La réversion tumorale est un processus de transformation cellulaire peu fréquent qui s’explique par le rétablissement du contrôle de la croissance cellulaire aboutissant au phénotype cellulaire normal. Plusieurs agents sélectifs (virus, produits chimiques, interféron) peuvent être utilisés pour provoquer ce phénomène. L’efficacité de ces thérapies dépend de l’agressivité des cellules à traiter et les gènes qui sont bloqués. Les cellules HeLa et SiHa sont des lignées cellulaires utilisées fréquemment comme modèle in vitro pour étudier le cancer du col utérin. Ces deux lignées cellulaires comportent des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH) à haut risque de type 18 pour les cellules HeLa et de type 16 pour les cellules SiHa. Les oncoprotéines virales E6 et E7 bloquent les protéines suppresseurs de tumeur p53 et pRb respectivement ce qui entraîne la transformation en cellules cancéreuses. La réactivation de la protéine p53 et/ou de la protéine pRb ou d’autres types de protéines effectuée par des agents sélectifs oncosuppressifs peut renormaliser le cycle cellulaire. L’étude proposée pour cette thèse vise à étoffer la littérature scientifique afin d’expliquer la faisabilité d’établir un modèle in vitro qui serait exploité pour 1) déterminer si la réversion tumorale a lieu de manière spontanée dans les cellules HeLa et SiHa, 2) comprendre les effets de différentes thérapies pouvant entraîner la réversion tumorale des cellules cancéreuses du col utérin et 3) comprendre le mécanisme d’action des thérapies oncosuppressives dans le contexte de la réversion tumorale du cancer du col utérin.

Les méthodes classiques de traitement contre le cancer, telle que la chimiothérapie (CT), sont utilisées dans le but d'enrayer la tumeur. L'Adriamycine (ADR ou doxorubicine), un agent anticancéreux, agirait entre autres en s'intercalant entre les bases d'ADN, en inhibant la topoisomérase II et en causant la production de stress oxydatif. Plusieurs effets secondaires indésirables seraient reliés à l'utilisation de ADR comme par exemple la cardiotoxicité à des doses cumulatives de 500 mg/m². Une autre limite importante du traitement de CT est la résistance pléiotropique aux médicaments (MDR), qui peut être causée entre autres par la surexpression de protéines de résistance aux médicaments tel que la MRP, Les protéines MRP, comme la MRP l, expulseraient ADR hors des cellules tumorales ce qui diminuerait son efficacité et nécessiterait l'élévation de la dose optimale de traitement, causant ainsi une augmentation de la toxicité aux tissus sains. L'hyperthermie (HT) qui consiste à élever artificiellement la température tumorale (40 à 45°C), permettrait de contourner ce phénomène MDR et ciblerait les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. HT sensibiliserait les cellules résistantes et non résistantes aux agents anticancéreux, en augmentant la perméabilité membranaire, l'accumulation intracellulaire des agents de CT, et en inhibant la réparation de l'ADN. CT et HT mèneraient à la mort des cellules cancéreuses par activation de l'apoptose. Cependant, les mécanismes apoptotiques spécifiquement impliqués dans la mort des cellules cancéreuses lors de traitement par ADR et/ou HT ne sont pas entièrement connus et ont tenté d'être éclaircis dans le cadre de ce projet tant chez les cellules d'adénocarcinomes cervicaux non résistants (HeLa) que résistants (HeLa MRP+). Dans cette étude, la voie du récepteur de mort Fas a été la voie apoptotique d'intérêt. C'est pourquoi l'implication des différentes protéines apoptotiques de cette voie ont été étudiées comme le récepteur Fas ainsi que son ligand (FasL), la protéine adaptatrice de domaine de mort associée à Fas (FADD), les caspases 8 et 3. De plus, la recherche des causes d'activation de la voie du récepteur Fas a mené à l'investigation des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Lors de la présente étude, une augmentation de l'expression membranaire de FasL, de FADD ainsi que de l'activité de la caspase 8 ont été observées suite au traitement par ADR (après 1, 2 et 8 h respectivement). Les résultats obtenus montrent une activation précoce de la voie des récepteurs de mort après 1 à 2 h, contrairement à celle de la voie mitochondriale qui serait plus tardive après 18 h. La phase d'exécution de l'apoptose se produit après 18 h d'exposition. La quantification des ROS chez les HeLa exposées à ADR a montré que l'anion superoxyde (O2°-) serait le ROS principalement produit. Cette production pourrait activer la voie des récepteurs de mort puisqu'elle serait la cause de l'augmentation de l'expression de FasL. En effet, l'ajout d'un antioxydant (Mn TBAP) mène à l'inhibition de la production d'O2°-, de l'expression de FasL et diminue l'activité de la caspase 8. Les résultats démontrent également que l'utilisation de HT favoriserait l'apoptose des cellules HeLa et HeLa MRP+ exposées à ADR, via un mécanisme apoptotique induit par l'augmentation de la production d'O2°-. Les résultats obtenus ont permis de mieux comprendre les mécanismes apoptotiques impliqués par l'exposition à l'ADR et/ou HT. La compréhension de ces mécanismes est critique dans le développement de nouvelles stratégies, visant à augmenter l'efficacité des traitements contre le cancer. De plus, cette étude démontre également que HT peut augmenter l'efficacité du traitement par l' ADR en sensibilisant les cellules cancéreuses résistantes et non résistantes. Ce qui fait de HT, un traitement adjuvant prometteur qui permettrait de contrer le phénotype MDR et d'augmenter l'efficacité du traitement de CT, tout en diminuant les doses optimales, la toxicité aux tissus sains et les effets secondaires indésirables qui compromettre sérieusement la qualité de vie du patient. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chimiothérapie, Adriamycine, Résistance pléiotropique aux médicaments, MRP1, Hyperthermie, Apoptose.

Les maladies pulmonaires graves touchent plus de 3 millions de Canadiens, indépendamment de leur âge ou de leur sexe. Parmi ces maladies, nous retrouvons l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le cancer du poumon et la fibrose kystique. Ces dernières peuvent être déclenchées par la présence chronique d'un stress oxydatif et par conséquent, elles font partie des pathologies associées à une exposition à l'acroléine. On retrouve l'acroléine dans notre alimentation et dans les produits de combustion organique. L'acroléine, un aldéhyde alpha,beta-insaturé très réactif, est également une des substances toxiques qui résulte de la peroxydation des lipides endogènes, lors d'un stress oxydatif. Notre laboratoire a évalué les mécanismes toxiques de l'acroléine induits in vitro, en utilisant la lignée cellulaire A549. Le choix de ce modèle cellulaire pour l'étude provient du fait qu'elles sont des cellules humaines, d'origine pulmonaire, soit le premier organe ciblé par une exposition à l'acroléine. Cette étude vise donc à comprendre les mécanismes impliqués dans l'induction de la mort cellulaire par apoptose: 1) la voie des récepteurs de mort, 2) la voie du « cross-talk » et 3) la voie mitochondriale induites par l'acroléine. L'exposition des cellules A549 à des doses d'acroléine de 0 à 50 µM a activé la voie des récepteurs de mort. L'acroléine a causé une augmentation d'expression du ligand FasL (FasL) et a induit la translocation de la protéine associée au domaine de mort de Fas (FADD) et du récepteur de protéine (RlP) à la membrane cytoplasmique, en plus de l'activation des caspases initiatrices 2 et 8. Par ailleurs, cette exposition a causé une augmentation du domaine interagissant par BH3 tronqué (tBid) à la mitochondrie. Il semble que l'acroléine peut déclencher la voie du « cross-talk » par l'activation des caspases-2 et -8, qui clivent la protéine Bid en tBid. Pour ce qui est de la voie mitochondriale, l'acroléine a causé une hyperpolarisation de la membrane mitochondriale et une surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Notre étude a aussi démontré que l'acroléine a induit l'activation de p53, la translocation de la protéine X associée à Bcl-2 (Bax) à la mitochondrie, le relâchement du cytochrome c dans le cytosol, l'activation de la caspase initiatrice 9 et la translocation du facteur inducteur d'apoptose (AlF) au noyau. De plus, l'inhibition des ROS générées par l'acroléine grâce à l'antioxydant PEG-catalase, a empêché l'augmentation de l'expression totale du FasL, l'hyperpolarisation de la membrane mitochondriale ainsi que l'activation des caspases -3 et -8. Par conséquent, les ROS sont préalablement requises pour que l'acroléine induise l'apoptose par la voie des récepteurs de mort et par la voie mitochondriale, chez les cellules A549. En conclusion, l'acroléine peut induire les trois voies apoptotiques étudiées chez ces cellules. L'acroléine provoque l'exécution de l'apoptose via l'activation des caspases effectrices -3, -6 et -7, l'externalisation de la phosphatidylsérine, la condensation de la chromatine et le clivage de la polyADP-ribose polymérase (PARP). Par contre, l'acroléine induit aussi certains mécanismes de survie cellulaire comme l'augmentation de la phosphorylation d'AKT, de Bad et de l'expression des clAP 1/2. Même si les protéines antiapoptotiques sont activées, l'acroléine peut encore induire la mort cellulaire par apoptose chez les cellules A549. Ces recherches sont pertinentes dans plusieurs contextes de toxicité à l'acroléine tels que l'action pharmacologique et/ou les effets secondaires de la cyclophosphamide, un agent anticancéreux où l'acroléine est l'un de ses métabolites, la régulation de la prolifération cellulaire et de la croissance tumorale par les polyamines, la maladie d'Alzheimer, ainsi que la toxicité causée par les expositions environnementales à de faibles doses d'acroléine. Cependant, il est important de poursuivre les recherches pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes de toxicité de cet aldéhyde, considérant l'étendue de l'exposition des humains à l'acroléine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acroléine, Apoptose, Caspase, Mitochondrie, Récepteurs de mort.

Ce travail a pour but de mettre au point des nouvelles méthodes pour la recherche avancée sur les cellules souches et les cellules cancéreuses. Nous avons d'abord développé une méthode de patch pour la culture et la différentiation des cellules souches pluripotentes induites humain (hiPSCs) "hors sol". Ce patch de culture est constitué des monocouches de nanofibres réticulées de gélatine sur un support en nid d'abeilles pour assurer un minimum de contact de matériel exogène et un maximum de perméabilité. Puis, nous avons démontré la formation des tissues cardiaques et des neurones moteurs sur le patch, partis de colonies des hiPSCs en forme d'embryoïdes et de monocouches respectivement. Nous avons également développé un dispositif microfluidique avec filtre intégré pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTCs), montrant une haute performance de capture en termes d'efficacité, de sélectivité et de viabilité cellulaire. Enfin, nous avons évalué l'effet de drogue anticancéreuse à la formation des sphéroïdes tumoraux en utilisant des multi-puits d'agarose micro-fabriqués. Tous ensembles, nous avons progressé dans la micro-ingénierie vers des applications à grande échelle. / This work aimed to provide new tools and methods that can be used for advanced studies of stem cells and cancer cells. We first developed a patch method for off-ground culture and differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The culture patch we proposed consists of crosslinked monolayer gelatin nanofibers on a honeycomb frame to ensure minimal exogenous material contact and maximum permeability. Then, we demonstrated the formation of cardiac tissue constructs and motor neurons on the patch, started from embryoid-body like and monolayer hiPSC colonies, respectively. We also developed a microfluidic device with integrated filter for isolation of circulating tumor cells (CTCs), showing high capture performances in terms of efficiency, selectivity and cell viability. Finally, we evaluated the anti-cancer drug effect on the formation of tumor spheroids by using microfabricated agarose multi-wells. All together, we progressed in micro-engineering toward large scale applications.

La matrice extracellulaire est un réseau enchevêtré de macromolécules variées, en étroite relation avec les cellules qu'elle environne. Les interactions bidirectionnelles qui s'établissent entre les cellules et leur microenvironnement matriciel régulent mutuellement leur comportement et devenir. La diversité biochimique des constituants moléculaires de la matrice, leurs propriétés biophysiques, leur architecture tout comme leur dynamique représentent autant de signaux régulateurs. Parmi les constituants de la matrice, la fibronectine (FN) est une glycoprotéine structurale et fonctionnelle majeure intervenant dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ces fonctions diverses sont directement liées à la dynamique structurale de cette protéine et à sa capacité à interagir avec les autres molécules matricielles, dont elle-même. Retrouvée sous forme soluble dans les fluides biologiques, la FN est incorporée dans les matrices insolubles sous forme d'assemblages supramoléculaires principalement fibrillaires mais aussi sous forme d'agrégats. Ces assemblages sembleraient être impliqués dans des processus physiologiques et pathologiques distincts.Si l'étude des assemblages de FN est rendue possible par l'élaboration de modèles in vitro, les mécanismes de polymérisation et l'effet d'assemblages de structures définies sur le comportement cellulaire restent cependant à mieux élucider et constituent le cœur de ce travail.Les travaux ont donc consisté à élaborer des assemblages de FN, à caractériser les mécanismes et structures impliqués dans leur polymérisation, et à étudier leur influence sur un modèle de cellules cancéreuses ovariennes. D'autre part, des études préliminaires comparatives ont été menées avec un analogue végétal de la FN.L'irréversibilité de la dénaturation thermique de la FN entraîne la formation d'agrégats de type amyloïde. Deux populations d'agrégats coexistent en solution. Cette agrégation est corrélée à une diminution de l'accessibilité des sites de liaison à la gélatine et des sites RGD, et à une diminution de l'incorporation dans les réseaux matriciels. De plus, si la FN sous sa forme agrégée n'est pas cytotoxique pour les cellules étudiées, la modification de la conformation de la FN favorise leur migration isolée et aléatoire.Ces résultats soulèvent la question de l'implication de ces agrégats de FN dans des processus pathologiques tels que le développement tumoral. / Extracellular matrix is a complex meshwork of various macromolecules that have a tight relationship with the surrounding cells. Bidirectional interactions between cells and the microenvironment control their respective behaviors and fate. The biochemical diversity of matrix molecular components, their biophysical properties, their architecture but also their dynamic represent as many regulator signals. Among the components of the matrix, fibronectin (FN) is a major structural and functional glycoprotein involved in numerous physiological and pathological processes. These various functions are directly linked to the structural dynamic of this protein and its ability to interact with others matrix components, in particular with itself. Found as a soluble protein in biological fluids, FN is also incorporated in insoluble matrix as supramolecular assemblies, mainly fibrils but also aggregates. These assemblies could be involved in distinct physiological and pathological processes.If the study of the assembly of the FN is possible with the help of in vitro models, the mechanism of polymerization and the effects of defined assemblies on the cell behavior still have to be better defined.Therefore, this work consisted in elaborating FN assemblies, in characterizing the mechanisms and structures involved in their polymerization and in studying their influence on behaviors of a model of ovarian cancer cells. Besides, preliminary comparative studies have been performed with a plant analogous of FN.We show that irreversible thermal unfolding of FN triggers amyloid-like aggregation. Two states of aggregates could coexist in solution. FN aggregation correlates with a decrease of gelatin-binding domain and RGD sequence accessibility, and a decrease of the incorporation in the matrix network. Moreover, if aggregates are not cytotoxic for the studied cells, conformation change of FN promotes their single-cell and random migration.These results raise questions about the role of FN aggregates in pathological processes like tumor development.