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Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch entzündliche Gelenkentzündung, deren Ursachen bis dato ungeklärt bleibt. Der Verlauf der Erkrankung führt zu irreversiblem Zerstörung von Knorpel, Knochen und umgebenden Geweben in den betroffenen Gelenken. Es scheint jedoch klar, dass Synovialzellen, Knorpelzellen und Zytokine eine entscheidende Rolle im Fortschreiten der Erkrankung spielen. IL17 ist ein kürzlich entdecktes Zytokine, welches im besonderen Maßen mit der rheumatoiden Arthritis in Verbindung gebracht wird. Es liegt in der Synovialflüssigkeit und im Serum von Patienten mit rheumatoider Arthritis in deutlich höherer Konzentration vor als in anderen Gelenks-zerstörenden Erkrankungen wie z.B. der Osteoarthritis. Eine kürzlich entdeckte Zellpopulation konnte als chondrogene Vorläuferzellen charakterisiert werden. Da sie einen IL17-Rezeptorkomplex exprimieren, ist anzunehmen, dass eine IL17 Stimulation der chondrogenen Vorläuferzellen zu Veränderungen in deren Synthesemustern führt. Methode: Chondrogenen Vorläuferzellen konnten aus menschlichem Knorpel von Patientin mit rheumatoider Arthritis gewonnen und in Kultur gehalten werden. Die Zellen wurden mit IL17 inkubiert und deren Reaktion durch Zellkulturstudien, real-time-PCR, Immunfluoreszenz und western blot untersucht. Ergebnisse: Die IL17 Stimulation der chondrogenen Vorläuferzellen führte zu einer Suppression des Zellwachstums in den ersten Tagen der Zellkultur. Folgende mRNA Moleküle konnten erstmals in den chondrogenen Vorläuferzellen nachgewiesen werden: IL6, IL1,MMP3, MMP14,MMP15, MMP17 NFkB, , MAPK1, IL1, Aggrecan, ADAMTS-5 und TIMP3. Die IL17 Stimulation führte zu einer Erhöhung der Expression von MMP3, MMP17, IL6 und NFkB in den chondrogenen Vorläuferzellen. MMP14 und MMP15 zeigten sich nicht beeinflusst in ihrem Expressionsmuster. Anschließend konnten die Proteine MMP3 und IL6 stellvertretend in den chondrogenen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Ein IL17 Antikörper konnte den zuvor gezeigten Effekt von IL17 auf die IL6 Expression erfolgreich blocken. Schlussvolgerung: chondrogenen Vorläuferzellen scheinen in einem bestimmten Expressionsmuster auf die IL17 Stimulation zu reagieren. Gerade diese Reaktion scheint zum weiteren Fortschreiten der rheumatoiden Arthritis zu führen. Aufgrund der vielen bereits gezeigten Effekte von IL17 auf Gewebe in der rheumatoiden Arthritis scheint IL17 ein vielversprechendes Ziel in der zukünftigen Therapie der Erkrankung darzustellen.

In the field of regenerative medicine, regeneration of cartilage defects (caused either by injury or age-related degeneration, such as osteoporosis) has become a widely discussed topic. Nanofibrous scaffolds provide a suitable environment for cell adhesion, proliferation, differentiation, and also local involvement of bioactive substances. Nanofibrous scaffolds mimic the extracellular matrix (ECM) of hyaline cartilage and thus have the potential to treat cartilage defects. The aim of the work was modulation of chondrogenic differentiation medium through finding the ideal concentration of chondrogenic supplements, composed of ascorbate-2- phosphate and dexamethasone, in the culture of primary chondrocytes of pig origin seeded on a nanofibrous polycaprolactone (PCL) scaffold. The effect of different concentrations of the chondrogenic supplements on chondrocyte adhesion to the scaffold and their proliferation and differentiation was studied. Firstly, the influence of each of the supplements alone in the medium was studied, followed by study of effects of their combinations. Then, the supplements were incorporated into the nanofibers and their effect upon their release from the nanofibers was investiaged. The supplements were studied in 21-day experiments. The chondrogenic re- differentiation was best...

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Parmi les facteurs de risque environnementaux de l'arthrose, la consommation de tabac occupe une place importante, mais reste encore controversée. Parmi les 4000 composés présents dans la cigarette, la nicotine est l'une des molécules les plus actives physiologiquement. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'impact de la nicotine sur les chondrocytes humains et la prolifération et la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton (CSM-GW). Nous avons trouvé que la nicotine aux concentrations utilisées n’a pas d’effet sur la prolifération cellulaire, mais induit une augmentation de l’expression de la métalloproteinase matricielle (MMP13) dans les chondrocytes humains. Ces données suggèrent que la nicotine a un effet pro-catabolique sur les chondrocytes humains, en stimulant la dégradation des composants matriciels. Chez des patients arthrosiques fumeurs, les voies de synthèse et de dégradation des composants matriciels sont plus activées dans les chondrocytes par rapport aux non fumeurs. De plus, la nicotine inhibe la prolifération et la migration cellulaire de CSM-GW, et présente un effet délétère sur la chondrogénèse de CSM-GW. Elle stimule la réaction inflammatoire et la différenciation hypertrophique. Nous avons montré, pour la première fois, l'expression du nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), en particulier de la sous unité α7 dans les CSM-GW aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. L’effet délétère de la nicotine sur les CSM-GW serait probablement médiée par la sous unité α7 nAChR, De façon intéressante, l’α-Bungarotoxin (α-BTX), inhibiteur spécifique de α7 nAChR, peut réverser cet effet partiellement. En conclusion, nous suggérons que la nicotine pourrait altérer l’ontogenèse du cartilage, et induire potentiellement l’augmentation de la prévalence de l’arthrose chez l’adulte / Among the environmental risk factors for osteoarthritis (OA), tobacco consumption features prominently but is still controversial today. Among the 4,000 compounds present in cigarette smoke, nicotine is one of the most physiologically active molecules. The aim of the study is to measure the impact of nicotine on human chondrocytes and on the proliferation and chondrogenic differentiation of Wharton’s Jelly stem cells (WJ-MSC). We found that nicotine at the concentrations used had no effect on the proliferation of primary human OA chondrocytes, but induced an increase in the expression of matrix metalloproteases (MMP13). It unravels the catabolic effects of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. This result suggests a pro-catabolic effect of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. In smokers, the synthesis as well as the degradation pathways in chondrocytes are stimulated, when compared to no smokers. In addition, the cell proliferation and migration of WJ-MSC were significantly impaired by nicotine, and it also had an adverse effect on the chondrogenesis of WJ-MSC by stimulating the inflammatory response and hypertrophic differentiation. We have shown, for the first time, the expression of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), in particular that of the α7 subunit in the WJ-MSC at the transcriptional and translational levels. The adverse effect of nicotine on WJ-MSC was probably mediated by α7 nAChR. Interestingly, α-Bungarotoxin (α-BTX), a specific inhibitor of α7 nAChR, could partially reverse this effect. In conclusion the results show that nicotine has an adverse effect on the ontogenesis of cartilage, and potentially induces an increase in the prevalence of osteoarthritis in adults

Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique / The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations

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Die progrediente, muskuloskelettale Erkrankung Ostheoarthrose wird aufgrund der immer älter werdenden Weltbevölkerung im Jahre 2020 einer der häufigsten Invaliditätsgründe sein. Koelling et al. beschrieb 2009 eine migrierende, chondrogene Progenitorzelllinie (CPC) im Reparaturgewebe der fortgeschrittenen Gonarthrose des Menschen, die Stammzelleigenschaften besitzt. Sie sind multipotent, klonal und besitzen ein osteochondrogenes Expressionsmuster, wodurch sie sich für neue Behandlungsmöglichkeiten bei der Ostheoarthrosetherapie eignen könnten. In dieser Arbeit wurden in vitro drei Klone einer humanen CPC-Population aus osteoarthrotisch verändertem Knorpel hinsichtlich ihrer multipotenten Eigenschaften, Proliferationsgeschwindigkeit und unterschiedlicher Phänotypen gegenübergestellt, da sich bei anderen Stammzelllinien Zusammenhänge zwischen diesen Eigenschaften zeigen, die mit fortgeschrittener Ausdifferenzierung der Stammzellen begründet wird. Die drei Klone IF-8, IIB-6 und IID-4 wurden 12 Tage unter Standardbedingungen in 2D-Flaschenkultur gehalten und anschließend ihr normaler Phänotyp ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass IF-8 und IIB-6 eher einen fibroblastenartigen Phänotyp ausbildeten, während sich bei IID-4 erst kugelige Zellen bildeten, die später teils in eine längliche Form übergingen. Die fibroblastenartige Form entsprach der von CPCs aus heterogenen Kulturen, wohingegen der Phänotyp von IID-4 auf Dedifferenzierung oder fortgeschrittenere Differenzierung schließen ließ. Die Klone für die Differenzierungsversuche wurden mit zwei verschiedenen Zelldichten ausgesät, um auch eventuelle Einflüsse der Zelldichte mit in die Untersuchung einzubeziehen. Es wurde pro Well einmal die Anfangskonzentration von 1000 Zellen gewählt und einmal 3000 Zellen pro Well. Nach sechs Tagen wurden morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop ausgewertet. Die Differenzierung in Adipozyten und Osteoblasten erfolgte insgesamt über zehn Tage mit anschließendem Differenzie- rungsnachweis mittels Oil-Red-Färbung von Adipozyten, bzw. der Alkalischen-Phosphatase-Reaktion der Osteoblasten. Es wurde zusätzlich mit der Immunfluoreszenzzytochemie kontrolliert, ob in den differenzierten Zellen auch spezifische Proteine exprimiert wurden und sich zwischen den Klonen ein quantitativer Unterschied ergibt, der auf einen veränderten Differenzierungsgrad der Klone schließen konnte. Für die Adipozyten wurden Antikörper gegen dieLipoproteinlipase und PPARγ gewählt, bei den Osteoblasten kamen Antikörper gegen Osteocalcin und den osteogenen Transkriptionsfaktor runx-2 zum Einsatz. Allen Differenzierungsversuchen wurden jeweils Kontrollgruppen gegenübergestellt. Die Ergebnisse zeigten morphologische Unterschiede zwischen den Klonen und den verschiedenen Zelldichten, die bei der osteogenen Differenzierung nicht so stark ausgeprägt waren wie bei der adipogenen. Der Klon-IID-4 zeigte auch hier die am Stärksten ausgeprägtesten morphologischen Unterschiede zwischen den Zellen selber und der verschiedenen Dichtegrade. Die quantitative Auswertung mittels Oil-Red und Alkalischer-Phosphatase, bzw. die Ergebnisse der Immunzytochemie ergaben hingegen keine Abweichungen zwischen den Klonen und keine Veränderung in Abhängigkeit zur Zelldichte. Dadurch konnte gezeigt werden, dass bei den CPCs ein veränderter Phänotyp kein Hinweis auf eine fortgeschrittene Zellalterung und verminderte Differenzierbarkeit ist. Auch die Zelldichte nimmt auf die Differenzierung in andere Zelllinien keinen positiven oder negativen Einfluss. Deutliche Unterschiede zwischen den Klonen zeigten sich hinsichtlich ihrer Proliferationsgeschwindigkeit und ihres osteochondrogenen Grundmusters. Für das Proliferationsassay wurden über den Zeitraum von sieben Tagen die Zellzahlen gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass sich Klon-IF-8 am langsamsten teilte, danach folgte IID-4 und am Ende IIB-6. Im Zusammenhang mit dem Western-Blot, bei dem der osteogene Transkriptionsfaktor runx-2 und der chondrogene Transkrip-tionsfaktor sox-9 miteinander verglichen wurden, konnte eine Beziehung zwischen Proliferationsgeschwindigkeit und der Ausprägung der Transkriptionsfaktoren festgestellt werden. Mit Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit nimmt die Expression von runx-2 zu, während die Expression von sox-9 abnimmt. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass die CPCs mit abnehmender Zellteilung in einen vermehrt osteogenen Zustand übergehen und ihren osteochondrogenen Charakter verlieren. Dieser Übergang hat jedoch keinen Einfluss auf ihre multipotenten Eigenschaften. Mit den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass sich CPCs, ähnlich wie andere Progenitorzellen auch, in ihrer Entwicklung weiter ausdifferenzieren und sich dadurch innerhalb einer Population verschiedene Entwicklungszustände ergeben, die eine genauere Charakterisierung der CPCs weiter erschweren.

Le cartilage articulaire est un tissu avasculaire et non innervé, ce qui lui confère des capacités de réparation très limitées. Les traitements chirurgicaux actuels ne permettent pas d’obtenir un tissu de réparation similaire au cartilage natif. Les recherches s’orientent depuis de nombreuses années vers l’ingénierie cellulaire et tissulaire du cartilage selon le type de lésions à traiter, focale ou diffuse. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) constituent une source cellulaire intéressante pour l’ingénierie du cartilage. Elles sont facilement accessibles et ont des potentialités de différenciation chondrogénique. Les CSMs issues de la moelle osseuse sont les plus étudiées et constituent la référence. D’autres sources de CSMs sont également très prometteuses. Notre choix s’est porté sur les CSMs issues de la membrane et du liquide synovial. Ces deux tissus articulaires présentent l’avantage de pouvoir être prélevés facilement lors d’un examen arthroscopique et leurs CSMs sont adaptées au microenvironnement (hypoxie, inflammation) de l’articulation. Ce travail a porté sur l’étude de deux sources cellulaires d’origine synoviale dans le traitement des lésions focales et diffuses du cartilage. Ces CSMs d’origine synoviale ont d’abord été caractérisées selon leurs phénotypes et leurs capacités de différenciation vers les voies ostéogénique, adipogénique et chondrogénique, par rapport aux CSMs issues de la moelle osseuse. Ensuite, les capacités chondrogéniques de ces CSMs synoviales destinées à produire un substitut cartilagineux consacré aux traitements des lésions focales du cartilage articulaire ont été étudiées. Les CSMs ont été ensemencées dans un biomatériau collagénique et différentes conditions environnementales (facteurs de croissance et oxymétrie) ont été évaluées afin de définir les conditions de culture les plus appropriées. La chondrogenèse a été induite avec succès par l’utilisation de facteurs de croissance tels que TGF-1 et TGF-3 seuls ou en association avec la BMP-2. L’hypoxie n’a pas montré d’effet bénéfique sur la synthèse matricielle au sein des substituts cartilagineux. Enfin, nous avons évalué les capacités des CSMs issues du liquide synovial à traiter les lésions diffuses du cartilage induites par un modèle de section du ligament croisé antérieur chez le rat athymique. Les deux injections intra-articulaires de CSMs issues du liquide synovial à 1 et 2 semaines après chirurgie n’ont pas permis de prévenir les lésions arthrosiques. / Joint cartilage is avascular and not innervated, which gives it very limited repair capabilities. Current surgical treatments do not provide repair tissue similar to native cartilage. For many years, research has been focused on cellular and tissue engineering of cartilage depending on the type of lesions to be treated, focal or diffuse. Mesenchymal stem cells (MSCs) are an interesting cellular source for cartilage engineering. They are easily accessible and have the potential for chondrogenic differentiation. MSCs from bone marrow are the most studied and are the gold-standard. Other MSCs sources of are also very promising. We chose MSCs from the synovial membrane and synovial fluid. These both joint tissues have the advantage of being easily retrievable during arthroscopic examination and their MSCs are adapted to the microenvironment (hypoxia, inflammation) of the joint. This thesis work focused on the study of two cellular sources of synovial origin in the treatment of focal and diffuse cartilage lesions. These synovial-derived MSCs were first characterized according to their phenotypes and their ability to differentiate to the osteogenic, adipogenic and chondrogenic pathways, compared to bone marrow derived MSCs. Then, the chondrogenic capacities of these synovial MSCs to produce a cartilage substitute for the treatment of focal lesions of joint cartilage were studied. The MSCs were seeded in a collagenic biomaterial and different environmental conditions (growth factors and oximetry) were evaluated to define the most appropriate culture conditions. Chondrogenesis has been induced with success by the use of growth factors such as TGF-β1 or TGF-β3 alone or in combination with BMP-2. Hypoxia has not exerted a beneficial effect on matrix synthesis in cartilage substitutes.Finally, we evaluated the ability of CSMs from human synovial fluid to treat diffuse cartilage lesions induced by an anterior cruciate ligament section model in athymic rats. The two intra-articular injections of synovial fluid MSCs, 1 and 2 weeks after surgery did not prevent osteoarthritic lesions.