Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’asthme allergique est caractérisé par une réponse immune adaptative de type Th2 associée à une production des médiateurs pro Th2 tels que les chimiokines CCL17, CCL22 et CCL18. Les agents microbiens peuvent prévenir, aggraver ou sont soupçonnés d’induire l’asthme allergique, par des mécanismes encore incomplètement élucidés qui font intervenir des récepteurs de l’immunité innée capables de les reconnaître. NOD1 est un des récepteurs impliqués, c’est un récepteur intracellulaire qui reconnaît un motif particulier de la paroi de certaines bactéries. IL est capable de favoriser une réponse systémique de type Th2.Cependant aucune étude expérimentale ne s’est intéressée à son rôle dans cette pathologie. Le but de notre travail a été double, tout d’abord, évaluer l’effet de l'agoniste de NOD1 sur la réponse Th2 dans un modèle expérimental d’asthme, et étudier la contribution potentielle des cellules dendritiques dans ce processus, et d’autre part, évaluer les relations directes entre la chimiokine CCL18 et une cellule de l’immunité innée la cellule dendritique (DC) sur la réponse adaptative. Dans la première étude, dans un modèle expérimental d’asthme allergique, nous avons montré que l’administration de l’agoniste de NOD1, au moment de la sensibilisation à des souris sauvages, amplifie la réponse Th2 au niveau des poumons. Cette réponse est caractérisée par une augmentation de la production des chimiokines pro Th2 (CCL17 et CCL22). L’amplification de la réponse inflammatoire pulmonaire de type Th2 est reconstituée par le transfert adoptif de DCs de moelle osseuse (BM-DC) stimulées avec de l’OVA combiné à l’agoniste de NOD1. Par contre les BM-DCs provenant de souris déficientes en CCL17 sont incapables d’amplifier cette réponse. In vitro, les BM-DC murines et les DC humaines (dérivées de monocytes) produisent des quantités importantes de CCL17 et CCL22 en réponse à l’agoniste de NOD1. De plus, les DCs humaines stimulées favorisent la polarisation des cellules T vers un profil Th2. Ces résultats montrent que l’agoniste de NOD1 amplifie la réponse Th2 dans l’asthme allergique, par le biais d’une production de chimiokine pro Th2 (CCL17) par la cellule dendritique, mettant en évidence un nouvel aspect de la fonctionnalité de NOD1. La seconde étude a consisté à évaluer l’effet direct de CCL18, une chimiokine pro Th2 sur les cellules de l’immunité innée, les cellules dendritiques. La différenciation de monocytes de sujets sains en présence de GM-SCF et CCL18 conduit au développement de DCs de phénotype semi-mature, exprimant le CCR7, produisant de l'IL10 et l'enzyme 2,3-indoleamine dioxygenase. Ces DCs induisent le développent de Lc T régulateurs de type Tr1 produisant de l’IL-10 et capables d'inhiber la prolifération de Lc T effecteurs par un mécanisme cytokine dépendant. Lorsque les monocytes proviennent de patients allergiques, l'effet tolérogène de CCL18 est perdu en liaison avec la diminution de la fixation de CCL18 à son récepteur putatif. Ces résultats suggèrent un défaut de régulation chez les sujets allergiques qui pourrait contribuer au défaut de tolérance observé chez les sujets allergiques. Ces données font du CCL18 et de son récepteur putatif des cibles thérapeutiques potentielles.L'ensemble de ces résultats mettent en évidence le rôle important des chimiokines et de leurs interactions avec les cellules dendritiques dans la déviation de la réponse immune en amont et en aval de celle ci. / In the first study, our results show that in vivo, NOD1 agonist used as an adjuvant exacerbated the pulmonary Th2 response, as well as the production of the pro Th2 chemokines CCL17 and CCL22. The exacerbation of the Th2 pulmonary response was recapitulated by adoptive transfer of NOD1-stimulated bone marrow derived DCs from wild type but not CCL17- deficient mice. Both purified murine bone marrow derived DCs, and human monocyte derived DCs stimulated in vitro with NOD1 agonist exhibited an increased production of CCL17 and CCL22. Moreover, NOD1-stimulated human DCs favored T cell polarization toward a Th2 profile. Altogether these data uncover a previously unrecognized effect of NOD1, which exacerbates allergic asthma through a direct effect on DCs by the induction of the pro Th2 chemokine CCL17.In the second study our results show that the differentiation of monocytes from healthy subjects in the presence of GM-SCF and CCL18 led to the development of DCs with a semi-mature phenotype, with intermediate levels of costimulatory and MHC class II molecules, increased CCR7 expression, which induced in coculture with allogenic naive T cells, an increase in IL-10 production. The generated T cells were able to suppress the proliferation of effector CD4+CD25- cells, through a cytokine dependent mechanism, and exhibited characteristics of type 1 regulatory T cells. The generation of tolerogenic DCs by CCL18 was dependent upon the production of indoleamine 2,3-dioxigenase through an IL-10 mediated mechanism. Surprisingly, when DCs originated from allergic patients, the tolerogenic effect of CCL18 was lost in relation with a decreased binding of CCL18 to its putative receptor. This study is the first to define a chemokine able to generate tolerogenic DCs. However, this function was absent in allergic donors, and may participate to the decreased tolerance observed in allergic diseases. Our data define CCL18 and its putative receptor as potential therapeutic targets.Altogether these results underline the importance of chemokines in the deviation of the immune response.

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo.

: L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique des grosses artères à localisation intimale. Elle est probablement la résultante d’une réaction inflammatoire mal contrôlée ayant pour but initial d’éliminer l’accumulation anormale de lipides au niveau de l’intima. Cette élimination est exercé par les monocytes/macrophages, dont l’infiltration et l’accumulation au niveau des lésions sont une étape cruciale de l’inflammation chronique locale provoquant en particulier la production de cytokines.Les mécanismes moléculaires responsables de cette accumulation monocytaire impliquent notamment les chimiokines et leurs récepteurs, acteurs clés de la mobilisation des leucocytes. Les souris génétiquement invalidées pour certaines chimiokines comme CCL2 et CX3CL1 ou pour leurs récepteurs respectifs sont partiellement protégées de l’athérosclérose. Par ailleurs, chez l’homme, des variations génétiques de CX3CR1 sont associées à une réduction du risque d’accidents cardiovasculaires. L’ensemble de ces résultats indiquent un rôle clé des chimiokines inflammatoires dans l’athérogenèse.L’objectif de cette thèse était de tester l’utilisation d’inhibiteurs des récepteurs de chimiokines comme outils thérapeutiques contre l’athérosclérose. Dans ce but, notre laboratoire a développé une molécule aux propriétés antagonistes du récepteur CX3CR1, marqueur utilisé pour la caractérisation phénotypique des monocytes. Nos travaux sur deux modèles murins d’athérosclérose mettent en évidence que le blocage de CX3CR1 par notre antagoniste réduit la taille des plaques d’athérosclérose formées sans modifier leur composition cellulaire ni le taux de cholestérol plasmatique circulant. Cette diminution est corrélée à une diminution du nombre d’une sous-population monocytaire circulante spécifique, ainsi qu’à une diminution de leurs propriétés d’adhérence et de survie. D’un point de vue curatif, l’antagoniste de CX3CR1 est capable de limiter la progression des plaques d’athérosclérose sans la prévenir totalement.L’utilisation d’un outil ciblant spécifiquement le récepteur CX3CR1 nous à permis d’une part de mieux comprendre le rôle de ce dernier dans les processus de monocytose et d’athérogenèse et d’autres part d’évaluer la faisabilité d’approches thérapeutiques visant à limiter le nombre de monocytes infiltrant les lésions d’athérosclérose. Les perspectives de ces travaux consistent d’une part à approfondir encore le rôle de CX3CR1 dans la mobilisation monocytaire, notamment au niveau de la moelle osseuse, et d’autre à utiliser l’antagoniste testé en association avec d’autres drogues ciblant les récepteurs de chimiokines impliqués dans l’athérogenèse, tels que CCR2 et CCR5. / Atherosclerosis account for nearly 30% of death in industrialized countries. It is a chronic inflammatory disease of the large arteries intima. It has been suggested that it is the result of an uncontrolled inflammatory reaction secondary to an abnormal accumulation of lipids in the intima. The lipid clearance is performed by monocytes / macrophages, Their infiltration and accumulation in atherosclerotic lesions is a critical step of a local chronic inflammation associated with an increased production of cytokines. The molecular mechanisms of the generation of atherosclerotic lesions involve monocytes, chemokines and their receptors which are key players controlling leukocytes mobilization. Mice genetically invalidated for chemokines such as CCL2 and/or CX3CL1 or their respective receptors are partially protected from atherosclerosis. Furthermore, in humans, genetic polymorphisms of CX3CR1 are associated with a reduced risk of cardiovascular events. Taken together, these results highlight a key role for inflammatory chemokines in atherogenesis. The aim of this thesis was to investigate wether inhibitors of chemokine receptors could play a role as therapeutic tools against atherosclerosis. To this end, our laboratory had developed an antagonist of CX3CR1, a crucial phenotypic and functional marker of monocytes. Our work, on two murine models of atherosclerosis, demonstrates that blocking CX3CR1 by our antagonist reduces the size of atherosclerotic lesions. This decrease is correlated with a lower number of circulating inflammatory monocytes, as well as a decrease in their adhesion and survival properties. Therefore, CX3CR1 antagonist coud be able to limit the progression of atherosclerotic plaques. Targeting CX3CR1 allowed us to understand the role of this receptor in the pathophysiology of atherogenesis by its effects on circulating inflammatory monocytes and to evaluate the feasibility of the use of this antagonist as a therapeutic tool to reduce atherosclerotic lesions. Perspectives of this work are firstly to deepen the role of CX3CR1 in monocyte mobilization, especially from the bone marrow, and secondly to test this antagonist in combination with others drugs targeting chemokine receptors involved in atherogenesis, such as CCR2 and CCR5 in order to better control the evolution of atherosclerotic lesions.

Les chimiokines sont un élément essentiel du trafic cellulaire aussi bien homéostatique que dans des situations pathologiques. Outre cette fonction chimiotactique spécifique à ce type de molécules, on leur a récemment attribué une implication dans le profil de polarisation de la réponse adaptative spécifique, en agissant directement sur les lymphocytes T (Lc T) ou indirectement par le biais des cellules dendritiques (DC). CCL18 est une chimiokine exprimé préférentiellement au niveau pulmonaire et de façon moindre au niveau ganglionnaire, capable d’attirer les DC et les Lc T, elle est induite par les cytokines de type Th2 telle que l'IL-4, l'IL-13, mais aussi par la cytokine immunomodulatrice l'IL-10, son récepteur est inconnu à ce jour. Au laboratoire il a été montré une implication du CCL18 dans l’asthme allergique (de Nadai, JI, 2006), et cette chimiokine a été associée à différentes pathologies à tropisme pulmonaire ou non avec un rôle pas toujours très clair. L'objectif de ce travail a été d’étudier l’effet immunitaire de cette chimiokine, en base et en situation atopique. L'effet direct du CCL18 a été évalué sur la polarisation de la réponse T. Le prétraitement des Lc T mémoire CD4+ CD25-, de sujets non allergiques, avec le CCL18 conduit à leur transformation en Lc T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+ produisant de l’IL-10 et du TGF-b capables d'inhiber la prolifération des Lc T effecteurs, à la fois par un mécanisme cytokine et contact dépendant. Cependant, cet effet de régulation de CCL18 est perdu lorsque les cellules T proviennent de sujets allergiques (Chang Y et al., FASEB J, 2010). L’effet indirect du CCL18 a été évalué sur la réponse immune via les DC. La différenciation de monocytes de sujets sains en présence de GM-SCF et CCL18 conduit au développement de DC de phénotype semi-mature, expriment le CCR7, produisant de l’IL10 et l’enzyme 2,3-indoleamine dioxigenase et induisant le développent de Lc T régulateurs de type Tr1 produisant de l’IL-10 capables d’inhiber la prolifération de Lc T effecteurs, par un mécanisme cytokine dépendant. Étonnamment, lorsque les monocytes proviennent de patients allergiques, l'effet tolérogène de CCL18 est perdu en liaison avec la diminution de la fixation de CCL18 à son récepteur putatif (Azzaoui I et al., en révision Blood). Par ailleurs, CCL18 pourrait également jouer un rôle dans la résolution de la réaction allergique par un effet chimiotactique vis-à-vis d’une sous population de LcT régulateurs CD4+CD25highCD127lowLAP+ (Chenivesse C et al., en révision JI). L'effet de corticoïdes sur l'expression de CCL18 a ensuite été analysé. Il a été montré que la sécrétion de CCL18 induite par les cytokines IL-4 et IL-10 est potentialisée par la dexaméthasone, ce qui confirme que CCL18 est plutôt une chimiokine à activité anti inflammatoire (Chabrol J et al., en préparation). La dernière étude concerne une approche dans un modèle murin d'asthme allergique, induit par l'ovalbumine chez la souris Balb/cBYJ. D'un point de vue fonctionnel, l'administration de CCL18 recombinant par voie intratrachéale à des animaux sensibilises permet d'inhiber le développement de la réaction asthmatique, en diminuant l'inflammation pulmonaire (réduction de l'infiltration éosinophilique, inhibition de la production locale de cytokines Th2) et protège ces derniers contre l'altération de leur fonction respiratoire (protection contre l'hyperréactivité bronchique, avec inhibition de l'hypersécrétion de mucus). Toutefois, les mécanismes cellulaires à l'origine de cette protection semblent indépendants de grandes voies de régulation de la réaction (Gilet J et al., en préparation). L'ensemble de ces études montre, et pour la première, qu’une chimiokine est capable d’induire le développement d’une réponse tolérogénique. / Chemokines are a key component of homeostatic cell traffic and involved in pathological situations. In addition to this chemotactic function, specific to these molecules, they have been recently assigned an involvement in specific adaptive response polarization, by acting directly on T cells (T Lc) or indirectly through dendritic cells (DC). CCL18 is a chemokine preferentially expressed in lung and lymph nodes, able to attract DCs and T Lc, induced by Th2 cytokines such as IL-4, IL-13 but also by the immunomodulatory cytokine IL-10, and its receptor is still unknown. In our laboratory it was shown an involvement of CCL18 in allergic asthma (de Nadai, JI, 2006), and this chemokine has also been associated with various pathologies without areal clear described role. The purpose of this work was to evaluate the immune effect of CCL18 at baseline and in atopic situation. The direct effect of CCL18 was evaluated on T cell polarization. Pretreatment of memory T cells CD4+CD25-, from non allergic subjects, with CCL18 led to their switch to regulatory CD4+CD25+ Foxp3+ cells, able to produce IL-10 and TGF-b and inhibit effectors T cell proliferation, by a contact and cytokine dependent mechanism. However, this regulatory effect of CCL18 was lost when T cells were derived from allergic subjects (Chang Y et al., FASEB J, 2010). The indirect effect of CCL18 has been assessed on the immune response through DC. Monocyte, from healthy subjects, differentiated in DC with GM-CFS and CCL18 led to development of semi-mature DC, that expressed CCR7 and produced IL10 and the enzyme indoleamine 2,3-inducing dioxigenase. These cells primed regulatory Tr1 cells able to produce IL-10 and to suppress LcT effectors proliferation by a cytokine dependent mechanism. Surprisingly, when monocytes were derived from allergic patients, the tolerogenic effect of CCL18 was lost, in association with a decreased binding of CCL18 to its putative receptor (Azzaoui I and al., in revision Blood) Moreover, we have shown that CCL18 may also play a role in the resolution of the allergic reaction with a chemotactic effect, by recruitment of a subpopulation of regulatory T cells CD4+CD25highCD127lowLAP+ (Chenivesse C et al., in revision JI). The effect of corticosteroids on CCL18 expression was analyzed. These results showed that the secretion of CCL18 induced by cytokines IL-4 and IL-10 is potentiated by dexamethasone (Chabrol J et al., in preparation) which confirms the anti inflammatory role of CCL18. The last study was an approach in a murine model of allergic asthma induced by ovalbumin in mice Balb/cByJ. Intratracheal administration of recombinant CCL18 to sensitized animals, inhibits asthmatic reaction development, by decreasing pulmonary inflammation (reduced eosinophil infiltration, and inhibition of local production of Th2 cytokine) and protects them against the deterioration of their respiratory function (protection against bronchial hyperresponsiveness, and inhibition of mucus hypersecretion). However, the cellular mechanisms behind this protection appear independent of major regulatory pathways of the reaction (J Gilet et al., in preparation). All these studies show, for the first time, that a chemokine is able to induce a tolerogenic response. However, this feature is absent in allergic donors who exhibit a defect in the binding of CCL18 to its putative receptor. This may participate to the lack of tolerance response observed in allergic diseases. This data suggest that CCL18 and its putative receptor may represent therapeutic targets.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La production de cytokines et chimiokines par les polymorphonucléaires (PMN) est une fonction importante dans la réponse inflammatoire. La phagocytose et la migration, ainsi que d’autres fonctions des PMN changent en milieu hypoxique. II est bien connu que la régulation par l’hypoxie dépend principalement de l'activation du facteur de transcription HIF, cependant, l’effet de l’hypoxie sur la production des cytokines n’est pas encore établi. Notre hypothèse est que l’hypoxie change le profil de production des cytokines et chimiokines dans les neutrophiles humains en réponse aux agonistes en impliquant HIF. Dans ce travail, nous avons tout d’abord démontré que les PMN expriment constitutivement HIF-2? et HIF-3?. De plus, les agonistes G-CSF, GM-CSF, TNF? ou LPS augmentent l’expression de HIF-1? en hypoxie. D’autre part, nous avons démontré que l’hypoxie seule induit la sécrétion de TNF? et MIP-3a et modifie les niveaux des MIP-1?/1?, IL-8 et MIP-3? produites en réponse au GM-CSF, LPS et PGN. Ceci suggère que l'hypoxie oriente la production des cytokines dans les PMN de façon dépendante du stimulus et témoigne d’une mobilisation des voies de signalisation et des facteurs de transcription différente de celle connue en normoxie. Par la suite, nous avons étudié les mécanismes qui pourraient être à l’origine de ces modifications tels que la voie des MAPK p42/p44, STAT3, ERK, JNK et C/EBP-?. D’autre part, nous avons montré que la production inédite d’IL-8 par G-CSF en hypoxie dépend de STAT3 et p38 et que cette production met en jeu l'action autocrine des cytokines endogènes IL-18, IL-1ra et TNF?. De plus, l’utilisation d’une lignée cellulaire PLB-985 différenciée en PMN portant une mutation sur les sites consensus du NF-?B ou HIF, nous a permis de démontrer que non seulement l’hypoxie seule ou associé au G-CSF, GMCSF, TNF? ou au LPS régule l’activité de ce promoteur, mais le HIF régule aussi cette activité en normoxie. Finalement, les travaux présentés dans ce mémoire démontrent que l’hypoxie modifie l’expression et la production des cytokines par les neutrophiles humains de façon différente de la normoxie. Si le rôle crucial des neutrophiles dans l’inflammation physiologique et pathologique basé sur leur production des cytokines a été largement documenté en normoxie, il est primordial de réaliser des études pour approfondir ce rôle en considérant l’effet de l’hypoxie. [symboles non conformes]

Lors de l'infection par le VIH-1, l'intégrité de la barrière immunitaire muqueuse est altérée du fait d'une profonde déplétion des lymphocytes T CD4+ intestinaux, notamment des lymphocytes Th17, une sous population de lymphocytes exerçant un rôle majeur dans la lutte contre les bactéries et certains champignons. La translocation de produits microbiens de la lumière intestinale dans la circulation sanguine systémique, liée à la perte des lymphocytes Th17, est une source d'inflammation généralisée délétère. Malgré la mise en place d'un traitement antirétroviral, chez la plupart des patients, la reconstitution des lymphocytes T CD4+ de la lamina propria est différée et incomplète par rapport à celle du sang périphérique. Les travaux exposés dans ce manuscrit suggèrent que chez les patients VIH-1+ traités, une diminution de la production de la chimiokine CCL20 altère l'axe de chimiotactisme CCR6-CCL20, particulièrement important pour les lymphocytes Th17, affaiblissant ainsi l'adressage de ces cellules à la muqueuse intestinale. Les résultats obtenus ne sont pas en faveur d'un rôle direct du virus dans la diminution observée de CCL20. L'infection par différentes souches virales d'un système d'histocultures de tissu intestinal développé au laboratoire induit, au contraire, une augmentation de la production de la chimiokine CCL20. La stimulation de cultures de cellules épithéliales intestinales primaires, spécialement mises au point lors de ce projet, par différentes protéines virales ne montrent pas non plus d'effet négatif sur la production de la chimiokine CCL20. La stimulation des cellules épithéliales intestinales primaires par différents ligands des récepteurs de l'immunité innée aux pathogènes (PRR) a également permis d'écarter la potentielle responsabilité de la translocation résiduelle de produits microbiens observée chez les patients VIH-1+ dans la diminution de la production de CCL20. L'analyse de la distribution des différentes populations lymphocytaires dans les compartiments sanguin et intestinal des patients VIH-1+ traités a mis en évidence une augmentation d'une population de lymphocytes T régulateurs dans l'intestin grêle, qui n'expriment pas le récepteur CCR6 (Treg CCR6-). L'étude présentée souligne la persistance d'un déséquilibre du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- malgré un traitement antirétroviral. La perturbation de l'environnement cytokinique, conséquence de la modification du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- semble impliquée dans la diminution de la chimiokine CCL20 observée chez les patients VIH-1+ traités. La stimulation des cellules épithéliales intestinales primaires par l'IL-17A, synthétisée par les lymphocytes Th17, augmente la production de CCL20, alors que la stimulation par l'IL-10 et le TGF-ß1, produites par les lymphocytes Treg, diminue cette production. La co-culture de cellules épithéliales primaires avec différents ratio de lymphocytes T triés et stimulés, reproduisant ex vivo l'interaction entre l'épithélium intestinal et la lamina propria sous jacente, confirme l'influence du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- sur la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales. Ces travaux démontrent que l'axe de chimiotactisme CCR6-CCL20 est altéré chez les patients VIH-1+ malgré le traitement antirétroviral prolongé et que la persistance d'un déséquilibre du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- dans la lamina proria pourrait contribuer à la diminution de la production de CCL20 par les entérocytes, soulignant l'existence d'un cercle vicieux entre la diminution de l'expression de CCL20 et le défaut d'adressage des lymphocytes Th17 à la muqueuse intestinale. / During HIV-1 infection, the integrity of the intestinal immune barrier is disrupted due to a deep depletion of CD4+ T cells in the gut, especially Th17 cells, a T cell subset exerting a major role in antimicrobial immunity. The translocation of microbial products from the gut lumen into the bloodstream, associated with Th17 cells loss, has been linked to systemic inflammation. Despite effective cART, CD4+ T cells restoration in the lamina propria is postponed and incomplete compared with peripheral blood of most individuals. The works exposed in this manuscript suggest that treated HIV-1-infected individuals display a reduced CCL20 production altering the CCR6-CCL20 chemotactic axis, which drives Th17 cells trafficking to the gut. Our results do not support a direct role of the virus in the decreased production of the CCL20 chemokine. The infection of small bowel explants by various viral strains rather leads to an increase of CCL20 production. The stimulation of primary intestinal epithelial cells cultured ex vivo by a technique specially worked out during this project by various viral proteins do not show any negative effects on the production of CCL20. Stimulation of primary intestinal epithelial cells by several ligands of innate microbial sensors (PRR) also allows to rule out a potential responsibility of the residual microbial translocation observed in treated HIV-1-infected individuals in the decreased production of the CCL20 chemokine. The detailed analysis of various lymphocyte populations distribution in the blood and intestinal compartments of treated HIV-1-infected individuals highlights an increase of a regulatory T cell subset in the small intestine, which do not show the CCR6 chemokine receptor (CCR6- Treg). Despite antiretroviral therapy, the presented study underlines the persistence of an imbalanced Th17/CCR6- Treg ratio. The cytokinic microenvironment disruption, as a consequence of the modification of the Th17/CCR6- Treg ratio seems involved in the decrease of the CCL20 chemokine observed in treated HIV-1-infected individuals. Stimulation of primary intestinal epithelial cells with IL-17A produced by Th17 cells increases CCL20 production whereas Treg cytokines both IL-10 and TGF-ß1 decrease it. Ex vivo co-culture of primary small intestine epithelial cells with various proportions of T lymphocytes sorted by flow cytometry, activated and placed into the bottom chamber of the transwell to mimic lamina propria-epithelium interactions, confirms the influence of the Th17/CCR6- Treg ratio on the production of CCL20 by the intestinal epithelial cells. All together, our data demonstrate that the CCL20-CCR6 axis driving Th17 cells gut homing is altered in HIV-1-infected individuals despite antiretroviral therapy, and the persistence of an imbalanced Th17/CCR6- Treg ratio into the lamina propria could contribute to the decrease of the CCL20 chemokine production by enterocytes, highlighting the existence of a vicious circle between the decrease of the CCL20 expression and the defective gut homing of CD4+ T cells, notably Th17 cells.

Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.

RÉSUMÉ Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. Mot-clés : Récepteur de chimiokine CXCR4 et CXCR7, BRET, recrutement de la β-arrestine, AMD3100, Tc14012 et SDF-1. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.