La chymosine, enzyme utilisée dans l´industrie fromagère pour coaguler le lait, est traditionnellement extraite à partir du quatrième estomac de veaux non sevrés. La préparation ainsi obtenue dénommée présure a été depuis un certain nombre d´années substituée par divers coagulants d´origine microbienne et de plantes car la production de cette enzyme seule n´était plus capable de répondre à la demande mondiale du fait notamment de l´augmentation de la production fromagère. La chymosine est cependant toujours considérée comme étant la meilleure enzyme pour coaguler le lait dans l´industrie fromagère. Ainsi, les techniques d´ingénierie génétique ont été utilisées pour produire de la chymosine bovine recombinante. C´est en utilisant ces techniques que nous proposons d´établir un procédé de production de chymosine bovine recombinante permettant l'innovation technologique et contribuant au maintien et au développement d'entreprises agro-alimentaires brésiliennes et des pays du Marché Economique du « Cone Sul » (MercoSul).<br />Nous avons ainsi cloné les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire. Nous avons observé la présence de mutations dans la partie du propeptide de la prochymosine A et dans la partie mature de la prochymosine B. Cette dernière mutation, S79N, se situe dans la partie du tampon (résidus 72 à 86) qui constitue une anse externe mobile recouvrant le sillon du site actif. La conformation de ce tampon est caractéristique de la chymosine et serait en partie responsable pour sa grande spécificité. Nous avons modélisé cette mutation, qui semble entraîner des changements dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon. Les séquences obtenues ont ainsi été introduites dans différents vecteurs d´expression puis clonées chez Escherichia coli et Pichia pastoris. L'expression des protéines a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et au moyen de tests d'activité. Les différentes protéines sont toutes actives et ont été purifiées à l'homogénéité. Nous avons alors étudié leurs propriétés cinétiques à l'aide de différents substrats. Les chymosines B et BS79N ont un optimum de pH qui les différencie de la chymosine A. Le mutant B S79N a des propriétés cinétiques améliorées avec l´hexapeptide synthétique. La mutation S79N n´entraîne toutefois qu´une petite augmentation de la constante d´efficacité concernant les hydrolyses de la caséine Κ et du lait, bien que ses vitesses de réactions catalytiques soient supérieures à celles de la chymosine B. Ces résultats sont expliqués par les modifications dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon, et par le fait que le nombre d'interactions entre le substrat et l'enzyme est une fonction de la masse moléculaire et de la nature du substrat.

L'objectif de ce travail était d'étudier l'influence qu'exerce la microstructure des matrices laitières sur la diffusion moléculaire.<br />Une première partie de ce travail a permis d'étudier la diffusion de sondes de taille variable, des polyéthylèneglycols (PEGs), dans des gels de caséines ayant différentes structures. Les variations des coefficients de diffusion ont été reliées à la porosité du réseau. Dans un second temps, ces résultats ont été complétés par la mesure en continu de la diffusion de sondes par RMN au cours de la formation des gels de caséines. Deux tailles de PEG ont été sélectionnées et leur diffusion a été mesurée au cours des procédés de coagulation présure, acide et mixte. L'évolution de la diffusion de la sonde de petite taille a été reliée aux modifications de structure et de porosité des agrégats micellaires, tandis que la diffusion du PEG de plus grande taille a été expliquée par la porosité du réseau. La confrontation de ces résultats avec des mesures rhéologiques et des images de microscopie électronique à balayage a permis de mettre en évidence les potentialités de la technique RMN à gradient de champ pulsé pour étudier les microstructures des matrices caséiques à différentes échelles.