Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire. / Bone marrow derived cells, including endothelial progenitor cells, are reduced in numbers in patient with cardiovascular disease or risk factors. Mobilization and incorporation of these cells at the vascular lesion site are important events in the reendothelialization process. 17β-estradiol was shown in a mouse model of injury, to favour this healing process through mechanisms which involve the mobilization and incorporation of endothelial progenitor cells derived from the bone marrow. At the moment, there are many strategies to increase endothelial progenitor cells mobilization as well as recruitment into the vascular wall. However, few studies favour local delivery of a large number of functional progenitor cells on a biodegradable scaffold and to maintain them at the lesion site in order to promote reendothelialization. An interesting biopolymer for this application is chitosan. This non toxic and biodegradable biopolymer is commonly used in tissue engineering and was recently used in vascular healing. Phosphorylcholine modified chitosan can increase the water solubility and cell biocompatibility of the biopolymer in physiological condition. This master project was thus designed to :1) evaluate, in vitro, the capacity of phosphorylcholine modified chitosan to influence cell adhesion, survival, differentiation and functionality in a mouse model of bone marrow mixed culture and 2) determine the impact of 17β-estradiol on these cell behaviours. Our results suggest an adequate biocompatibility of phosphorylcholine modified chitosan with our cell culture system. Indeed, this polymer was able to promote cell organization and development of bone marrow derived cells in the same way that fibronectin, the most commonly matrix used in the progenitor cells in vitro culture. Moreover, cell migratory activity was not compromised by the chitosan polymer. It appears that 17β-estradiol, when added to cell culture media or attached on phosphorylcholine modified chitosan is able to modulate differently cell behaviour. Our data suggest that 17β-estradiol coupled to the chitosan polymer was superior to increase the number of haematopoietic and endothelial progenitor cells derived from bone marrow in vitro compared to the soluble form. 17β-estradiol coupled to the polymer of phosphorylcholine modified chitosan allowed an increased amplification of progenitor cell number and provided adequate scaffold to favour vascular healing. We propose that phosphorylcholine modified chitosan in presence or not of 17β-estradiol is a compatible matrix with bone marrow derived progenitor cells in vitro. 17β-estradiol enhances the amplification of progenitor cell in vitro when associated to the polymer compared to its soluble form. This biopolymer may be an attractive matrix and a promising vehicle in a drug delivery therapeutic system for progenitor cells recruitment and to promote vascular healing.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les cellules dérivées de la moelle osseuse, principalement les cellules endothéliales progénitrices, sont réduites chez les patients souffrant de maladies cardiovasculaires. Leur mobilisation et leur incorporation aux sites de lésion vasculaire sont des évènements prépondérants dans l’accélération des processus de réendothélialisation. Dans un modèle murin, le 17β-estradiol favorise les processus de guérison vasculaire par la mobilisation et le recrutement des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse. Il existe présentement plusieurs stratégies afin d’augmenter la mobilisation des cellules progénitrices ainsi que leur incorporation à la paroi vasculaire. Cependant, peu d’études privilégient la livraison locale d’un nombre élevé de cellules progénitrices fonctionnelles par un véhicule biodégradable et leur maintien au site de lésion afin de favoriser la réendothélialisation ciblée. Un polymère d’intérêt pour cette application s’avère être le chitosan. Ce biopolymère non toxique et biodégradable est couramment utilisé dans l’ingénierie tissulaire et, depuis peu, est utilisé dans la guérison vasculaire. Le chitosan complexé à la phosphorylcholine voit sa solubilité s’accroître dans les solutions aqueuses ainsi que sa biocompatibilité cellulaire en condition physiologique. Le projet de ce mémoire visait donc : 1) à étudier in vitro, la capacité d’un polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine à influencer l’adhésion, la survie, la différenciation et la fonctionnalité cellulaire dans un modèle murin de culture mixte de cellules dérivées de la moelle osseuse et 2) de déterminer l’impact de la présence du 17β-estradiol sur ces mêmes comportements cellulaires. Nos travaux démontrent que la matrice de chitosan-phosphorylcholine s’avère compatible avec notre modèle de culture cellulaire. En effet, ce polymère est capable de promouvoir l’organisation et le développement des cellules dérivées de la moelle osseuse de façon comparable à la matrice normalement utilisée dans la croissance in vitro des cellules endothéliales progénitrices, la fibronectine. De plus, ce polymère n’a nullement compromis l’activité migratoire des cellules, laissant supposer qu’il pourrait éventuellement être un véhicule approprié pour effectuer une livraison cellulaire à un site de lésion. Il s’avère que le 17β-estradiol, lorsqu’ajouté au milieu de culture ou complexé au polymère de chitosan phosphorylcholine, est capable de moduler le comportement cellulaire, et ce, de façon différente. Le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine démontre, par rapport à sa forme soluble, une plus grande aptitude à accroître le nombre de cellules hématopoïétiques ainsi que des cellules endothéliales progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. De plus, le 17β-estradiol complexé au polymère de chitosan-phosphorylcholine permet une amplification marquée des cellules endothéliales progénitrices et leur offre un support adéquat afin de favoriser la guérison vasculaire. L’ensemble de nos travaux suggère que le polymère de chitosan complexé à la phosphorylcholine en présence ou non de 17β-estradiol est une matrice compatible avec les cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse in vitro. Le 17β-estradiol complexé au polymère est toutefois plus efficace que sa forme soluble à promouvoir l’amplification du nombre de cellules progénitrices. Ce polymère représente un outil thérapeutique attrayant et une matrice de livraison d’agent bioactif prometteuse pour le recrutement cellulaire dans l’accélération de la guérison vasculaire. / Bone marrow derived cells, including endothelial progenitor cells, are reduced in numbers in patient with cardiovascular disease or risk factors. Mobilization and incorporation of these cells at the vascular lesion site are important events in the reendothelialization process. 17β-estradiol was shown in a mouse model of injury, to favour this healing process through mechanisms which involve the mobilization and incorporation of endothelial progenitor cells derived from the bone marrow. At the moment, there are many strategies to increase endothelial progenitor cells mobilization as well as recruitment into the vascular wall. However, few studies favour local delivery of a large number of functional progenitor cells on a biodegradable scaffold and to maintain them at the lesion site in order to promote reendothelialization. An interesting biopolymer for this application is chitosan. This non toxic and biodegradable biopolymer is commonly used in tissue engineering and was recently used in vascular healing. Phosphorylcholine modified chitosan can increase the water solubility and cell biocompatibility of the biopolymer in physiological condition. This master project was thus designed to :1) evaluate, in vitro, the capacity of phosphorylcholine modified chitosan to influence cell adhesion, survival, differentiation and functionality in a mouse model of bone marrow mixed culture and 2) determine the impact of 17β-estradiol on these cell behaviours. Our results suggest an adequate biocompatibility of phosphorylcholine modified chitosan with our cell culture system. Indeed, this polymer was able to promote cell organization and development of bone marrow derived cells in the same way that fibronectin, the most commonly matrix used in the progenitor cells in vitro culture. Moreover, cell migratory activity was not compromised by the chitosan polymer. It appears that 17β-estradiol, when added to cell culture media or attached on phosphorylcholine modified chitosan is able to modulate differently cell behaviour. Our data suggest that 17β-estradiol coupled to the chitosan polymer was superior to increase the number of haematopoietic and endothelial progenitor cells derived from bone marrow in vitro compared to the soluble form. 17β-estradiol coupled to the polymer of phosphorylcholine modified chitosan allowed an increased amplification of progenitor cell number and provided adequate scaffold to favour vascular healing. We propose that phosphorylcholine modified chitosan in presence or not of 17β-estradiol is a compatible matrix with bone marrow derived progenitor cells in vitro. 17β-estradiol enhances the amplification of progenitor cell in vitro when associated to the polymer compared to its soluble form. This biopolymer may be an attractive matrix and a promising vehicle in a drug delivery therapeutic system for progenitor cells recruitment and to promote vascular healing.

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

L’athérosclérose est la principale cause d’infarctus du myocarde, de mort subite d’origine cardiaque, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie des membres inférieurs. Celle-ci cause près de la moitié des décès dans les pays industrialisés. Lorsque les obstructions artérielles athérosclérotiques sont tellement importantes que les techniques de revascularisation directe ne peuvent être effectuées avec succès, la sévérité de l’ischémie tissulaire résiduelle dépendra de l’habilité de l’organisme à développer spontanément de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). La néovascularisation postnatale est le résultat de deux phénomènes : la formation de nouveaux vaisseaux à partir de la vasculature existante (angiogenèse) et la formation de vaisseaux à partir de cellules souches progénitrices (vasculogenèse). Notre laboratoire a démontré que plusieurs facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires (tabagisme, vieillissement, hypercholestérolémie) diminuaient également la réponse angiogénique suite à une ischémie. Cependant, les mécanismes précis impliqués dans cette physiopathologie sont encore inconnus. Un point commun à tous ces facteurs de risque cardiovasculaire est l’augmentation du stress oxydant. Ainsi, le présent ouvrage visait à élucider l’influence de différents facteurs de risque cardiovasculaire et du stress oxydant sur la néovascularisation. Nos résultats démontrent que l’exposition à la fumée de cigarette et le vieillissement sont associés à une diminution de la néovascularisation en réponse à l’ischémie, et que ceci est au moins en partie causé par une augmentation du stress oxydant. De plus, nous démontrons que les acides gras dérivés de la diète peuvent affecter la réponse à l’ischémie tissulaire. La première étude du projet de recherche visait à évaluer l’impact de l’exposition à la fumée de cigarette sur la néovascularisation post-ischémique, et l’effet d’une thérapie antioxydante. L’exposition à la fumée de cigarette a été associée à une réduction significative de la récupération du flot sanguin et de la densité des vaisseaux dans les muscles ischémiques. Cependant, une récupération complète de la néovascularisation a été démontrée chez les souris exposées à la fumée de cigarette et traitées au probucol ou aux vitamines antioxydantes. Nous avons démontré qu’une thérapie antioxydante administrée aux souris exposées à la fumée de cigarette était associée à une réduction significative des niveaux de stress oxydant dans le plasma et dans les muscles ischémiques. De plus, les cellules endothéliales progénitrices (EPCs) exposées à de l’extrait de fumée de cigarette in vitro présentent une diminution significative de leur activité angiogénique (migration, adhésion et incorporation dans les tissus ischémiques) qui a été complètement récupérée par le probucol et les vitamines antioxydantes. La deuxième étude avait pour but d’investiguer le rôle potentiel de la NADPH oxydase (Nox2) pour la modulation de la néovascularisation post-ischémique dans le contexte du vieillissement. Nous avons trouvé que l’expression de la Nox2 est augmentée par le vieillissement dans les muscles ischémiques des souris contrôles. Ceci est associé à une réduction significative de la récupération du flot sanguin après l’ischémie chez les vieilles souris contrôles comparées aux jeunes. Nous avons aussi démontré que la densité des capillaires et des artérioles est significativement réduite dans les muscles ischémiques des animaux vieillissants alors que les niveaux de stress oxydant sont augmentés. La déficience en Nox2 réduit les niveaux de stress oxydant dans les tissus ischémiques et améliore la récupération du flot sanguin et la densité vasculaire chez les animaux vieillissants. Nous avons aussi démontré que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et adhésion à des cellules endothéliales matures) est significativement diminuée chez les souris vieillissantes comparée aux jeunes. Cependant, la déficience en Nox2 est associée à une récupération de l’activité fonctionnelle des EPCs chez les animaux vieillissants. Nous avons également démontré une augmentation pathologique du stress oxydant dans les EPCs isolées d’animaux vieillissants. Cette augmentation de stress oxydant dans les EPCs n’est pas présente chez les animaux déficients en Nox2. La troisième étude du projet de recherche a investigué l’effet des acides gras dérivés de la diète sur la néovascularisation postnatale. Pour ce faire, les souris ont reçu une diète comprenant 20% d’huile de maïs (riche en oméga-6) ou 20% d’huile de poisson (riche en oméga-3). Nos résultats démontrent qu’une diète riche en oméga-3 améliore la néovascularisation post-ischémique au niveau macro-vasculaire, micro-vasculaire et clinique comparée à une diète riche en oméga-6. Cette augmentation de la néovascularisation postnatale est associée à une réduction du ratio cholestérol total/cholestérol HDL dans le sérum et à une amélioration de la voie VEGF/NO dans les tissus ischémiques. De plus, une diète riche en acides gras oméga-3 est associée à une augmentation du nombre d’EPCs au niveau central (moelle osseuse) et périphérique (rate). Nous démontrons aussi que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et incorporation dans des tubules de cellules endothéliales matures) est améliorée et que le niveau de stress oxydant dans les EPCs est réduit par la diète riche en oméga-3. En conclusion, nos études ont permis de déterminer l’impact de différents facteurs de risque cardiovasculaire (tabagisme et vieillissement) et des acides gras dérivés de la diète (oméga-3) sur la néovascularisation post-ischémique. Nous avons aussi identifié plusieurs mécanismes qui sont impliqués dans cette physiopathologie. Globalement, nos études devraient contribuer à mieux comprendre l’effet du tabagisme, du vieillissement, des oméga-3, et du stress oxydant sur l’évolution des maladies vasculaires ischémiques. / Atherosclerosis is the main cause of myocardial infarction, sudden cardiac death, stroke and lower limb ischemia. It is responsible for nearly half of all deaths in industrialized countries. When atherosclerotic arterial obstructions are so important that direct revascularization techniques cannot be successfully performed, the severity of residual tissue ischemia depends on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). Postnatal neovascularization is the result of two phenomena: the formation of new bloods vessels from the existing vasculature (angiogenesis) and vessel formation from progenitor cells (vasculogenesis). Our laboratory has demonstrated that several cardiovascular risk factors (smoking, aging, and hypercholesterolemia) also impair the angiogenic response after ischemia. However, the precise mechanisms involved in that pathophysiology are still unknown. A common feature of all the cardiovascular risk factors is increased oxidative stress. Therefore, the purpose of the present work was to elucidate the influence of cardiovascular risk factors and oxidative stress on neovascularization. Our results demonstrate that exposure to cigarette smoke and aging are associated with impaired neovascularization in response to ischemia, and that this is at least in part due to increased oxidative stress. In addition, we demonstrate that fatty acids derived from the diet can modulate the response to tissue ischemia. The first study of the research project evaluated the effect of cigarette smoke exposure on neovascularization in response to ischemia, and the effect of an antioxidant therapy. Exposure to cigarette smoke was associated with a significant reduction in the recovery of blood flow perfusion and vessel density in ischemic muscles. However, a complete recovery of neovascularization was demonstrated in mice exposed to cigarette smoke that were treated with probucol or antioxidant vitamins. We found that antioxidant therapy in mice exposed to cigarette smoke was associated with a significant reduction of oxidative stress levels in the plasma and in ischemic muscles. In addition, endothelial progenitor cells (EPCs) exposed to cigarette smoke extracts in vitro showed a significant decrease in their angiogenic activities (migration, adhesion and homing into ischemic tissues) that was completely rescued by probucol and antioxidants vitamins. The goal of the second study was to investigate the potential role of NADPH oxidase (Nox2) in the modulation of ischemia-induced neovascularization in the context of aging. We found that the expression of Nox2 is increased by aging in ischemic muscles of control mice. This is associated with a significant reduction of blood flow recovery after ischemia in older compared to young control mice. We also demonstrated that the density of capillaries and arterioles is significantly reduced in ischemic muscles of older animals, whereas oxidative stress levels are increased. Nox-2 deficiency reduces oxidative stress levels in ischemic tissues and improves blood flow recovery and vascular densities in older animals. We also demonstrated that the functional activities of EPCs (migration and adhesion to mature endothelial cells) were significantly reduced in older compared to young mice. However, Nox2 deficiency is associated with preserved EPCs functional activities in older animals. We also demonstrated an age-dependent pathological increase of oxidative stress in EPCs that is not found in Nox2-deficient animals. The third study of the research project investigated the effect of fatty acids derived from the diet on postnatal neovascularization. To this end, mice received a diet containing either 20% corn oil (rich in omega-6) or 20% fish oil (rich in omega-3). Our results demonstrate that an omega-3 rich diet increases neovascularization in response to ischemia at the macrovascular, microvascular and clinical level compared to an omega-6 rich diet. This increased postnatal neovascularization is associated with decreased total cholesterol/HDL cholesterol ratio in the serum and improved VEGF/NO pathway in ischemic tissues. In addition, the omega-3 rich diet is associated with a significant increase of central (bone marrow) and peripheral (spleen) EPCs. We also show that the functional activities of EPCs (migration and incorporation into tubules) are improved and oxidative stress level in EPCs is reduced by the omega-3 rich diet. In conclusion, our studies have clarified the impact of cardiovascular risk factors (smoking and aging) and fatty acids derived from the diet (omega-3) on ischemia-induced neovascularization. We have also identified several mechanisms involved in that physiopathology. Globally, our studies should contribute to a better understanding of the effects of cigarette smoking, aging and omega-3 on the evolution of ischemic vascular diseases.