitoring of the cell fusion process. The random integration of transgenic DNA into mammalian genomes typically results in a highly unpredictable integration architecture. RMCE at such loci would be inefficient. However, a highly efficient RMCE reaction at (rare) single copy transgene integrations, may be possible under the correct conditions. RMCE at randomly integrated loci could therefore be more beneficial (for transgene expression) than random integration alone. This thesis explores this concept with the use of a randomly integrated RMCE platform, and subsequent selection of cell lines post RMCE attempts at these loci CRISPR/Cas9 technology was also applied to a highly expressed locus in HEK293 cells. A framework for successful direction of double strand breaks to a defined locus is demonstrated in this work. The methods used to achieve this can therefore be built upon for the homologous recombination of a transgenic cassette, into a highly expressed locus in HEK293 cells. Monoclonal antibodies have dominated the biologics market for over two decades, and mammalian expression systems are well suited to their production. The work in this thesis attempts to raise and verify antibody molecules against a potential tumour marker using hybridoma and phage display technologies.

Os estudos da biotransformação têm-se mostrado um método eficiente para reações que envolvam a obtenção de compostos com interesse comercial. Dentre estes produtos utilizados podemos destacar monoterpenos por constituírem uma variedade de compostos com grande aplicação tanto no âmbito farmacêutico, como em perfumes, cosméticos e alimentos. As suspensões de células vegetais e os fungos filamentosos têm sido largamente usados em reações de biotransformação destes metabólitos secundários como substratos exógenos. A habilidade das culturas celulares e fungos em transformar tais compostos vêm sendo dirigidos principalmente para a obtenção de derivados oxigenados de maior valor agregado, principalmente visando à produção de flavorizantes, aromatizantes e fragrâncias. As suspensões de células vegetais apresentam sistemas enzimáticos mais complexos, podendo levar a produtos específicos, enquanto os microrganismos, por serem mais simples e de crescimento mais rápido, geralmente promovem mais rapidamente a metabolização dos substratos.Neste contexto, o presente trabalho descreve a investigação do potencial de bioconversão dos monoterpenos (R)-(+)-α-pineno, (S)-(-)-α-pineno e (S)-(-)-β- pineno, bem como do óleo de terebentina, para avaliação de suas potencialidades frente a reações de biotransformação mediadas pelos microrganismos Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Mortierella isabellina NRRL 1757 e Cunninghamella elegans ATCC 36112 e por suspensões de células vegetais de Catharanthus roseus. Todos os sistemas estudados mostraram habilidade na bioconversão dos substratos testados. / Biotransformation has been an efficient method to obtain important commercial compounds such as monoterpenes, that have a range of applications in the pharmaceutical, perfumery, cosmetics and food industries. Plant cell cultures and filamentous fungi suspensions have been widely used in biotransformation reactions of monoterpenes as exogenous substrates. The ability of the cells and fungi cultures to transform these compounds has being mainly used for the synthesis of oxygenated derivatives aiming at the production of flavours and fragrances. The plant cell cultures suspensions have complex enzymatic systems with the production of specific compounds, where as filamentous fungi, which are structurally simpler and fast growing, can promote quicker transformations reactions. In this context, the present work describes the evaluation of bioconversion of the monoterpenes (R)-(+)-α-pinene, (S)-(-)-α-pinene, (S)-(-)-β-pinene, as well as turpentine oil using the filamentous fungi suspensions of Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 36112 and Mortierella isabellina NRRL 1757, aswer as Catharanthus roseus plant cell cultures. All evaluated systems were capable of bioconverting the studied substrates. The main product obtained from pinenes and turpentine oil was α-terpineol.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11302.pdf: 6104294 bytes, checksum: 2f6603857241226128098a3cdc3f54ff (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Intituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares, IPEN/CNEN-SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de Sao Paulo

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:28:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:57:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A proteína ribossomal L10 (RP L10) é uma forte candidata a ser incluída na classe de proteínas supressoras de tumor. Também denominada QM, a proteína em questão é conhecida por participar da ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e da tradução de mRNAs. Possui massa molecular entre 24 a 26 kDa e ponto isoelétrico (pI) 10,5. A seqüência da proteína QM é bastante conservada em mamíferos, plantas, invertebrados, insetos e leveduras indicando que esta possui funções críticas na célula. Com função supressora de tumor, a proteína RP L10 foi estudada em linhagens de tumor de Wilm (WT-1) e em células tumorais de estômago, nas quais se observou uma diminuição na quantidade de seu mRNA. Mais recentemente a RP L10 foi encontrada em baixas quantidades nos estágios iniciais de adenoma de próstata e com uma mutação em câncer de ovário, indicando uma participação no desenvolvimento destas doenças. Como proteína, já foi descrito que esta interage com as proteínas c-Jun e c-Yes, inibindo a ação ativadora de fatores de crescimento e divisão celular. Este trabalho tem um papel importante no estabelecimento da expressão desta proteína solúvel, para estudos posteriores que tenham como objetivo avaliar a ação de regiões específicas que atuam na ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e tradução, bem como nas regiões que se ligam a proto-oncogenes. O cDNA para proteína QM foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão periplásmica p3SN8. A proteína QM foi expressa em E.coli BL21 (DE3) no citoplasma e periplasma bacteriano e na melhor condição, a expressão de QM de bactérias transformadas pelo plasmídeo recombinante p1813_QM em 25°C ou 30°C, a proteína foi obtida solúvel e com quantidad es muito pequenas de contaminantes. Os ensaios de estrutura secundária demonstraram que a proteína QM tem predominância de a-hélice, mas quando do seu desenovelmento, essa condição muda e a proteína passa a ter característica de folhas β. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 14895.pdf: 128255 bytes, checksum: b109d80327bca50afc1ea57cd36c5194 (MD5) / Epitélios confluentes de queratinócitos autólogos, cultivados segundo metodologia padronizada por Rheinwald e Green em 1975, têm sido usados como enxertos em diferentes situações clínicas. Contudo, a presença de componentes xenobióticos empregados nesta metodologia implica na possibilidade de transmissão de zoonoses, príons e viroses aos pacientes, além de envolver questões éticas relacionadas à utilização de animais. Tais preocupações têm direcionado pesquisadores a buscar alternativas que superem este impasse; no entanto, as formulações obtidas até o momento não são completamente satisfatórias. Assim, nossa proposta neste estudo, foi omitir ou substituir os componentes xenobióticos tradicionalmente utilizados no meio para queratinócitos, por similares humanos. Como resultado, padronizamos um meio de cultura onde omitimos o emprego de toxina colérica, substituímos o soro fetal bovino por lisado de plaquetas humanas na concentração de 2,5% e a insulina de origem bovina foi substituída por insulina recombinante humana na mesma concentração do método original (5 μg/mL). Com os resultados obtidos foi possível concluir ser viável o cultivo de queratinócitos humanos, mantidos em meio de cultura livre de componentes xenobióticos. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09992.pdf: 4690836 bytes, checksum: 0c8fe8bfd81500f9e75841feace3eaa7 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP