Contexte. Le cancer bronchopulmonaire (CBP) demeure la première cause de mortalité par cancer dans le monde. Malgré l’espoir suscité par le développement des thérapies ciblées, son pronostic demeure sombre, particulièrement dans les cas de CBP à petites cellules (CBP-PC) et de CBP non à petites cellules (CBP-NPC) présentant une activation de l’oncogène KRAS. Matériel et Méthodes. Nous avons mené 3 études successives, visant à (i) radiosensibiliser des modèles de CBP-PC par l’ajout d’un inhibiteur de BCL2, (ii) cibler des modèles de CBP-NPC mutés KRAS par l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF, et (iii) créer un modèle préclinique orthotopique murin de CBP reproduisant la progression tumorale observée en clinique. Résultats. Dans la première étude, l’inhibiteur de BCL2 oblimersen a présenté un effet radiosensibilisant sur des modèles de CBP-PC, in vitro et in vivo. Dans la seconde étude, l’association de l’inhibiteur de mTOR everolimus et de l’inhibiteur de RAF/VEGFR RAF265 a présenté un effet synergique sur des lignées cellulaires de cancers présentant la double mutation de KRAS et de PIK3CA, in vitro et in vivo. Dans la troisième étude, l’injection orthotopique d’une lignée bioluminescente de CBP-NPC chez des souris nude a permis d’établir des tumeurs intra pulmonaires évoluant vers une extension métastatique ganglionnaire et hématogène, et de détecter la présence de cellules tumorales circulantes. Conclusion. L’association d’un inhibiteur de BCL2 à la radiothérapie est une stratégie intéressante dans le CBP-PC, l’association d’un inhibiteur de mTOR et d’un inhibiteur de RAF/VEGFR est une stratégie intéressante dans le CBP-NPC présentant une double mutation KRAS-PIK3CA, mais ces données doivent être confirmées sur des modèles orthotopiques afin de gagner en pertinence avant d’envisager un transfert en clinique. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related mortality worldwide. Activation of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-AKT and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue (KRAS) can induce cellular immortalization, proliferation, and resistance to anticancer therapeutics such as epidermal growth factor receptor inhibitors or chemotherapy. This study assessed the conséquences of inhibiting these two pathways in tumor cells with activation of KRAS, PI3K-AKT, or both. We investigated whether the combination of a novel RAF/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor, RAF265, with a mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, RAD001 (everolimus), could lead to enhanced antitumoral effects in vitro and in vivo. To address this question, we used cell lines with different status regarding KRAS, PIK3CA, and BRAF mutations, using immunoblotting to evaluate the inhibitors, and MTT and clonogenic assays for effects on cell viability and proliferation. Subcutaneous xenografts were used to assess the activity of the combination in vivo. RAD001 inhibited mTOR downstream signaling in all cell lines, whereas RAF265 inhibited RAF downstream signaling only in BRAF mutant cells. In vitro, addition of RAF265 to RAD001 led to decreased AKT, S6, and Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 phosphorylation in HCT116 cells. In vitro and in vivo, RAD001 addition enhanced the antitumoral effect of RAF265 in HCT116 and H460 cells (both KRAS mut, PIK3CA mut); in contrast, the combination of RAF265 and RAD001 yielded no additional activity in A549 and MDAMB231 cells. The combination of RAF and mTOR inhibitors is effective for enhancing antitumoral effects in cells with deregulation of both RAS-RAF and PI3K, possibly through the cross-inhibition of 4E binding protein 1 and S6 protein. We then focus on animal models. Preclinical models of NSCLC require better clinical relevance to study disease mechanisms and innovative therapeutics. We sought to compare and refine bioluminescent orthotopic mouse models of human localized NSCLC. Athymic nude mice underwent subcutaneous injection (group 1-SC, n = 15, control), percutaneous orthotopic injection (group 2-POI, n = 30), surgical orthotopic implantation of subcutaneously grown tumours (group 3-SOI, n = 25), or transpleural orthotopic injection (group 4-TOI, n = 30) of A549-luciferase cells. Bioluminescent in vivo imaging was then performed weekly. Circulating tumour cells (CTCs) were searched using Cellsearch® system in SC and TOI models Group 2-POI was associated with unexpected direct pleural spreading of the cellular solution in 53% of the cases, forbidding further evaluation of any localized lung tumour. Group 3-SOI was characterized by high perioperative mortality, initially localized lung tumours, and local evolution. Group 4-TOI was associated with low perioperative mortality, initially localized lung tumours, loco regional extension, and distant metastasis. CTCs were detected in 83% of nude mice bearing subcutaneous or orthotopic NSCLC tumours. Transpleural orthotopic injection of A549-luc cells in nude mouse lung induces localized tumour, followed by lymphatic extension and specific mortality, and allowed the first time identification of CTCs in a NSCLC mice model.

Foram desenvolvidos estudos de modelagem e simulação numérica de escoamentos bifásicos gás-sólido na coluna ascendente de leitos fluidizados circulantes utilizando um modelo Euleriano de duas fases separadas. O sistema de equações diferenciais parciais conservativas governantes foi obtido através de um procedimento tradicional. Ambas as fases foram assumidas como meio contínuo. Aplicou-se o procedimento de médias estatísticas de Euler, enfatizando a obtenção dos modelos hidrodinâmicos A e B desenvolvidos no IIT/ANL. Realizou-se análise comparativa de correlações para transferência de quantidade de movimento na interface. Discutiu-se a formulação de condições de contorno apropriadas. As equações diferenciais parciais médias foram discretizadas em volumes de controle Eulerianos. As equações de continuidade foram resolvidas implicitamente. As equações de quantidade de movimento foram resolvidas através de um procedimento explícito-implícito. Foram desenvolvidas simulações numéricas para uma coluna ascendente típica de leitos fluidizados circulantes. Desenvolveu-se análise paramétrica da influência de vários aspectos físicos e matemáticos sobre o escoamento. Avaliou-se resultados de simulação através de metodologia de identificação e caracterização de estruturas coerentes. Estudou-se o efeito da função de arrasto na interface sobre os processos dinâmicos que caracterizam estas estruturas coerentes. Foram realizados estudos numéricos de turbulência a partir de resultados de simulação direta. Várias conclusões e recomendações para futuros trabalhos foram propostas com base nas análises realizadas. Foram apresentadas algumas considerações gerais relativas a aspectos críticos na modelagem e simulação com modelo das duas fases separadas. / Studies were carried out on modeling and numerical simulation of gas-solid two-phase flows in the riser of circulating fluidized beds using an Eulerian two-fluids model. The system of conservative partial differential governing equations was derived through a traditional procedure. Both phases were assumed as a continuum. The Euler averaging procedure was applied emphasizing the derivation of the so called hydrodynamic models A and B developed at IIT/ANL. A comparative analysis was performed among correlations for momentum transfer at the interface. The formulation of suitable boundary conditions was discussed. The average partial differential conservative equations were discretized on Eulerian control volumes. The continuity equations were solved implicitly. The momentum equations were solved through an explicit-implicit procedure. Numerical simulation was performed for a typical circulating fluidized bed riser. A parametric analysis was carried out regarding the influence on the flow of various physical and mathematical aspects. Results of simulation were evaluated through a methodology of identification and characterization of coherent structures. The effect of the interface drag function on dynamic features of those coherent structures was addressed. Numerical studies on turbulence were performed from results of direct simulation. Several conclusions and recommendations for future work were put forward on the basis of the performed analyses. Some general considerations were presented regarding critical features of modeling and simulation through Eulerian two-fluids models.

Nous avons abordé dans l’ensemble de nos travaux deux paramètres importants pour l’immunomonitoring des patients atteints d’un cancer : les cellules tumorales circulantes (CTC) comme un indicateur de la « charge antigénique tumorale » et la réponse immune lymphocytaire T spécifique d’antigènes associés aux tumeurs (AAT). Nous avons évalué d’abord la valeur diagnostique et pronostique des CTC dans les cancers des voies aérodigestives supérieures (« HNSCC » en anglais) par une revue systématique et meta-analyse de la littérature. Les preuves actuelles identifient le test de détection de CTC comme un test extrêmement spécifique, mais de faible sensibilité dans les HNSCC. En outre, la présence de CTC indique une DFS (« disease free survival ») inférieure. Nous rapportons également pour la première fois un cas rare d’énumération extrêmement élevée de CTC détectées par le système CellSearch® chez un patient présentant un carcinome épidermoïde de la cavité buccale en utilisant. Le nombre absolu de CTC pourrait donc prédire une phase particulière de développement du cancer ainsi qu'une mauvaise survie, contribuant potentiellement à une prise en charge médicale personnalisée. De plus, nous décrivons une adaptation de la méthode CellSearch® qui nous avons développée pour détecter les cellules tumorales dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de méningites carcinomateuses. Cette nouvelle approche permet une sensibilité nettement améliorée en comparaison avec la cytologie conventionnelle. La technologie CellSearch®, appliquée à des volumes limités des échantillons et permettant une augmentation du temps pré-analytique, pourrait ainsi avoir un grand intérêt dans le diagnostic de métastases leptoméningées chez les patients atteints d’un cancer d’origine épithéliale. Par une évaluation concomitante des CTC et des réponses lymphocytaires spécifiques aux AAT chez 24 patients avec HNSCC, nous avons trouvé que les CTC pourraient être un indicateur indépendant de la charge tumorale immunogène. L'absence de CTC, la présence de lymphocytes T spécifiques aux AAT, ou la combinaison de ceux-ci, étaient tous des paramètres montrant une tendance pour une meilleure survie globale ou une survie sans maladie. L’amplitude et les signatures fonctionnelles des lymphocytes T spécifiques aux AAT chez les patients atteints de HNSCC étaient associées à la présence de CTC. Ces résultats suggèrent qu’une évaluation concomitante de ces deux paramètres pourrait être plus informative sur le pronostic et potentiellement sur l’impact des traitements (notamment dans la perspective d’un traitement par des « immune checkpoints ») / We have evaluated herein two important parameters in the immunomonitoring of cancer patients: circulating tumor cells (CTC) as an indicator of “tumoral antigenic load” and tumor-associated antigens (TAA) specific T-cells. We firstly evaluated the diagnostic and prognostic value of CTC in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) by a systematic review and meta-analysis. We came to the conclusion that current evidence identifies the CTC detection test as an extremely specific but low sensitive test in HNSCC. In addition, the presence of CTC indicates a worse disease-free disease (DFS). Also, we report for the first time a rare case of extremely high enumeration of circulating tumor cells detected in a patient with squamous cell carcinoma of the oral cavity using the CellSearch® system. The absolute number of CTC could therefore predict a particular phase of cancer development as well as a poor survival, potentially contributing to personalized health. In addition, we describe an adaptation of the CellSearch® method that we have developed for detecting tumor cells in the cerebrospinal fluid of patients with carcinomatous meningitis. This new approach reaches a significantly improved sensitivity compared to conventional cytology. CellSearch® technology, applied to limited sample volumes and allowing an increased pre-analytical time, may be of great interest in the diagnosis of leptomeningeal metastases in patients with epithelial cancer. By a concomitant evaluation of CTC and TAA-specific lymphocyte responses in 24 HNSCC patients, we describe that CTC could be an independent indicator of immunogenic tumor burden. The absence of CTC, the presence of TAA-specific T-cells, or the combination of these, were all parameters showing a trend for a better overall survival or DFS. The amplitude and functional signatures of TAA-specific T-lymphocytes in patients with HNSCC were associated with the presence of CTC. These results suggest that a concomitant evaluation of these two parameters may be more pertinent for prognosis assessment as well as for treatment impact, especially in “checkpoint-inhibitors” new immunotherapies

Les phénomènes cicatriciels et de carcinogenèse partagent des points communs et peuvent être définis comme des processus complexes et adaptatif régulés par les interactions entre l'hôte et le microenvironnement tissulaire. Après la chirurgie, la radiothérapie est la seconde modalité la plus efficace dans le traitement du cancer et une approche thérapeutique multimodale impliquant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie est aujourd’hui classiquement utilisée. Des résultats récents suggèrent que, en plus des effets létaux sur les cellules tumorales, la radiothérapie modifie le microenvironnement tissulaire. Ces modifications affectent le phénotype cellulaire, le métabolisme des tissus, et les événements de signalisation entre les cellules.Les interactions complexes entre les cellules stromales et les cellules cancéreuses suscitent beaucoup d’intérêt et dans la première partie de ma thèse, j’ai exploré les interactions entre stroma et cellules de carcinome en réponse à la radiothérapie par modulation génétique du stroma après irradiation. J’ai constaté que les fibroblastes, indépendamment de leur statut RhoB, ne modulaient pas la radiosensibilité intrinsèque des TC- 1, mais produisaient des facteurs diffusibles capables de modifier le devenir des cellules tumorales. Ensuite, j’ai constaté que fibroblastes sauvages et RhoB déficients stimulaient la migration des TC-1 par des mécanismes distincts, impliquant respectivement TGF- β1 et MMP. J’ai également constaté que la co-irradiation, des fibroblastes et des TC- 1, abrogait le phénotype pro-migratoire des TC-1 par répression de la sécrétion du TGF- β et des MMP. Alors que le protocole de co-irradiation utilisé mime la situation clinique, mes résultats sont en désaccord avec les publications récentes et suggèrent que le stroma irradié ne renforce pas la migration des cellules tumorales mais au contraire pourrait être manipulé pour promouvoir une réponse immunitaire anti-tumorale.Deuxièmement, mes expériences in vivo, semblent confirmer les données obtenues in vitro et montrent que l’irradiation préalable du lit tumoral ne stimule ni croissance de la tumeur et ni sa dissemination. Nos résultats semblent montrer que l’irradiation du stroma ne favorise pas la migration des cellules de carcinome et ceci indépendamment de leur génotype. La Troisième Partie De Mon Projet, a été consacrée à l’étude des cellules tumorale circulantes (CTC) après la radiothérapie. En accord avec les résultats rapportés après la chirurgie, le nombre de CTC augmente dans la circulation sanguine après radiothérapie probablement à cause des lésions vasculaires radio-induites ou/et par induction d’EMT dans les cellules tumorales. Néanmoins ces CTC semblent être piégées dans la cavité cardiaque. La signification de la présence de ces CTC pour le développement métastatique n’est pas élucidée mais on peut suspecter un effet promoteur de métastase. Ainsi le microenvironnement pourrait avoir des effets antagonistes promoteurs ou inhibiteurs de malignité. / Wound healing and carcinogenesis are defined as complex, adaptive processes which are controlled by intricate communications between the host and the tissue microenvironment. A number of phenotypic similarities are shared by wounds and cancers in cellular signaling and gene expression. Radiotherapy is the second most effective modality of cancer treatment after surgery and can be used, either alone or in combination with chemotherapy. Recent findings suggest that radiotherapy apart from tumor cell death also rapidly and persistently modifies the tissue microenvironment. These modifications affect cell phenotype, tissue metabolism, bidirectional exchanges and signaling events between cells. The complex interactions between stromal cells and cancer cells are of immense interest and in The First Part of My Thesis, I tried to explore the crosstalk between stromal and carcinoma cells in response to radiotherapy by genetic modulation of the stroma and irradiation. We found that fibroblasts, irrespective of their RhoB status, do not modulate intrinsic radiosensitivity of TC-1 but produce diffusible factors able to modify tumor cell fate. Then we found that Wt and RhoB deficient fibroblasts stimulated TC-1 migration through distinct mechanisms respectively, TGF-β1 and MMP-mediated. We also found that co-irradiation of fibroblasts and TC-1 abrogated the pro-migratory phenotype by repression of TGF-β and MMP secretion. This result is highly relevant to the clinical situation and suggests that conversely to, the current view; irradiated stroma would not enhance carcinoma migration and could be manipulated to promote anti-tumor immune response. Secondly, our in vivo experiments, tends to confirm the in vitro data showing that irradiated tumor bed does not stimulate tumor growth and escape. Our results also challenges the view that irradiated stroma would promote migration of carcinoma cells as we show that independently from their genotype co-irradiation of fibroblasts and carcinoma cells repressed carcinoma cell migration and confirmations studies are currently performed in vivo. The Third Part of My Project, was dedicated to investigate the effect on CTC release after radiotherapy. Consistently with the results reported after surgery , the number of CTC increases in the blood stream after radiotherapy probably due to radiation-induced vascular injury induced or/and by EMT induction in tumor cells but these cells seemed to be entrapped into the cardiac cavity. The significance of these CTC to metastatic development is still under investigation but there is evidence for a metastasis-promoting effect of RT from animal studies.Thus the microenvironment can exert antagonist stimulatory or inhibitory effects on malignant cells.

L'objectif principal de notre étude est de développer des algorithmes rapides pour une conception optimale et une implantation de très faible complexité des filtres numériques. Le critère d'optimisation choisi est celui de la minimisation de l'erreur quadratique moyenne. Ainsi, nous avons étudié et développé de nouveaux algorithmes de synthèse des filtres à réponse impulsionnelle finie (RIF) associés aux deux techniques de filtrage par blocs, overlap-save (OLS) et overlap-add (OLA). Ces deux techniques de filtrage RIF consistent à traiter le signal par blocs au moyen de la transformée de Fourier rapide (TFR) et permettent ainsi de réduire la complexité arithmétique des calculs de convolution. Les algorithmes que nous avons proposés sont basés sur le développement du modèle matriciel des structures OLS et OLA et sur l'utilisation des propriétés de l'algèbre linéaire, en particulier celles des matrices circulantes. Pour réduire davantage la complexité et la distorsion de filtrage, nous avons approfondi les bases mathématiques de la transformée en nombres de Fermat (FNT : Fermat Number Transform) qui est amenée à trouver des applications de plus en plus diverses en traitement du signal. Cette transformée, définie sur un corps de Galois d'ordre égal à un nombre de Fermat, est un cas particulier des transformées en nombres entiers (NTT : Number Theoretic Transform). Comparé à la TFR, la FNT permet un calcul sans erreur d'arrondi ainsi qu'une large réduction du nombre de multiplications nécessaires à la réalisation du produit de convolution. Pour mettre en évidence cette transformée, nous avons proposé et étudié une nouvelle conception des filtres blocs OLS et OLA mettant en oeuvre la FNT. Nous avons ensuite développé un algorithme de très faible complexité pour la synthèse du filtre optimal en utilisant les propriétés des matrices circulantes que nous avons développées dans le corps de Galois. Les résultats de l'implantation en virgule fixe du filtrage par blocs ont montré que l'utilisation de la FNT à la place de la TFR permettra de réduire la complexité et les erreurs de filtrage ainsi que le coût de synthèse du filtre optimal.

Foram desenvolvidos estudos de modelagem e simulação numérica de escoamentos bifásicos gás-sólido na coluna ascendente de leitos fluidizados circulantes utilizando um modelo Euleriano de duas fases separadas. O sistema de equações diferenciais parciais conservativas governantes foi obtido através de um procedimento tradicional. Ambas as fases foram assumidas como meio contínuo. Aplicou-se o procedimento de médias estatísticas de Euler, enfatizando a obtenção dos modelos hidrodinâmicos A e B desenvolvidos no IIT/ANL. Realizou-se análise comparativa de correlações para transferência de quantidade de movimento na interface. Discutiu-se a formulação de condições de contorno apropriadas. As equações diferenciais parciais médias foram discretizadas em volumes de controle Eulerianos. As equações de continuidade foram resolvidas implicitamente. As equações de quantidade de movimento foram resolvidas através de um procedimento explícito-implícito. Foram desenvolvidas simulações numéricas para uma coluna ascendente típica de leitos fluidizados circulantes. Desenvolveu-se análise paramétrica da influência de vários aspectos físicos e matemáticos sobre o escoamento. Avaliou-se resultados de simulação através de metodologia de identificação e caracterização de estruturas coerentes. Estudou-se o efeito da função de arrasto na interface sobre os processos dinâmicos que caracterizam estas estruturas coerentes. Foram realizados estudos numéricos de turbulência a partir de resultados de simulação direta. Várias conclusões e recomendações para futuros trabalhos foram propostas com base nas análises realizadas. Foram apresentadas algumas considerações gerais relativas a aspectos críticos na modelagem e simulação com modelo das duas fases separadas. / Studies were carried out on modeling and numerical simulation of gas-solid two-phase flows in the riser of circulating fluidized beds using an Eulerian two-fluids model. The system of conservative partial differential governing equations was derived through a traditional procedure. Both phases were assumed as a continuum. The Euler averaging procedure was applied emphasizing the derivation of the so called hydrodynamic models A and B developed at IIT/ANL. A comparative analysis was performed among correlations for momentum transfer at the interface. The formulation of suitable boundary conditions was discussed. The average partial differential conservative equations were discretized on Eulerian control volumes. The continuity equations were solved implicitly. The momentum equations were solved through an explicit-implicit procedure. Numerical simulation was performed for a typical circulating fluidized bed riser. A parametric analysis was carried out regarding the influence on the flow of various physical and mathematical aspects. Results of simulation were evaluated through a methodology of identification and characterization of coherent structures. The effect of the interface drag function on dynamic features of those coherent structures was addressed. Numerical studies on turbulence were performed from results of direct simulation. Several conclusions and recommendations for future work were put forward on the basis of the performed analyses. Some general considerations were presented regarding critical features of modeling and simulation through Eulerian two-fluids models.

La diffusion dans le sang des cellules tumorales circulantes (CTC) à partir de la tumeur primitive est un signe précoce d’invasivité tumorale et du risque de développer des métastases. Par conséquent, la capacité à les détecter de façon très sensible et spécifique est censée constituer un test cliniquement important pour le pronostic du cancer, le suivi des patients et la personnalisation de la thérapie. Les CTC sont des cellules rares, et plusieurs méthodes ont été proposées pour leur détection. La technique ISET (Isolation by Size of Epithelial/Tumor cells) se base sur la différence de taille des CTC par rapport aux cellules leucocytaires et a montré une très grande sensibilité d’isolement et spécificité d’identification des CTC. Elle permet l’analyse cytopathologique, immunologique et moléculaire des cellules isolées.Le cancer du rein représente 3% des cancers de l’adulte, dans 75% des cas il s’agit d’un carcinome rénal à cellules claires (RCC). Sur le plan génétique, il est un des rarissimes cancers solides caractérisé par des variations de l’ADN, il s’agit de mutations au niveau du gène VHL.Ce projet de recherche vise l’analyse comparative, moléculaire et cytopathologique, des CTC isolées à partir des patients avec RCC dans le but d’évaluer, par une approche moléculaire, les critères cytopathologiques diagnostiques des CTC. Notre étude a porté sur 29 patients ayant bénéficié de l’isolement des CTC par ISET avant toute intervention chirurgicale.L’analyse cytopathologique a été réalisée utilisant les critères décrits par l’équipe de P. Hofman pour définir les CTC (CNHC-MF) et les Cellules Atypiques Circulantes « CAC » (CNHC-UMF). L’analyse génétique par séquençage du gène VHL a été réalisée avec succès sur l’ADN de 205 cellules individuelles, sur l’ADN issu du tissu tumoral et sur l’ADN génomique de chaque patient.Sur les 29 tumeurs étudiées, 25 étaient caractérisées par des mutations du gène VHL. Cent soixante et une cellules, CTC et CAC, isolées à partir du sang de ces 25 patients, ont présenté des variations génétiques du gène VHL identiques à l’ADN issu du tissu tumoral. Il s’agit de 18 mutations différentes affectant les 3 exons de ce gène. Nous avons trouvé des CTC/CAC dans 29/30 des patients avec CCRC analysés. Des mutations VHL ont été trouvées dans 25 des 29 tumeurs CCRC correspondantes. Nous avons obtenu des résultats spécifiques VHL dans 205 des 327 CTC/CAC microdisséquées, comprenant 64 CTC et 141 CAC, selon l’analyse cytopathologique. Les mutations VHL ont été détectées en aveugle dans 57/64 CTC et dans 125/141 CAC. Cependant, nous avons observé que les 8 et 16 CTC et CAC restantes, respectivement, avaient été isolées de patients sans mutations VHL détectables dans le tissu tumoral.Conclusion : Ceci est la première étude comparative de diagnostic génétique et cytopathologique des CTC/CAC chez des patients avec un cancer solide, le CRCC. Nos résultats suggèrent que des critères cytopathologiques élargis pourraient être appliqués au diagnostic des CTC chez les patients avec CCRC. Bien que des études complémentaires et plus élargies soient maintenant nécessaires, cette méthode ouvre la voie à une approche génétique pour le diagnostic des Cellules Tumorales Circulantes / Dissemination in the circulating tumor cells (CTC) from the primary tumor is an early sign of tumor invasion and risk of metastases. Therefore, the ability to detect CTC through a very sensitive and specific test is expected to be clinically important for cancer prognosis, patient monitoring and customization of therapy. CTCs are rare cells, and several methods have been proposed for their detection. The ISET technique (Isolation by Size of Epithelial /Tumor cells) is based on the difference in size of CTC as compared to leucocytes and provides high sensitivity of CTC isolation and high specificity of CTC identification. This methods also allows cytopathological, immunological and molecular analyses of the isolated cellsKidney cancer accounts for 3% of adult cancers and is a clear cell renal cell carcinoma (RCC) in 75% of cases. RCC is one of very rare cancers characterized by a DNA mutations. IRCC tumor cells are in fact characterized by by mutations in the VHL gene. This research project aims at a comparative molecular and cytopathological analysis of, CTCs isolated from patients with RCC in order to evaluate, through a molecular approach, the diagnostic criteria used for cytopathological identification of CTC. Our study included 29 patients tested by the ISET technique before surgery.The cytopathological analysis was performed using the criteria described by the group of P. Hofman to define CTC (CNHC-MF) and Circulating Atypical Cells "CAC" (UMF-CNHC). Genetic analysis of the VHL gene was successfully performed by sequencing on DNA from 205 individual cells isolated by ISET, on DNA from tumor tissue and on genomic DNA from each patient. Of the 29 tumors studied, 25 were characterized by mutations in the VHL gene. One hundred and sixty-one cells, CTC and CAC, isolated from the blood of the 25 patients, with the tumor having VHL mutation, showed genetic variations in the VHL gene identical to those found in the DNA from the tumor tissue. We found 18 different mutations affecting the three exons of this gene.We found CTC/CAC in 29/30 analyzed patients with CCRC. VHL mutations were found in the tumor of 25 out of the corresponding 29 CCRC tumors. Among 327 microdissected CTC/CAC, we obtained VHL-specific results in 205 including 64 CTC and 141 CAC, according to the cytopathological analysis. VHL mutations were blindly detected in 57/64 CTC and in 125/141 CAC. However, we then observed that the 8 and 16 residual CTC and CAC, respectively, had been isolated from patients without detectable VHL mutations in the tumor tissue. Conclusion: This is the first study comparing genetic and cytopathological diagnosis of CTC/CAC in patients with a solid cancer, CRCC. Our results suggest that broaden cytopathological criteria could be applied to the diagnosis of CTC in patients with CCRC. Although further and larger studies are now needed, this approach opens the way to a genetic approach for the accurate diagnosis of Circulating Tumor Cells.

No presente trabalho desenvolve-se um estudo de modelagem matemática e simulação numérica do escoamento bifásico gás-sólido na coluna ascendente de um leito fluidizado circulante. Utiliza-se o modelo euleriano de duas fases separadas considerando dois procedimentos diferentes para a modelagem do tensor das tensões da fase sólida: modelo tradicional e a teoria cinética dos escoamentos granulares (TCEG). As simulações numéricas são conduzidas com a utilização do código MFIX que é um software livre e disponível na rede (Internet). Os resultados da simulação numérica são avaliados por meio da análise da influência dos seguintes parâmetros: malha computacional, correlações para o computo do tensor das tensões da fase sólida e esquemas de discretização dos termos advectivos. Também se desenvolve estudo de caracterização de estruturas coerentes - \"clusters\". De forma complementar foram realizadas duas análises teóricas compreendendo: uma análise da influência das diversas correlações utilizadas na TCEG para o computo da viscosidade dinâmica do sólido; e uma análise enfocando o emprego de diversos esquemas de discretização para os termos advectivos presentes nas equações de conservação (Foup, Muscl, Van Leer, Minmod e Superbee). De todos os estudos e resultados apresentados no trabalho conclui-se que os escoamentos gás-sólido em leitos fluidizados circulantes são muito complexos, sendo necessário a realização de futuras pesquisas para uma melhor compreensão dos fenômenos físicos inerentes a esses escoamentos. / In the present work is described a mathematical model and numerical study simulation of the gas-solid flow in the riser of a circulating fluidized bed. It is used the two fluids eulerian model considering two different procedures for the solid phase stress tensor modeling: the traditional model and the kinetic theory of granular flows (KTGF). The numerical simulation results are evaluated through the influence analysis of the following parameters: computational mesh, correlations for computing the solid phase stress tensor and the discretization of the advective terms. It is also presented a study concerning the characterization coherent structures - \"clusters\". Complementing the above studies were accomplished two theoretical analyses comprehending: an influence analysis of several correlations used in the KTGF for computing the dynamic viscosity of the solid phase; and an analysis concerning several discretization schemes for the advective terms present in the conservative equations. Considering the developed studies and the obtained results it is concluded that the gas-solid flows in circulating fluidized beds are very complex, being necessary future research works for a better comprehension of the inherent physical phenomena to these flows.

No presente trabalho desenvolve-se um estudo de modelagem matemática e simulação numérica do escoamento bifásico gás-sólido na coluna ascendente de um leito fluidizado circulante. Utiliza-se o modelo euleriano de duas fases separadas considerando dois procedimentos diferentes para a modelagem do tensor das tensões da fase sólida: modelo tradicional e a teoria cinética dos escoamentos granulares (TCEG). As simulações numéricas são conduzidas com a utilização do código MFIX que é um software livre e disponível na rede (Internet). Os resultados da simulação numérica são avaliados por meio da análise da influência dos seguintes parâmetros: malha computacional, correlações para o computo do tensor das tensões da fase sólida e esquemas de discretização dos termos advectivos. Também se desenvolve estudo de caracterização de estruturas coerentes - \"clusters\". De forma complementar foram realizadas duas análises teóricas compreendendo: uma análise da influência das diversas correlações utilizadas na TCEG para o computo da viscosidade dinâmica do sólido; e uma análise enfocando o emprego de diversos esquemas de discretização para os termos advectivos presentes nas equações de conservação (Foup, Muscl, Van Leer, Minmod e Superbee). De todos os estudos e resultados apresentados no trabalho conclui-se que os escoamentos gás-sólido em leitos fluidizados circulantes são muito complexos, sendo necessário a realização de futuras pesquisas para uma melhor compreensão dos fenômenos físicos inerentes a esses escoamentos. / In the present work is described a mathematical model and numerical study simulation of the gas-solid flow in the riser of a circulating fluidized bed. It is used the two fluids eulerian model considering two different procedures for the solid phase stress tensor modeling: the traditional model and the kinetic theory of granular flows (KTGF). The numerical simulation results are evaluated through the influence analysis of the following parameters: computational mesh, correlations for computing the solid phase stress tensor and the discretization of the advective terms. It is also presented a study concerning the characterization coherent structures - \"clusters\". Complementing the above studies were accomplished two theoretical analyses comprehending: an influence analysis of several correlations used in the KTGF for computing the dynamic viscosity of the solid phase; and an analysis concerning several discretization schemes for the advective terms present in the conservative equations. Considering the developed studies and the obtained results it is concluded that the gas-solid flows in circulating fluidized beds are very complex, being necessary future research works for a better comprehension of the inherent physical phenomena to these flows.

Dans la dysfonction endothéliale, le compartiment endothélial circulant joue simultanément le rôle d’acteur impliqué dans la régénération du tissu lésé et celui d’indicateur de l’état d’altération ou de régénération de l’endothélium. Dans l’artérite oblitérante des membres inférieurs (AOMI), l’un des axes de recherche porte sur le développement d’un produit de thérapie cellulaire capable d’induire la formation de néo-Vaisseaux. Face à la difficulté d’obtenir et d`amplifier des cellules progénitrices endothéliales (CPE) chez l’adulte sain, et a fortiori chez le patient, l’une des hypothèses laisse envisager le recours à d’autres types cellulaires ayant des propriétés vasculogéniques. Chez patients atteints de maladies cardiovasculaires, et d’AOMI en particulier, les cellules mononuclées de moelle osseuse et les CPE montrent des propriétés angiogéniques diminuées. Nous avons mis en évidence la capacité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées de patients atteints d’AOMI à induire une reperfusion, par recrutement de cellules endothéliales in situ, avec la même efficacité que celles de donneurs sains. Les CSM ne se différencient pas en cellules endothéliales mais agissent par paracrinie. La seconde hypothèse d’obtention d’un produit de thérapie cellulaire autologue angiogène est de trier des cellules plus immatures que les CPE afin de les différencier secondairement vers la lignée endothéliale à l’image du modèle pathologique de la cellule souche d’hémangiome CD133+ qui laisse envisager les Very Small Embryonic Like stem cells (VSEL), cellules souches multipotentes CD133+, comme un candidat de cellules post-Natales à potentiel vasculaire. Nous avons dérivés, en culture en conditions angiogéniques, des VSEL qui acquièrent un phénotype mésenchymateux mais présentent un profil sécrétoire proche de celui des CPE. Les VSEL favorisent la revascularisation post-Ischémique et acquièrent un phénotype endothélial in vitro et in vivo suggérant que les VSEL peuvent être à l’origine de la lignée endothéliale. Les VSEL se présentent également comme un biomarqueur de la dysfonction endothéliale mobilisé de la moelle osseuse (MO) vers le sang périphérique (PB) chez les patients souffrant d’AOMI. Les biomarqueurs cellulaires circulants représentent non seulement des marqueurs non invasifs de l’endothélium mais peuvent également apporter des informations utiles pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique des patients souffrant de pathologies associées à une dysfonction endothéliale. Une modification du nombre de CPE et de cellules endothéliales circulantes (CEC) dans la circulation a été rapportée dans différentes situations pathologiques respectivement associées à une régénération et une altération endothéliale telle l’augmentation du taux de CEC chez des patients présentant une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). La technique de référence pour le dénombrement des CEC dans le sang périphérique est l’immunoséparation magnétique (IMS). Cette méthode non automatisée et chronophage, repose sur l’énumération par microscopie à fluorescence des cellules CD146+ préalablement isolées. Bien que reproductible, cette numération est soumise à de nombreux biais de quantification, difficile à mettre en oeuvre et sujette à interprétation. La mise au point d’une méthode de détection automatisée des CEC par cytométrie à focalisation acoustique (AFC) s’est montrée fiable et robuste, dans une cohorte de patients atteints d’HTAP traitée ou non, constituant une alternative pertinente à l’analyse par microscopie. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives dans la détection des biomarqueurs cellulaires circulants impliqués dans la dysfonction endothéliale, proposant les VSEL comme nouvel acteur vasculogénique. / In endothelial dysfunction, circulating endothelial compartment simultaneously plays the role of actor involved in the regeneration of injured tissue and reflects endothelium state. In peripheral arterial disease (PAD), one of the research areas is the development of a cellular therapy product capable of inducing the formation of neo-Vessels. Faced with the difficulty to obtain and amplify endothelial progenitor cells (EPC) in adults, one of the assumptions lets consider the use of other cell types with vasculogenic properties. In patients with cardiovascular disease, and PAD in particular, bone marrow mononuclear cells and EPC show reduced angiogenic properties. We have demonstrated the ability of isolated mesenchymal stem cells (MSCs) from PAD patients to induce reperfusion by recruitment of endothelial cells in situ, with the same efficiency as that of healthy donors MSCs. MSCs do not differentiate into endothelial cells but act by paracrine. The second hypothesis of obtaining an autologous angiogenic cell therapy product is to sort cells more immature than the CPE and to differentiate them secondarily into endothelial lineage as the pathological cell model of hemangioma stem cells CD133 + which lets consider the Very Small Embryonic like stem cells (VSEL), CD133 + multipotent stem cells as a potential candidate of postnatal vascular cell. We have derived and cultured in angiogenic conditions VSEL that acquired a mesenchymal phenotype but exhibited a secretory profile similar to that of EPC. VSEL promote post-Ischemic revascularization and acquire an endothelial phenotype in vitro and in vivo suggesting that VSEL may be responsible for the endothelial lineage. VSEL also appear as a biomarker of endothelial dysfunction mobilized from bone marrow (BM) to peripheral blood (PB) in patients with PAD. Cellular circulating biomarkers are not only non-Invasive markers of endothelium but can also provide useful information for the diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring of patients with endothelial dysfunction associated pathologies. Changing the number of EPC and circulating endothelial cells (CEC) in the circulation has been reported in different pathological situations respectively associated with endothelial regeneration and alteration such as the increase of CEC in patients with pulmonary arterial hypertension (PAH). The reference technique for the enumeration of CEC in peripheral blood is magnetic immunoseparation (IMS). This non-Automated and time-Consuming method, based on the enumeration by fluorescence microscopy of CD146 + cells isolated. Although reproducible, this count is subject to many through quantification, difficult to implement and subject to interpretation. The development of an acoustic focusing cytometry (AFC) method for automated detection of CEC has proved reliable and robust results, in a cohort of patients with PAH treated or not, constituting a relevant alternative analysis to microscopy. All of this work opens new perspectives in the detection of cellular circulating biomarkers involved in endothelial dysfunction, suggesting VSEL as new vasculogenic actor.