Les algues vertes et les plantes terrestres sont des organismes photosynthétiques qui se regroupent dans le sous-règne des Viridiplantae. Ce règne se divise en deux lignées évolutives que sont les Streptophyta (plantes terrestres et algues vertes de la classe des Charophytes) et les Chlorophyta (algues vertes appartenant aux classes : Prasinophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae et Trebouxiophyceae). L’embranchement des ordres composant la classe Trebouxiophyceae est encore mal connu. En étudiant les génomes chloroplastiques d’au moins un représentant de chaque ordre, il sera possible de reconstruire une phylogénie juste et de mieux comprendre l’évolution moléculaire de cette classe. La famille Trebouxiophyceae comptent 4 ordres : Trebouxiales, Microthamniales, Chlorellales et Prasiolales. Pour chacun de ces ordres, excepté les Prasiolales, un génome chloroplastique d’une algue verte a été séquencé. Le séquençage du génome chloroplastique de Pabia signiensis, aussi appelé Planophila sp et appartenant aux Prasiolales, vient compléter cet échantillonnage. Selon les analyses phylogénétiques du gène codant pour l’ARNr 18S, P. signiensis aurait divergé relativement tôt durant l’évolution de la classe des Trebouxiophyceae et formerait avec Chlorella ellipsoidea (Prasiolales) le groupe soeur de Chlorella vulgaris (Chlorellales). Le génome chloroplastique de P. signiensis est, avec ses 236,463 pb, un des plus grands génomes séquencés dans la classe des Trebouxiophyceae. La présence de régions inversées répétées, lui confère la structure quadripartite caractéristique de la plupart des génomes chloroplastiques. Sur les 111 gènes trouvés, seul le gène ycf47 est propre au génome chloroplastique de P. signiensis. Les principaux regroupements de gènes ancestraux chez les génomes chloroplastiques d’algues vertes sont présents et 13 d’entre eux sont entièrement conservés. Aucun intron n’a été mis en évidence. L’ordre des gènes et leur répartition dans le génome sont peu réarrangés par rapport aux génomes ancestraux de la classe Prasinophyceae. Seules les longues régions inversées répétées (27.3 kb) dérobent à la règle, puisque celles-ci possèdent les gènes psbA et trnS(gcu) en plus de contenir un opéron rrn brisé en deux segments qui sont inversés l’un par rapport à l’autre et un taux élevé de SDRs. Bien que plusieurs des caractéristiques mentionnées ci-dessus se retrouvent dans les génomes chloroplastiques des Trebouxiophyceae, le grand nombre de caractères ancestraux présents dans le génome de P. signiensis semble confirmer la position basale de cette algue verte et appuie l’hypothèse selon laquelle les Trebouxiophytes seraient à la base du clade UTC (Ulvophyceae-Trebouxiophyceae-Chlorophyceae).

Les Streptophyta et Chlorophyta forment le règne des plantes vertes. Les Chlorophyta se divisent en quatre classes: Prasinophyceae, Trebouxiophyceae, Ulvophyceae et Chlorophyceae. Le séquençage des génomes entiers d' organelles et l'étude de ces génomes permettent d'observer les tendances évolutives par rapport à leurs ancêtres et d' identifier les liens qui unissent les différents taxons. L' algue chlorophycéenne Chlamydomonas moewusii, membre de l'ordre des Chlamydomonadales, a un génome chloroplastique très grand et très réarrangé présentant de nombreuses séquences répétées. Quant à son génome mitochondrial, il est petit, compact et contient peu de gènes. Dans les deux cas, ces deux génomes contiennent peu de traits communs avec les génomes homologues apparentés, si ce n' est la divergence qu' ils ont par rapport avec leur ancêtre commun. La présente étude sur C. moewusii a permis de compléter et de vérifier les études précédentes, ainsi que d'apporter plus d'information sur les insertions, uniques au génome chloroplastique

Les plantes vertes se divisent en deux embranchements majeurs : Streptophyta et Chlorophyta. Les Chlorophyta comportent quatre classes d'algues vertes : Prasinophyceae, Ulvophyceae, Trebouxiophyceae et Chlorophyceae. Le séquençage de génomes complets d'organites est effectué dans notre laboratoire sous deux lignes directrices principales : (1) l'évolution des génomes d'organites par rapport à leur ancêtre commun respectif et (2) l'identification des liens évolutifs réunissant les différentes classes par l'analyse des protéines codées par ces génomes. Le séquençage et les analyses comparatives du génome chloroplastique de l'algue chlorophycéenne Stigeoclonium helveticum ont révélé un génome riche en caractéristiques dérivées et extrêmement réarrangé par rapport à ses homologues chez les Chlorophyceae; son génome mitochondrial présente quant à lui des caractères évolutifs intermédiaires dans l'évolution des Chlorophytes. L'apport de Stigeoclonium a également permis de souligner les traits distinctifs des génomes d'organites des Chlorophyceae ainsi que la position basale des Chaetophorales au sein de cette classe.

Les NAD(P)H déshydrogénases de type II (Ndh-II) sont des enzymes de faible poids moléculaire capables doxyder le NAD(P)H et de transférer les électrons à un groupement quinone (plastoquinone ou ubiquinone). On les appelle « de type II » par opposition aux déshydrogénases de type I qui correspondent au complexe I mitochondrial. Chez Arabidopsis thaliana, des protéines Ndh-II ont été identifiées sur les faces interne et externe de la membrane interne mitochondriale, sur la membrane des peroxysomes, et au niveau de la membrane thylacoïdale du chloroplaste. Au niveau de la chaîne de transport délectrons mitochondriale, les protéines Ndh-II constituent une voie alternative aux complexes I et II pour lapport des électrons au pool dubiquinones. Cette voie alternative permettrait une adaptation de la chaîne de transport délectrons en fonction du métabolisme de lalgue. Au niveau de la chaîne de transport délectrons chloroplastique, les protéines Ndh-II participeraient à plusieurs mécanismes dadaptation de la chaîne à la quantité et à la qualité de la lumière disponible : transitions détats, transport cyclique délectrons autour du photosystème II. Leur fonction serait de catalyser la réduction non-photochimique du pool de plastoquinones. En 2005, sept open reading frame correspondant à des NAD(P)H déshydrogénases de type II hypothétiques (NDA1 à NDA7) ont été identifiées dans le génome nucléaire de Chlamydomonas. Ces séquences étaient cependant largement incomplètes du fait de régions non séquencées dans le génome de Chlamydomonas. Les données récoltées au cours de ce travail ont permis lobtention dune version complète de la séquence codante des gènes NDA de Chlamydomonas. Ces analyses ont démontré que le gène putatif NDA4 correspondait, en fait, à des régions internes non attribuées au gène NDA2. Chez Arabidopsis thaliana et Solanum tuberosum, une corrélation entre le positionnement phylogénétique des gènes NDH-II et la localisation subcellulaire de la protéine correspondante a été mise en évidence. Lanalyse phylogénétique des séquences des protéines Nda de Chlamydomonas montre que les gènes NDA1, 2 et 3 seraient proches phylogénétiquement et seraient à positionner dans le clade des protéines Ndh-II mitochondriales des plantes supérieures. A linverse, la protéine Nda5 serait dorigine cyanobactérienne et se positionne dans le même clade que les protéines identifiées dans le chloroplaste des plantes supérieures. Les protéines Nda6 et 7 sont très proches du point de vue de la séquence, suggérant une duplication récente des gènes NDA6 et 7. Ces deux protéines se positionnent dans un nouveau clade, apparemment intermédiaire entre le domaine eucaryote et le domaine procaryote. Une étude dexpression des gènes NDA de Chlamydomonas a permis de mettre en évidence lexpression apparemment majoritaire du gène NDA2. Pour étudier la fonction spécifique de NDA2, nous avons inactivé lexpression de ce gène par RNA interférence afin détudier le phénotype des mutants obtenus. Contrairement aux prédictions in silico, il est apparu que la protéine Nda2 se localise au niveau du chloroplaste. Létude de la fluorescence chlorophyllienne de deux mutants montre que la capacité de ces mutants à réduire de manière non-photochimique le pool de plastoquinones est largement diminuée. Dautre part, les mutants sont largement affectés dans leur capacité à modifier la distribution de lénergie dexcitation entre les deux photosystèmes (transition détat) lorsque la respiration mitochondriale est inhibée. Il est connu que les transitions détat sont initiées par des changements de létat rédox du pool de plastoquinones, qui est lui-même dépendant de létat rédox de la cellule. Dans ce cadre, nous proposons que la protéine Nda2 pourrait servir de « senseur » du métabolisme cellulaire de lalgue et permettrait dadapter les flux délectrons chloroplastiques en réponse aux changements du contexte énergétique cellulaire.

Les algues vertes sont divisées en cInq classes: Charophyceae, Prasinophyceae, Ulvophyceae, Trebouxiophyceae et Chlorophyceae. Afin de résoudre le positionnement phylogénétique de la classe Ulvophyceae au sein des ces multiples lignées et d'acquérir de l' information sur les tendances évolutives de 'ses génomes d'organites, j ' ai séquencé les ADN chloroplastiques (ADN cp) et ADN mitochondriaux (ADNmt) des ulvophytes basales Pseudendoclonium akinetum et Oltmannsiellopsis viridis, effectué des analyses génomiques comparatives détaillées d'ADNcp et ADNmt de chlorophytes, et réalisé des analyses phylogénétiques approfondies dérivées de ces organites. Les analyses comparatives de génomes d'organites ont révélé que leur architecture est très fluide chez les Chlorophyta et démontre une grande variabilité de structure, d' ordre génique, de contenu génique, intronique et en éléments répétés, et ont également fourni des évidences indiscutables du transfert intracellulaire, interorganite d'éléments génétiques dans les cellules d'ulvophytes. De plus, les analyses phylogénétiques des données structurales et moléculaires dérivées de ces organites supportent fortement l'affiliation entre Ulvophyceae et Chlorophyceae.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les Algues vertes de la classe Chlorophyceae appartiennent au sous-embranchement Chlorophyta, l'une des deux divisions majeures formant le groupe des Algues vertes et des Plantes terrestres. Au moment d'initier le projet de recherche décrit dans cette thèse, seuls les génomes chloroplastiques de Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomo-nadales) et de Scenedesmus obliquus (Sphaeropleales) étaient connus dans cette classe. De surcroît, l'ordre d'apparition des principaux groupes évolutifs (ordres) était incertain. Pour clarifier les relations évolutives chez les Chlorophyceae, mais aussi pour étudier les mécanismes d'évolution du génome chloroplastique, les génomes de cinq représentants appartenant aux trois autres lignées majeures des Chlorophyceae ont été séquences et analysés dans leurs moindres détails. Des analyses phylogénétiques, conduites notamment avec les séquences d'Oedogonium cardiacum (Oedogoniales), de Stigeoclo-nium helveticum (Chaetophorales) et de Floydiella terrestris (Chaetopeltidales), ont montré que les Chlorophyceae sont divisées en deux grands groupes évolutifs : le groupe CS (Chlamydomonadales et Sphaeropleales) et le groupe OCC (Oedogoniales, Chaetophorales et Chaetopeltidales). L'analyse des caractères moléculaires présents dans ces génomes a permis de valider ces conclusions phylogénétiques et de déterminer que les Oedogoniales représentent le groupe frère des Chaetophorales et des Chaetopeltidales. Ces études comparatives ont aussi établi que, chez les Chlorophyceae, le génome chloroplastique est très fluide en termes de structure et affiche les changements les plus marqués par rapport à sa condition ancestrale chez les Algues vertes. Le génome chloroplastique des Chlorophyceae a été sensiblement transformé par la réduction de son répertoire génique, l'importance des réarrangements génomiques et la modification de la structure de certains gènes. Par ailleurs, l'analyse des génomes d'Oedocladium caroli-nianum (Oedogoniales) et de Schizomeris leibleinii (Chaetophorales) a mis en évidence des tendances évolutives bien particulières. Chez les Oedogoniales, de nouveaux gènes ont été acquis à l'occasion de transferts latéraux et des introns de groupe II sont vraisemblablement apparus à la suite de la prolifération intragénomique de quelques introns fondateurs. De même, chez les Chaetophorales, le génome chloroplastique apparaît avoir conservé une architecture singulière qui est compatible avec un mode de replication bidirectionnel à partir d'une origine de replication unique.

Les récents progrès en génomique ont conforté la complexité de l’origine des algues; d’un point de vue de la phylogénie des hôtes de l’endosymbiose, les algues forment un groupe évolutif polyphylétique. Les algues vertes forment deux embranchements majeurs : les Streptophyta et les Chlorophyta. Les chlorophytes comprennent la majorité des algues vertes connues et se regroupent en quatre classes. La première, les Prasinophyceae, occupe la position la plus basale, tandis que l’ordre d’embranchement des trois autres classes (Ulvophyceae, Trebouxiophyceae et Chlorophyceae) demeure encore incertain. Pour clarifier les relations évolutives chez les Clorophyceae, huit génomes chloroplastiques appartenant à la lignée des Chlamydomonadales, lignée majeure des Chlorophyceae, ont été séquencés et analysés. Des études phylogénétiques ont confirmé les classifications préétablies et de nouveaux clades se sont vus formés. Les génomes de ces algues chlorophycéennes ont révélé une architecture conservée avec un certain nombre de caractères spécifiques à la classe des Chlamydomonadales. L’analyse de leurs caractères moléculaires a révélé des génomes marqués par la réduction ou le réarrangement de leur répertoire génomique comparativement aux génomes chloroplastiques des algues vertes plus ancestrales. / Recent advances in genome sequencing and analysis have reinforced the complexity of the origin of the green algae. From the point of view of a host endosymbiotic phylogeny, green algae form a polyphyletic evolutionary group. Green algae form two major branches : the Streptophyta and Chlorophyta. Chlorophytes include the majority of green algae known and they are grouped into four classes. The first, that of Prasinophyceae, occupies the most basal position, while the branching order of the other three classes (Ulvophyceae, Trebouxiophycea and Chlorophyceae) remain uncertain. To clarify the evolutionary relationships amongst Chlorophyceae, eight chloroplast genomes belonging to the lineage of Chlamydomonadales, a major clade of Chlorophyceae were sequenced and analyzed. Phylogenetic studies have confirmed the pre-established classifications and new clades were seen to be formed. The genomes of these chlorophyll algae were revealed to be conserved with a number of specific architectural characters of the Chlamydomonadales class. Analysis of their molecular characteristics revealed a genome marked by the reduction or rearrangement of their genomic repertory compared to chloroplast genomes of the ancestral green algae.

Le climat, la qualité de l’air et la sécurité énergétique ont changé la façon de produire l’énergie, accroissant la demande en cultures énergétiques comme M. x giganteus. Néanmoins, élargir la diversité de cette espèce est nécessaire afin de couvrir une large gamme de pédo-climats. L’objectif est donc de définir des caractères d’intérêt pour mener à bien une collecte de miscanthus en Chine, un des pays où cette plante est originaire. 44 clones sauvages de trois espèces de Miscanthus (M. sinensis, M. sacchariflous, M. floridulus) ont été collectés dans différentes régions Centre, Sud et Ouest de la Chine et multipliés à Linan dans la province chinoise de Zhejiang. En France, nous avons étudié 21 clones implantés à l’INRA d’Estrées-Mons appartenant à 3 espèces (M. x giganteus, M. sinensis and M. sacchariflorus). La thèse comporte cinq chapitres. 1) La bibliographie décrit le miscanthus au niveau de sa taxonomie, de son origine géographique, de son aptitude à produire de la biomasse et de sa résistance à différents stress. 2) Les caractères les plus importants ont été identifiés pour reconnaître les espèces. 3) Nous avons découvert que les M. x giganteus ont un génome maternel commun à des M. sacchariflorus chinois. 4) Parmi les clones sauvages Chinois, M. floridulus présente le plus d’intérêt pour produire de la biomasse. 5) Enfin, nous avons mis en évidence les facteurs physiologiques et biochimiques expliquant l’effet de la disponibilité en azote sur la photosynthèse sur 3 espèces. Ainsi, la plupart des caractères qui ont été mis en évidence au sein de cette thèse vont être utiles pour la collecte de matériel végétal et les programmes de sélection du miscanthus. / Climate, air quality and energy security have recently changed the way energy is supplied and increases the demand for bioenergy crops such as M. x giganteus. However, this species needs to enlarge its diversity to fit different growth conditions. The objective is therefore to identify traits of interest to drive the collecting of miscanthus in China, one of the countries where this plant comes from. 44 wild clones of three species of Miscanthus (M. sinensis, M. sacchariflous, and M. floridulus) were collected from the different regions of central-south-east in China and were propagated in Linan of Zhejiang province of China. In France, we studied 21 clones of three species (M. x giganteus, M. sinensis and M. sacchariflorus) which were established at INRA experimental unit in Estrées-Mons. The thesis is composed of five chapters. 1) The bibliography described miscanthus on the base of its taxonomy, geographical origin, biomass production ability and resistance to different stresses. 2) The most important traits were identified for the recognition of the species. 3) We discovered that the clones of M. x giganteus had maternal genome identical to wild relatives of some of the wild M. saccahariflorus. 4) Among the wild Chinese clones, M. floridulus was the most interesting for biomass production. 5). Finally, we highlighted the physiological and biochemical factors under the influence of nitrogen supply on the photosynthesis of miscanthus. Finally, we concluded that most of the traits we highlighted here will be helpful for future germplasm collection and breeding program of miscanthus.

Les variations climatiques du Dernier Maximum Glaciaire ont fortement affecté la distribution des espèces dans les régions tempérées. Dans les régions tropicales, Haffer (1969) a émis l'hypothèse que la forte diversité spécifique des Néotropiques était liée aux variations climatiques du Quaternaire qui auraient fragmenté le couvert forestier en quelques zones "refuges" provoquant une diversification des espèces par spéciation allopatrique. Un tel effet du climat en Amérique du Sud reste cependant aujourd'hui toujours âprement débattu. Cette thèse a pour objectif de tester par des méthodes génétiques les attendus de la théorie des refuges en Guyane en retraçant l'histoire démographique d'Astrocaryum sciophilum, palmier inféodé aux forêts tropicales humides. L'utilisation de marqueurs microsatellites nucléaires et de séquences chloroplastiques nous a permis d'infirmer l'existence des zones refuges proposées par de Granville (1982) et par Tardy (1998). Bien que mettant en évidence une fragmentation de la forêt tropicale humide, la distribution de la diversité génétique ne laisse pas supposer l'existence de zones refuges en Guyane. Nous avons également montré l'absence de forêt tropicale humide sur la bande littorale antérieurement à 129 000 ans BP, ainsi qu'une recolonisation de proche en proche du littoral depuis le Nord-Ouest jusqu'à Kaw, antérieure au Dernier Maximum Glaciaire. Enfin, pour reconstruire l'histoire démographique d'A. sciophilum à une échelle spatiale très fine, nous avons utilisé la méthode d'inférence bayésienne MSVAR basée sur la théorie de la coalescence, qui permet de détecter et dater des changements de taille de population. Nous avons d'abord testé par simulation la performance de la méthode. L'application de MSVAR à notre jeu de données microsatellites a ensuite permis de mettre en évidence l'existence d'une diminution de taille des populations d'A. sciophilum quasi-généralisée en Guyane, à l'exception des populations de la région littorale située entre Sinnamary et Cayenne, également probablement liés à des évènements antérieurs au Quaternaire récent. Ce travail a ainsi permis de proposer de nouvelles hypothèses quant à l'impact des variations climatiques du Quaternaire ancien (antérieur à la dernière période glaciaire) qui semblent avoir eu des répercussions plus importantes sur la végétation que les variations « récentes » du dernier maximum glaciaire. Des études complémentaires seront nécessaires pour déterminer l'importance relative des différents évènements du Quaternaire dans la répartition des espèces forestières du Bouclier Guyanais et du Bassin Amazonien.

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6. / The autotrophic lifestyle of plants relies entirely on the integrity of chloroplasts and particularly on their biogenesis. Chloroplast gene transcription, performed by a Plastid-Encoded Polymerase (PEP) and two Nuclear-Encoded Polymerases (NEPs), is one of the key steps during the development of photosynthetic chloroplast. There are 3 classes of genes, one transcribed by PEP alone (class I), one by both PEP and NEPs (class II), and the third by NEPs alone (class III). To carry out transcription, PEP associates with plastid sigma factors including the general sigma factor SIG6. sig6 mutants have a pale cotyledon phenotype, a severe decrease in class I gene transcription and a reduction in the level of class I proteins. In our laboratory, we study the role of the two plastid WIHRLY proteins (WHY1 and WHY3) in maintaining plastid genome stability. However, little is known about any role these proteins may play in transcription or chloroplast biogenesis. It seems likely they are involved in plastid gene transcription since they are found in the Plastid Transcriptionally Active Chromosome (PTAC). Moreover, they have been implicated in chloroplast biogenesis in maize. In this study, we verified the implication of these proteins in plastid biogenesis using a genetic approach in which we crossed a sig6 mutant with a why1why3 mutant. We isolated sig6why1 and sig6why3 double mutants and a sig6why1why3 triple mutant. Using a phenotypic characterisation and quantification of some plastid proteins, we show that loss of one of the two Why genes complements the sig6 pale cotyledon phenotype and allows a more normal pattern of expression of plastid proteins that are under-expressed in the sig6 mutant. However, we also show that loss of the two Why genes does not alleviate the sig6 phenotype. Moreover, the triple mutant shows a second pale phenotype on true leaves, and the plastid protein expression pattern is abnormal compared to either sig6 or wild type plants. Those results cannot be explained by the role of WHIRLY proteins in plastid genome stability since the triple mutant shows fewer plastid genome rearrangements than the why1why3 mutant. Finally, we show that inhibition of the PEP polymerase using rifampicin elicits the same complementation of the sig6 phenotype as the loss of one of the two WHIRLY. Together, these results show the implication of WHIRLY proteins in plastid biogenesis in association with SIG6. We propose a model in which WHIRLY act as activators of PEP activity, particularly during the chloroplast biogenesis. Therefore, the absence of one of the WHIRLY would cause a weak inhibition of PEP, facilitating the set-up of a rescue mechanism by NEPs and, consequently, allowing the complementation of plastid biogenesis in the sig6 mutant. However, the absence of the two WHIRLY proteins would cause a strong inhibition of PEP, and the inability of the rescue mechanism by NEPs to compensate for this strong inhibition, resulting in a more severe phenotype in the sig6 mutant.