De par leurs propriétés complexante et énantiosélective, les cyclodextrines (CDs) sont largement utilisées dans les industries pharmaceutique, cosmétique, agroalimentaire, etc. ainsi qu'en chimie analytique. Les travaux présentés dans ce manuscrit concernent différents domaines d'étude des CDs : leur caractérisation, leur utilisation en tant que sélecteurs chiraux et l'analyse de leurs complexes.<br />Dans la première partie, une nouvelle CD méthylée faiblement substituée a été caractérisée par différentes techniques analytiques, permettant ainsi l'obtention d'informations complémentaires menant à une meilleure connaissance de la composition du mélange commercial. D'autre part, la séparation par chromatographie en phase liquide (CPL) des trois isomères de la sulfobutyléther-beta-CD monosubstituée a été optimisée sur carbone graphite poreux (PGC) en augmentant la température de la colonne.<br />La deuxième partie a porté sur l'évaluation du système chromatographique PGC / CDs méthylées pour la séparation chirale en CPL. Outre sa grande résistance physique et chimique, le PGC s'est révélé plus sélectif que les colonnes de silice greffée habituellement employées pour ce type de séparation et a nécessité une quantité moindre de CDs dans la phase mobile.<br />Enfin, dans la troisième partie, les complexes de différentes CDs méthylées avec des solutés test ont été étudiés par des expériences de partage liquide-liquide et par spectrométrie de masse à ionisation électrospray. La comparaison des résultats obtenus par ces deux méthodes a révélé que les signaux enregistrés en ESI-SM ne reflètent pas les équilibres existant en solution.

Reproduction de : Mémoire du DES : Pharmacie hospitalière : Nantes : 2008. Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / Un stress oxydatif survient lorsqu’il y a surproduction de dérivés actifs de l’oxygène par rapport aux défenses antioxydantes. Ce déséquilibre est associé, entre autres, à la prééclampsie, une pathologie de la grossesse. Les F2-isoprostanes regroupent soixante-quatre isomères issus de la peroxydation de l’acide arachidonique. Ceux-ci sont reconnus comme étant les biomarqueurs les plus fiables du stress oxydatif in vivo. Une méthode d’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem pour le dosage de sept isomères de F2-isoprostanes dans des échantillons de plasma, de sang et de membranes érythrocytaires a été mise au point et validée. Les F2-isoprostanes dans le plasma ont été corrélés positivement avec plusieurs acides gras trans plasmatiques au troisième trimestre de la grossesse. Contre toute attente, les F2-isoprostanes du plasma, du sang et des membranes érythrocytaires sont moins abondants en prééclampsie par rapport aux contrôles en fin de grossesse. / An oxidative stress is defined as an imbalance between the production of reactive oxygen species and antioxidant defenses of the organism. This imbalance has been associated with preeclampsia, a pathology of the mid-to-late pregnancy. Peroxidation of arachidonic acid generates sixty-four isomers of F2-isoprostanes. The latter are recognized as the most reliable biomarkers of oxidative stress in vivo. A method using liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) for the determination of seven isomers of F2-isoprostanes in plasma samples, whole blood and erythrocyte membranes has been developed and validated. The F2-isoprostanes correlated positively with several trans fatty acids in plasma at end of the pregnancy. Unexpectedly, F2-isoprostanes were less abundant in preeclampsia than in control pregnancies at the third trimester.

Durant les dernières décennies, de nombreux cas d'interactions pharmacocinétiques drogue-drogue ont été répertoriés, menant parfois à des pathologies sérieuses et permanentes. Pour l'industrie pharmaceutique, il s'est alors avéré essentiel de bien caractériser l'activité métabolique de composés en phase clinique. Un des outils développé et utilisé en première ligne lors de la caractérisation des voies impliquées dans la métabolisation d'une drogue est l'essai in-vitro du cytochrome P450. Cet essai, utilisant une préparation hépatique, permet entre autres d'identifier la ou les enzymes responsables lors de la biotransformation d'un médicament. Parmi les différentes techniques d'analyse impliquées lors de la quantitatification de l'activité des enzymes du cytochrome P450, la chromatographie liquide avec détection en spectrométrie de masse demeure certes la plus utilisée et la mieux documentée. Toutefois, une grande diversité de paramètres d'analyse recensés dans la littérature rend la tâche ardue à l'analyste non aguerri. De plus, aucune méthode simple et standardisée, permettant d'évaluer l'activité de l'ensemble des neuf enzymes responsables de la métabolisation de la majorité des médicaments, n'est répertoriée. Dans cette optique, l'objectif du présent projet de maîtrise consistait au développement de stratégies analytiques en chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse, pouvant être appliquées dans n'importe quel laboratoire possédant des instruments d'ancienne ou de nouvelle génération. Pour ce faire, une séparation tant en chromatographie liquide haute performance (HPLC) qu'en chromatographie liquide ultra performance (UPLC) a été mise au point. De surcroît, l'utilisation de spectromètres de masse à simple (MS) ou à triple quadripole (MS/MS) a été étudiée, dans le but de quantifier les metabolites des différents essais.

La recherche en protéomique s' est développée en étant intimement liée à l' apparition d' outils analytiques sophistiqués et à haut débit tels que les spectromètres de masse (MS). Cependant, des méthodes permettant l'analyse rapide et efficace de ces données, telle que l'analyse multivariée, pourrait procurer des outils intéressants pour tout laboratoire de bioprocédés se spécialisant dans la production de protéines recombinantes. Ces travaux représentent une percée technologique en suivi et contrôle de bioprocédé. En effet, l'emploi de l'analyse multivariée sur des données de chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse (LCMS) afin d'identifier des isoformes protéiques et de suivre la production de protéines constitue une innovation significative pouvant mener à de nombreuses applications industrielles. Ces techniques procurent de nouvelles avenues pour l' optimisation et le contrôle de qualité pour des procédés de production de protéines recombinantes par culture cellulaire. Trois modèles expérimentau, x furent employés et analysés pour cette thèse. Des albumines purifiées de différentes origines animales ayant des similarités de séquence variant de 69,6 % à 92,4% et des masses moléculaires à l'intérieur de marges de ± 0,7% furent employées afin de démontrer la capacité de l'analyse multivariée à correctement distinguer des isoformes. Le suivi d'une culture cellulaire (HEK293) infectée par un adénovirus (Ad5- CMV-GFPsg25) par analyse multivariée des signaux LCMS fut aussi exécuté. Ce suivi permit d'identifié automatiquement les protéines produites au cours du processus et d'effectuer directement leur quantification. Finalement, ces techniques furent aussi appliquées à l'analyse de signaux provenant d'un spectromètre de mase en tandem (MS/MS) de type quadrupôle temps d'envol (Quadrupole Time Of Flight QTOF) pour l'étude de mélanges protéiques dans un contexte de recherche de biomarqueurs. Étant donné la capacité des algorithmes développés dans cette thèse de distinguer de petites différences entre des spectres de protéines, de directement identifier et quantifier une protéine d'intérêt dans un contexte de bio production et également de sélectionner les zones corrélées avec des peptides d'intérêt pour augmenter la sensibilité des études protéomiques, nos résultats indiquent que l'analyse multivariée des signaux LCMS ou LCMSIMS peut contribuer significativement au suivi, contrôle de qualité et diagnostic des bioprocédés lors de production de protéines recombinantes par des cultures cellulaires. 1

Notre laboratoire, Laboratory of Biochemical Pharmacology (LOBP), dirigé par Dr R.F. Schinazi, est spécialisé dans la recherche sur les nucléosides analogues et plus particulièrement les inhibiteurs de la transcriptase inverse. Au sein de ce laboratoire, l'équipe de pharmacologie a pour rôle d'étudier le métabolisme des molécules en développement ainsi que des molécules déjà commercialisées dans des cellules humaines en culture. Les résultats obtenus guident les chimistes vers une synthèse de composés plus actif et moins toxiques. Pour les molécules les plus avancées, comme l'amdoxovir TM , les études réalisées au laboratoire relèvent du stade II d'essai clinique. Le rôle de l'équipe analytique est de réaliser toutes les mesures liées aux essais cliniques et cellulaires. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser des instruments permettant des mesures spécifiques avec une sensibilité suffisante pour mesurer des quantités de l'ordre du ppb. Notre choix s'est donc porté sur la chromatographie haute performance en phase liquide couplée à un spectromètre de masse de type triple quadrupôle. Puisque seuls les métabolites phosphorylés des nucléosides analogues sont actifs dans les cellules, il fut nécessaire de développer une méthode pour analyser ces composés polaires. Cette méthode, présentée dans le premier chapitre, permet l'analyse simultanée de la plupart des métabolites de nucléosides analogues commercialisés, ceux de l'amdoxovir et des nucléotides naturels présents dans les cellules. Les limites de détections sont telles que de très faibles niveaux de triphosphates ont pu être quantifiés dans les macrophages. Ces résultats sont présentés à la fin du second chapitre. Dans le deuxième chapitre, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur le métabolisme de l'amdoxovir dans les lymphocytes. Pour cela, nous avons testé l'amdoxovir en présence de nucléosides susceptible d'inhiber sa phosphorylation. Puis nous avons établit l'absence d'interaction directe entre l'amdoxovir et trois autres nucléosides analogues commercialisés. Finalement, des études plus poussées sur les nucléotides naturels donnent une indication pour expliquer les effets synergiques entre l'amdoxovir et la zidovudine. Dans le dernier chapitre, nous présentons le développement et la validation d'une méthodologie permettant de mesurer simultanément les niveaux d'amdoxovir, de son métabolite principal et de la zidovudine dans des échantillons de plasma humain. Cette méthode a été appliquée à une étude clinique dont les résultats sont brièvement décrits.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Science des agroressources : Toulouse, INPT : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 109 réf.

L’enrichissement préférentiel (PE) est un procédé de brisure de symétrie spontanée non-usuel développé par le groupe du Pr Tamura à la fin des années 90. En commençant avec une solution avec un léger excès énantiomèrique et une haute sursaturation, le système dévie de la cristallisation classique, en conditions stagnantes (hors équilibre) vers une solution très enrichie et des cristaux légèrement enrichis dans le contre énantiomère. L’objectif de cette thèse est d’évaluer le procédé de PE avec le cas d’étude du Fumarate d’Arginine dans un mélange eau/éthanol, pour obtenir une meilleure compréhension de son mécanisme. Les principaux résultats de ce travail peuvent être résumé ainsi :– En réalisant un suivi temporel conduit par l’arrêt d’expérience à 11 différents temps le PE apparaît être un procédé continu ;– Les expériences de diffraction des rayons X montrent que les transitions polymorphiques ne sont pas requises pour le procédé de PE, différentes phases ou successions de phases peuvent conduire à des résultats identiques de PE ;– Des échanges entres énantiomères de la solution mère et des cristaux déposés ont été démontrés par addition de L-Arginine marquée comme contre énantiomère durant des expériences commençant avec un excès de D-Arginine. Pour conclure ce manuscrit un mécanisme révisé du PE comme procédé continu est proposé. Les critères pour faire fonctionner le PE sont réduits à quatre : i) une forte différence de solubilité entre les énantiomères purs et le composé racémique ; ii) le composé racémique doit avoir un domaine de solution solide ; iii) le système doit rester stagnant durant tout le procédé ; iv) la composition initiale doit être dans une zone appropriée du diagramme de phase (pour le cas du Arg-Fum : un e.e. < 12% et un β ≥ 4). / Preferential Enrichment (PE) is an unusual spontaneous symmetry breaking phenomenon developed by Prof. Tamura’s group in the late nineties. Starting with a slightly enriched in one enantiomer, highly supersaturated solution, this out of equilibrium process permits the system to deviate from standard crystallization, in stagnant conditions, in order to obtain a highly enriched mother liquor and deposited crystals slightly enriched in the opposite enantiomer. The objective of this thesis is to assess the process of PE with the case study of Arginine Fumarate in water/ethanol mixture to obtain a better understanding of its mechanism. The main results of this work can be summarized as:– Using time monitoring performed by stopping experiments at 11 different times, PE appeared as a continuous process;– In situ X-Ray powder diffraction experiments showed that polymorphic transitions are not required for PE, different phases or successions of phases can achieve identical results of preferential enrichment;– Exchanges between enantiomers of mother liquor and the deposited crystals were demonstrated by addition of labeled-L-Arginine as counter enantiomer during experiments starting with an excess of D-Arginine.To conclude this work a revised mechanism for PE as a continuous process is proposed. Criteria to achieve PE are reduced to four: i) a strong difference of solubility between pure enantiomers and racemic compound; ii) the racemic compound should crystallize with a solid solution domain; iii) the system should stay stagnant during the complete process; iv) the initial composition should be in the appropriate zone of the phase diagram (e.g. for Arg-Fum system a e.e. < 12% and a β ≥ 4).

Le développement de nouveaux donneurs d’oxyde nitrique (NO) dans le traitement chronique des maladies cardiovasculaires nécessite l’étude de leur biodisponibilité après administration par voie orale. Les S-nitrosothiols (RSNOs) apparaissent d’intéressants candidats médicaments pour ce faire, et l’étude de leur perméabilité intestinale est une première étape indispensable. Il est nécessaire de disposer d’une méthodologie analytique suffisamment sensible et sélective, en particulier permettant de différencier entre la production endogène de NO, l’apport alimentaire en ions nitrites et nitrate et le médicament lui-même. Nos travaux de thèse ont consisté à utiliser le S-nitrosoglutathion (GSNO) comme modèle après son marquage par l’isotope stable 15 de l’azote (15N). La dérivation du 15NO libéré par deux méthodes conventionnelles (méthode de Griess conduisant à la formation d’un adduit azoïque ; réaction avec le 2,3-diaminonaphtalène (DAN) formant l’adduit 2,3-naphtotriazole (NAT)) et l’étude de la fragmentation en spectrométrie de masse tandem (MS/MS) des deux adduits correspondants ont mené à sélectionner la dérivation par le DAN comme étant la plus sensible. Une transition originale résultant de la fragmentation du NAT en mode Higher-energy Collisional Dissociation (HCD) au lieu du mode conventionnel Collisionally Induced Dissociation (CID) a été mise en évidence ; elle permet d’atteindre une limite de quantification de 5 nM (soit 20 fois plus basse que celle offerte par la fluorescence). La méthode LC-MS/MS a été validée et appliquée à l’étude de la perméabilité intestinale du GS15NO par deux modèles : l’un in vitro (monocouche de cellules épithéliales type Caco-2), l’autre ex vivo (intestin de rat isolé (ileum) dans une chambre de Ussing). Les valeurs de perméabilité apparente calculées à partir des concentrations des métabolites du GS15NO (ions nitrites, nitrates et RSNOs) le classent comme un médicament de perméabilité intermédiaire. En outre, des études sur les mécanismes de dénitrosation du GSNO ont été menées sur intestin isolé, démontrant en particulier le rôle d’enzymes telles que la γ-glutamyltransférase et la protein disulfide isomerase / The development of innovative nitric oxide (NO) donors for the chronic treatment of cardiovascular diseases implies their bioavailability studies after oral administration. S-nitrosothiols (RSNOs) look interesting drug candidates for this purpose and evaluating their intestinal permeability appears the first step to be realized. Thus, an analytical method offering high sensitivity is needed; moreover this method should be selective by differentiating between the endogenous production of NO, the intake of nitrite and nitrate ions via the diet, and the drug itself. Our work consisted in using S-nitrosoglutathione (GSNO) labeled with the stable nitrogen isotope 15 (15N) as a model. Released 15NO species were derivatized by two conventional methods: Griess method leading to the formation of an azo adduct; reaction with 2,3-diaminonaphthalene (DAN) producing 2,3-naphtotriazole (NAT); fragmentation studies of the two adducts by tandem mass spectrometry (MS/MS) allow the selection of DAN method because it provides the highest sensitivity. An original transition resulting from the NAT fragmentation in Higher-energy Collisional Dissociation (HCD) mode instead of the conventional Collisionally Induced Dissociation (CID) mode was pointed out and permitted to reach a limit of quantification of 5 nM (20 fold less than when using fluorescence). The LC-MS/MS method was validated and applied to the GS15NO intestinal permeability studies with two models: in vitro (a monolayer of Caco-2 epithelial cells), and ex vivo (isolated intestine of rat (ileum) in an Ussing chamber). The apparent permeability values calculated with concentrations of GS15NO metabolites (nitrite, nitrate ions and RSNOs) classify it as a middle permeable drug. Studies on GSNO denitrosating processes using isolated rat intestine demonstrate that the enzymes γ-glutamyltransferase and protein disulfide isomerase play a pivotal role

La séparation des énantiomères de principes actifs pharmaceutiques suscite un vif intérêt en raison des propriétés pharmacologiques, toxicologiques ou biologiques différentes qui peuvent exister entre deux isomères optiques. Le développement de méthodes d'analyse spécifiques et sensibles est donc nécessaire afin de contrôler la présence de traces de l'énantiomère inactif dans des lots de fabrication de médicaments.<br /> L'utilisation d'un détecteur à dichroïsme circulaire en chromatographie en phase liquide a permis de déterminer simultanément les puretés optique et chimique de plusieurs principes actifs pharmaceutiques. La sensibilité de la détection dichroïque est toutefois influencée par différents facteurs (nature des chromophores de l'analyte, pH de la phase mobile, température de la cellule de détection, utilisation d'un filtre électronique). Malgré un manque de sensibilité, le détecteur à dichroïsme circulaire permet de déterminer rapidement la pureté énantiomérique de principes actifs en CPL, sans séparation préalable des énantiomères sur un support chiral.<br /> D'autre part, l'aptitude de l'électrophorèse capillaire à séparer des énantiomères de pesticides possédant des hétéroatomes comme centres d'asymétrie a été confirmée. Ainsi, la séparation des énantiomères d'un pesticide organophosphoré et de ses deux métabolites chiraux a été réalisée. Cette méthode a été pré-validée puis appliquée à des matrices environnementales.<br /> Enfin, la simplicité d'utilisation et la sensibilité de la détection conductimétrique sans contact à couplage capacitif sont des atouts indéniables lors de la détermination de la pureté énantiomérique d'amines dénuées de groupements chromophores en électrophorèse capillaire.