L’endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s’est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l’activation de l’endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l’adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d’étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d’abord, nous avons exploré l’utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d’une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d’un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d’optimiser les techniques d’étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l’origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l’effet de diverses matrices et de la densité d’ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l’obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l’HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l’absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l’HTAP et non dans l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L’autre étude a montré l’intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d’HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L’hypothèse récente d’une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l’effet d’un processus d’ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n’a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l’inverse, l’hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC. / The endothelium plays a key role in the development and the homeostasis of vascular functions. It is also well involved in pathological situations like cardiovascular diseases. Thanks to the description of circulating endothelial markers, non invasive study of the endothelium is now possible. Our group was particularly interested in circulating endothelial cells (CECs), the level of which reflects an endothelial activation or lesion, and to circulating endothelial progenitors cells (EPCs), markers of endothelial repair. EPC description by Asahara in 1997 in adult blood, involved in new blood vessel formation by vasculogenesis, offered new perspectives, specially for cell therapy in ischemic diseases. This work consisted in the development of methods to study these markers in different contexts. First, we explored the interest of these markers in the physiopathology of pulmonary arterial hypertension (PAH). Then we evaluated endothelial progenitors mobilization from the vascular wall by a local ischemia process in healthy volunteers, in the perspective of an autologous cell therapy product development. One part of this project was the implementation and optimization of the methods to study CEC and EPC. CEC were quantified by magnetic immunoseparation. This technique was developped in 1992 by F. Dignat-George's group and transferred in our laboratory. EPC were quantified by flow cytometry and cell culture. Two types of EPC are described in culture: the early EPC, which originate from monocyte lineage and which culture is standardized, and the « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), the only cells presenting endothelial progenitor cell properties and which use as a cell therapy product can be considered. ECFC quantification by culture was optimized by assessment of the impact of diverse matrices and seeding concentrations of mononuclear cells isolated from whole blood, on ECFC commitment and their angiogenic properties. Endothelial dysfunction was described as a central element in the development of PAH, which diagnosis is based on the use of right heart catheterization. Due to the lack of noninvasive marker for this disease, CEC and circulating progenitors were quantified in two studies. One of them realized in adult patients showed a specific increase of CEC in PAH and not in post-embolic PH. CEC would then reflect the presence of specific endothelial lesions and not the clinical state of the patients. The other study demonstrated the interest of CEC quantification in the therapeutic care of children with PAH secondary to congenital heart disease, for whom patients in irreversible state had a higher level of CEC. We then defined a new noninvasive biomarker.that can be used for the diagnosis and prognosis of PAH. EPC are rare events in whole blood, difficult to expand and for which, mobilization protocols revealed insufficient. The recent hypothesis of a vascular reservoir for endothelial progenitor led us to study the effect of a local ischemia procedure on the mobilization of these cells in healthy volunteers. Two age groups were included to assess the impact of aging on this procedure. Despite a significant endothelial dilation with the local ischemia, no EPC were mobilized, whatever the age group. Ischemia even altered ECFC angiogenic properties.

[pt] A técnica de análise de sinais corrompidos por ruído baseada no comportamento de subespaços vetoriais foi tema de alguns trabalhos publicados desde o início da década de 80. Esta nova técnica passou a ter grande importância no processamento de sinais digitais devido a fatores como robustez e precisão.Porém, o maior problema associado a este novo método é o seu elevado custo computacional. Esta característica limitou o emprego da técnica em sistemas - offline - . A preocupação então passou a ser rastrear a variação do comportamento dos subespaços vetoriais de modo eficiente. O objetivo deste rastreamento seria o emprego da técnica em alguns sistemas que operam em tempo real. Este trabalho de tese propõe um novo algoritmo de rastreamento de subespaços vetoriais. O objetivo é apresentar um algoritmo que demonstre um bom desempenho, com relação aos demais já existentes, permitindo eventual aplicação em sistemas que atuem em tempo real. Como contribuição adicional, são apresentadas uma nova análise e caracterização de sistemas que se assemelham aos circulantes, sendo para isto reinterpretada a decomposição de matrizes circulantes. O conjunto de contribuições é aplicado a um novo sistema automático de classificação de sinais comunicação, quanto ao tipo de modulação. / [en] The signal subspace analysis technique, usually applied to signals corrupted by noise, is theme of some papers since the beginning of the 80s decade. This new technique has presented important features, as robustness and precision, and became widely employed in digital signal processing. However, the main problem associated to this new method is the high computational cost. This characteristic has restricted the use of signal subspace analysis to some off-line systems. A possible way to overcome this burden was to track the signal and noise subspace behavior in the time-domain. The main objective of these methods is to allow the signal subspace analysis technique application to real time systems, sometimes at the expense of limiting analysis precision or scope. This work proposes a new subspace tracking procedure. The goal is to describe a new algorithm with good performance (precision-speed), allowing some real time systems applications. A new analysis and characterization of almost circulant systems is introduced by reinterpreting the circulating matrix decomposition scheme. The set of contributions is applied to a new analogue modulation communication signals automatic recognition structure.

La présence de métastases est un facteur de mauvais pronostic dans les cancers solides et une meilleure compréhension de la dissémination tumorale est nécessaire afin d'améliorer la prise en charge de ces formes avancées. Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un intérêt majeur dans la pathologie tumorale, d'une part sur le plan clinique en tant que marqueur prédictif et pronostique et d'autre part sur le plan de la compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des métastases. Les CTC sont rares et hétérogènes et restent mal caractérisées, et ce, particulièrement dans le cancer colorectal. Une partie de ces cellules aurait un phénotype de cellules initiatrices de tumeur (CIT) leur permettant de former des métastases, de résister aux traitements et par conséquent d'être responsables des rechutes. Une meilleure connaissance des CTC possédant un phénotype de CIT représente donc un enjeu majeur. L'objectif de ce travail a été d'identifier et de caractériser les CTC avec un potentiel de cellules initiatrices de tumeur dans le cancer colorectal en se basant sur les propriétés fonctionnelles des CIT. Nous avons ainsi, pour la première fois, pu établir deux modèles permettant de répondre à cet objectif. D'une part des lignées de CTC avec un fort potentiel de CIT obtenues à partir d'échantillons sanguins de patients atteints de cancer colorectal, et d'autre part, nous avons mis en place un modèle murin de dissémination tumorale par xénogreffe orthotopique permettant d'isoler les CTC. / Liver or lung metastases represent a poor prognosis in colorectal cancer patients and better understanding tumor spreading became essential to improve patient care. Circulating tumor cells (CTC) is considered as a promising tool, both as prognostic marker and as tool to study mechanisms involved in metastasis development. CTCs are rare and heterogeneous and remain poorly characterized especially in colorectal cancer. It is accepted that at least some of the CTC have a tumor initiating cell (TIC) phenotype that could be responsible for metastasis, chemoresistance and consequently lead to relapse. A deep characterization of CTC became thus an urgent unmet need. The aim of this work was to identify and characterize CTC with TIC properties in colorectal cancer, on the basis of their functional properties. To reach this aim, we established for the first time and characterized CTC lines from blood sample of colorectal cancer patient, and we also developed an orthotopic xenograft mouse model in which tumoral cells are circulating in the blood.

De nouveaux composants du système rénine angiotensine (SRA) continuent d'être découverts et leurs fonctions étudiées. Cette thèse présente de nouvelles relations entre enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), thrombose et maladies cardiovasculaires (MCV), d’une part, et d’autre part, un rôle pour le récepteur de la (pro)rénine dans le développement du système nerveux central (SNC). Tout d’abord, nous avons étudié l'association de la double mutation de l’ECA et l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1 (PAI-1) sur l’incidence d’évènements cardiovasculaires chez les patients Libanais hypertendus et hypercholestérolémiques, par rapport à d'autres gènes cardiovasculaires polymorphes des cytokines pro-inflammatoires dans les cellules mononuclées circulantes. Les résultats ont montré que les patients exprimant une double mutation ECA/PAI-1, respectivement Del/4G, sont à haut risque d’apparition des MCV. Dans une deuxième partie, nous avons étudié la relation entre récepteur de la (pro)rénine dont le gène est appelé Atp6ap2, et la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine dans les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN). À cette fin, nous avons isolé des CSN à partir d’embryons de souris Atp6ap2-/Y, et étudié leur auto-renouvellement et leur différenciation en neurones, astrocytes et oligodendrocytes in vitro. Nos résultats suggèrent que Atp6ap2 est nécessaire à l’auto-renouvellement des CSN indépendamment de la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine chez les mammifères. Enfin, nous avons montré qu’il existait une corrélation entre l’expression ATP6AP2 et le degré de différenciation neuronale des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) isolées à partir du tissu adipeux. / New components of the renin angiotensin system (RAS) continue to be discovered and their functions studied. This thesis provides new insights on the role of angiotensin converting enzyme (ACE) in thrombosis and cardiovascular diseases (CVD) and of the (pro)renin receptor in the development of the central nervous system (CNS). First, we studied the role of ACE in CVD by analyzing the impact and the association of a mutation in ACE and in plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) genes compared to other polymorphic cardiovascular genes of proinflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells in hypertensive hypercholesterolemic Lebanese patients. We showed that Lebanese patients expressing a double mutation (Del/4G) of ACE and PAI-1, respectively, are at high risk of developing CVD, suggesting that combined ACE/PAI-1 mutations may be considered as a potential marker of CVD onset. In the second part, we studied the relation between the (pro)renin receptor, whose gene is called Atp6ap2, and Wnt/beta-catenin signaling pathway, in neural stem/progenitor cells (NSPC) during development. To this end, we used an in vitro model of neural stem cells (NSC) isolated from Atp6ap2-/Y mice embryos and studied their self-renewal capacity and their differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Our results suggest that Atp6ap2 is necessary for self-renewal of NSC independently of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in mammals. In addition, we showed that the expression of ATP6AP2 in human mesenchymal stem cells (hMSC) isolated from adipose tissue was correlated with their degree of neuronal differentiation.

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. D'après la société américaine contre le cancer; en 2015, un quart des décès aux Etats-Unis est du au cancer du poumon avant même les maladies cardiaques. Cette situation nous incite et bien d'autres scientifiques dans le monde à développer des moyens plus efficaces de traitement, le diagnostic et le dépistage de la maladie. Parce que près de 90% des décès par cancer sont dus à des métastases, de nombreuses études se sont concentrées sur le mécanisme de métastases et sur son impact clinique. Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules s’échappent de tumeurs primaires ou métastatiques pour rejoindre le flux sanguin périphérique, ces cellules sont un élément de transition dans le processus métastatique et portent ainsi des informations cruciales sur ce mécanisme encore mal compris. Les CTCs ont déjà montré leur potentiel comme biomarqueur de pronostic de la progression de la maladie et de l'indicateur de l'efficacité du traitement en fonction l’augmentation ou de la diminution de leur nombre. Leur caractérisation moléculaire peut également donner des informations vis à vis de cibles thérapeutiques possibles et des mécanismes de progression de la maladie ou de la résistance aux médicaments. Leur comptage au cours du traitement combiné avec leur caractérisation moléculaire devrait améliorer la prise en charge des patients dans le cadre de la médecine personnalisée. Cependant CTCs sont extrêmement rares, 1 à 10 cellules / ml de sang parmi les 106 globules blancs et 109 globules rouges, leur capture à partir du sang reste donc un challenge analytique. Dans les dernières décennies, Une grande variété de techniques d'enrichissement et de capture a été mise au point et l'approche microfluidique est l'une des méthodes efficaces, flexibles et à haut débit. Au sein de notre équipe, un dispositif microfluidique (système Ephesia) puissant pour la capture et l'analyse des cellules tumorales circulantes a déjà été mis au point précédemment. Le principe de capture est basé sur l'auto-assemblage de billes magnétiques greffées par des anticorps, grâce aux quelles les cellules sont enrichies via l’interaction Ab- l'antigène de surface EpCAM que l'on trouve communément dans les cellules cancéreuses d'origine épithéliale. Ce système a déjà été validé avec des lignées cellulaires et des échantillons de patients. Cependant, le système n'a pas permis l'isolement / détection des sous-populations de CTCs ou d'effectuer une caractérisation moléculaire très poussée. Par conséquent, mon projet de thèse vise à améliorer encore les capacités du système sur les deux principaux aspects: le ciblage sous-populations de CTC et à l'étude des interactions des protéines à la surface des CTCs dans le Système Ephesia... / Metastasis is the advanced stage of cancer progression and is the cause of 90% of deaths in cancer disease. During metastatic cascade, it is suggested that the successful metastatic initiation depends on the survival of circulating tumor cells (CTCs). CTCs are the cells that shed from the primary or secondary tumor sites into the blood circulation. it is now widely recognized as potential biomarker for companion diagnostics in which high number of CTCs in blood can indicate association with poor survival or high risk of disease progression. Besides, following the number of CTCs during the course of treatment can help to adapt the selected therapy and predict the treatment efficacy. On the other hand molecular characterization can provide patient stratification and identifying the therapeutic targets. However they are extremely rare in the bloodstream, estimated between 1-10 CTC among 6×106 leukocytes, 2×108 platelets and 4×109 erythrocytes per one mL of blood which makes their isolation very challenging. A very attractive way of isolation of CTCs is to integrate microfluidics. Microfluidics offers great advantages such as low volume of reagent consumption and short analysis times with automation as well as isolation and detection analysis can be integrated resulting in highly efficient biomedical devices for diagnostics. As parallel to state of the art, a powerful microfluidic device for circulating tumor cells capture and analysis had already been developed previously in our laboratory. The principle of capture is based on self-assembly of antibody-coated (EpCAM) magnetic beads in which the cells are enriched by EpCAM surface antigen which is found commonly in epithelial origin cancer cells. This system was already validated with cell lines and patients samples. However, the system did not allow isolation/detection of subpopulations of CTCs or performing high content molecular characterization. Therefore, my PhD project aimed at further improving the capabilities of the system on the main two aspects: targeting subpopulations of CTC and studying of protein interactions of CTCs in Ephesia System...

En dépit de progrès considérables, le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Actuellement, 90% des décès liés au cancer sont causés par la propagation de cellules cancéreuses vers des organes distants. Une fois implantées et disséminées, les métastases sont beaucoup plus difficiles à détruire par les moyens de la chimiothérapie.A la suite d’un processus d’intravasation, certaines cellules tumorales s’échappent de la tumeur primaire et empruntent les systèmes circulatoires avant d’être ensuite extravasées, puis distribuées et finalement disséminées dans divers organes. Ainsi, dans l’environnement circulatoire, ces cellules tumorales circulantes (CTCs) se trouvent particulièrement accessibles aux agents thérapeutiques. Dans ce cadre, nous avons imaginé d’utiliser des nanoparticules à architecture contrôlée, afin d’intercepter de manière sélective ces cellules dans l’environnement sanguin.Dans cet objectif, nous avons synthétisé par ouverture de cycle de la lactone correspondante des copolymères amphiphiles di- et tri-blocs du poly(glutamate de benzyle). Leur auto-assemblage a permis d'obtenir des nanoparticules amphiphiles de taille inférieure à 100 nm et de potentiel ζ négatif, dont la géométrie contrôlable va de la forme sphérique (rapport d'aspect 1.3) à la forme ellipsoïdale (oblats) (rapport d'aspect 2,6) et qui présentant en surface des chaînes de PEG sous des conformations et des densités de surface contrôlées.En raison de leur capacité de circuler dans le compartiment sanguin, ces nanoparticules ont une probabilité d’interaction optimale avec les CTCs.L’impact de la modification de leur architecture a été établi en étudiant les capacités d’interactions des différentes nanoparticules préparées, d’une part avec les protéines plasmatiques et d’autre part, avec les différents types cellulaires rencontrés dans le compartiment sanguin.Les résultats les plus marquants montrent que l’élongation des nanoparticules (oblats) et l’anisotropie de leur surface, caractérisée par leur balance hydrophile/lipophile, gouvernent profondément leurs interactions. De manière fort intéressante, il apparaît que l’élongation des particules dont la surface est uniformément hydrophile diminue l’intensité de leur capture par les différents types cellulaires modèles étudiés (HUVECs modèle de cellules endothéliales), cellules RAW 276.7 (modèle de macrophages) et cellules PC3 (cancer de la prostate) et B16 (mélanome). En revanche, lorsque ces nanoparticules présentent une anisotropie de surface, leur capture par ces différents types cellulaires est augmentée avec l’élongation des particules (facteur d’élongation de 2,1).Dans un dernier volet expérimental, ces nanoparticules ont été modifiées par greffage de la protéine MART1 à leur surface. Ces immuno-nanoparticules ont montré une certaine capacité de reconnaissance des cellules B16 (modèle du mélanome). Leur efficacité après injection intraveineuse devra toutefois être précisée in vivo. / Despite the considerable progress, cancer remains one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. Currently, 90% of cancer deaths are caused by the spread of cancer cells to distant organs. Once implanted and disseminated, metastases are much more difficult to destroy by means of chemotherapy.Following a process of intravasation, some tumor cells escape from the primary tumor and migrate through the circulatory systems before being extravasated, then distributed and finally disseminated in various organs. Thus, in the circulatory environment, these circulating tumor cells (CTCs) are particularly accessible to therapeutic agents. In this context, we have imagined the use of nanoparticles with controlled architecture, in order to selectively intercept these cells in the blood environment.For this purpose, we have synthesized by ring opening of the corresponding lactone, amphiphilic di- and tri-block copolymers of poly (benzyl glutamate). Their self-assembly made it possible to obtain amphiphilic nanoparticles smaller than 100 nm in size and with a negative ζ potential, whose controllable geometry ranges from spherical (aspect ratio 1.3) to ellipsoidal (oblates) (aspect ratio 2, 6) and having PEG chains on the surface under controlled surface conformations and densities.Due to their ability to circulate in the blood compartment, these nanoparticles have an optimal probability of interaction with CTCs.The modification impact of their architecture has been established by studying the interaction capacities of the different nanoparticles prepared. On the one hand with the plasma proteins and on the other hand, with the different cell types encountered in the blood compartment.The most striking results show that the elongation of the nanoparticles (oblates) and the anisotropy of their surface, characterized by their hydrophilic / lipophilic balance, strongly govern their interactions. Interestingly, it appears that the elongation of particles whose surface is uniformly hydrophilic decreases the intensity of their capture by the different types of cell models studied (HUVEC model endothelial cells), RAW 276.7 cells (macrophage model) and cells PC3 (prostate cancer) and B16 (melanoma). Although, when these nanoparticles exhibit surface anisotropy, their capture by these different cell types is increased with the elongation of the particles (elongation factor of 2.1).In a final experimental part, these nanoparticles were modified by grafting the MART1 protein on their surface. These immuno-nanoparticles showed a certain recognition capacity of B16 cells (melanoma model). However, their efficacy after intravenous injection should be specified in vivo.

Malgré l’efficacité thérapeutique avérée des agents anti-angiogéniques et des agents anti-vasculaires (VDA), le mécanisme d’action précis des stratégies ciblant les vaisseaux sanguins tumoraux, les raisons de leur efficacité ainsi que les mécanismes de résistance à ces drogues sont encore mal compris. Il est rapidement apparu essentiel d’identifier des biomarqueurs capables de refléter l’angiogénèse tumorale ou les effets sur la vascularisation tumorale de ces traitements. Compte tenu de leur importance dans des pathologies vasculaires, les cellules endothéliales matures circulantes (CEC) et les progéniteurs endothéliaux circulants (CEP) ont d’emblée été pressenties comme des candidats intéressants pour être des biomarqueurs de réponse aux stratégies ciblant la vascularisation tumorale. Nous avons exploré l’intérêt de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse dans des tumeurs pédiatriques, et leur rôle en tant que biomarqueurs de traitement par des agents anti-angiogéniques chez des sujets adultes atteints de cancer. Ces travaux ont mis en lumière l’intérêt des CEP et ont été à la source d’un travail plus « mécanistique » où nous avons étudié dans différents modèles murins le rôle des CEC et CEP dans le mécanisme d’action des agents anti-vasculaires et plus particulièrement le rôle fonctionnel des CEP dans la résistance à ces molécules. Par des stratégies d’association d’agents anti-angiogéniques aux VDA destinées à inhiber les CEP, nous montrons l’augmentation de l’activité anti-tumorale des VDA et offrons un rationnel mécanistique pour optimiser les schémas thérapeutiques actuels des traitements anti-vasculaires. Nos données apportent des arguments en faveur du rôle potentiel de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse, des traitements anti-angiogéniques et de la résistance aux traitements anti-vasculaires. / Despite their therapeutic impact and clinical benefit, the mecanisms of action of anti-angiogenic agents and vascular disrupting agents (VDA), the reasons for their efficacy as well as the mechanisms underlying resistance to these drugs are not fully understood. Thus, identifying surrogate biomarkers of tumor angiogenesis and of the effects of these new therapeutic agents targeting tumor blood vessels has become a crucial objective. Because of their importance in vascular diseases, mature circulating endothelial cells (CEC) and circulating endothelial progenitor cells (CEP) were suggested to be potential candidate biomarkers of disease response and relapse to vascular targeting strategies. We investigated the role of these cells as biomarkers of tumor angiogenesis in pediatric solid tumors, as well as biomarkers of response to anti-angiogenic therapies in adult cancer patients. By revealing the particularly important role of CEP, these initial studies led to a more “mechanistic” study in which the cellular and molecular effects of a VDA were evaluated with regard to CEC and CEP in different mouse models; in particular, the “catalytic” role of CEP was explored as a mechanism of resistance to VDA. By combining anti-angiogenic agents aimed to inhibit CEP mobilized by the VDA, we demonstrate an increase in the anti-tumor activity of the VDA and offer a mechanistic rational to optimize VDA-based therapeutic strategies. Our data support the role of CEC and CEP as biomarkers of angiogenesis, of anti-angiogenic strategies and of resistance to vascular-disrupting therapies.

L'émergence des thérapies ciblées dans le traitement des cancers a rendu indispensable la mise au point de marqueurs plus spécifiques et sensibles pour la surveillance des patients. Dès le stade invasif, des cellules tumorales peuvent passer dans le sang où elles constituent les Cellules Tumorales Circulantes (CTC). Les CTC sont accessibles par une simple prise de sang, évitant les biopsies invasives. De plus, elles représentent le seul matériel tumoral résiduel après traitement. C'est la raison pour laquelle les CTC constituent un axe de recherche très actif avec plus de 400 essais cliniques incluant ces cellules comme biomarqueurs. Ces essais apportent des renseignements importants sur le risque de récidive ou de progression métastatique, et ont pour objectif de pouvoir gérer en temps réel la conduite thérapeutique. Cependant, les CTC potentiellement métastatiques ne représentent qu'une fraction très minoritaire de ces cellules circulantes. Les technologies existantes, essentiellement basées sur une simple numération, ne suffisent pas pour guider efficacement la stratégie thérapeutique. Ce projet a évalué un ensemble de critères pouvant être utile pour la prise de décisions thérapeutiques pertinentes, adaptées à chaque patient, et la mesure de l'efficacité des traitements. Ce projet sera centre sur le mélanome. Les stades d'évolution de ce cancer sont bien définis, et dans les stades avances, le risque de développer des métastases est très élevé et la détection précoce de celles-ci est un enjeu important. Par ailleurs, ce cancer bénéficie de rapides progrès thérapeutiques, les CTC constituent donc un outil intéressant pour tester l'efficacité de ces nouveaux traitements. / The emergence of targeted therapies in cancer treatment has made essential the development of more specific and sensitive markers for monitoring patients. At the invasive stage, tumor cells can pass to blood. These cells are called Circulating Tumor Cells (CTC). CTCs are accessible through a simple blood test, avoiding invasive biopsies. Moreover, they represent the only residual tumor after treatment. It is why CTCs are a very active center of research with more than 400 clinical trials involving these cells as biomarkers. These tests provide important information on the risk of recurrence or metastatic progression and aim to manage in real time the therapeutic conduct. But the CTC potentially metastatic represents only a fraction very minority of these circulating cells. Existing technologies, mainly based on simple enumeration, are not enough to effectively guide therapeutic strategy. This project has evaluated a set of criteria to make appropriate therapeutic decisions, adapted to each patient, and able to measure the effectiveness of treatments. This project will focus on melanoma. Evolution stages of this cancer are well defined, and in advanced stages, the risk of developing metastases is very high and the early detection is an important issue. Moreover, CTC could be is an interesting tool to test the effectiveness of these new treatments.

[ES] La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno hereditario del metabolismo del cobre causado por mutaciones en ATP7B, que codifica una proteína transportadora de cobre en el hígado. Su mal funcionamiento provoca un fallo en la excreción biliar de cobre y una acumulación progresiva de este metal en el organismo, especialmente en hígado y cerebro. En este trabajo, se explora la posible utilidad de miRNAs circulantes en plasma para identificar biomarcadores que sirvan para controlar la progresión de la enfermedad en pacientes con EW bajo tratamiento. Los modelos desarrollados para cada miRNA mostraron un buen rendimiento al clasificar a los pacientes con factores de evolución desfavorable, por lo que estos tres miRNAs se proponen como candidatos para mejorar el seguimiento clínico o para respaldar la eficacia de nuevas terapias en la EW. / [CA] La malaltia de Wilson és un trastorn hereditari del metabolisme del coure causat per mutacions en ATP7B, que codifica per a una proteïna transportadora del coure al fetge. El seu mal funcionament produeix alteracions en l'excreció biliar i l'acumulació progressiva de coure, especialment en fetge i cervell. Es va explorar la possible utilitat del perfil de miRNAs circulants com biomarcadors de progressió de la patologia hepàtica. L'avaluació dels models obtinguts per a cadascun dels tres miRNAs va mostrar un bon rendiment per a classificar al grup de pacients amb factors d’evolució desfavorable, en conseqüència, es proposen com a candidats per tal de millorar el seguiment clínic o comprovar l’efectivitat de noves teràpies en la malaltia de Wilson. / [EN] Wilson disease (WD) is an inherited disorder of copper metabolism caused by mutations in ATP7B, which encodes for a liver copper-transporting protein. Its dysfunction causes a deficit in biliary copper excretion and a progressive accumulation of this metal in the organism, mainly in liver and brain. In this work, circulating miRNAs profiling in plasma has been accomplished to identify biomarkers that could serve to monitor disease progression in WD patients under chelation therapy. Developed models for each miRNA exhibited good performance classifying patients with poor outcome factors, consequently, these three miRNAs are proposed as candidates to improve clinical follow-up or to support efficacy of novel therapies in WD. / Esta Tesis Doctoral ha sido financiada por los siguientes proyectos de investigación: “Avanzar en el diagnóstico y la prognosis de la enfermedad de Wilson” Duración: 2016-2019, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Bases genéticas y biomarcadores pronóstico de la enfermedad de Wilson y Wilson-like” 2020-2022, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Estudios clínicos, bases genéticas y biomarcadores pronóstico en enfermedades raras neurodegenerativas” 2019-2021, Instituto de Salud Carlos III (Expediente: PI18/00147) IP: C. Espinós; “De genes a terapia en enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares” 2018-2021, Generalitat Valenciana, Programa Prometeo para grupos de investigación de excelencia (Expediente: PROMETEO/2018/135) Consorcio de investigadores formado por F. V. Pallardó (coordinador), J.M. Millán, I. Galindo, P. Sanz, T. Sevilla y C. Espinós. / Sánchez Monteagudo, A. (2021). Genética molecular y biomarcadores de la enfermedad de Wilson [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171454

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire. / Background: Circulating tumor cells (CTCs) have been detected in many cancers and are used in multiple clinical applications including disease prognosis, tumor recurrence prediction and prediction of tumor sensitivity to chemotherapeutic drugs. Studies in most major solid cancer(s) (breast, lung, colon and prostate) are progressing rapidly, but there has been very little progress concerning uterine cervical cancer (UCC).Objective: our aim is to optimize enrichment processes and the molecular biomarker-based detection of human circulating tumor cells (CTCs) in uterine cervical cancer (UCC). Material & Methods: To mimic CTCs in patients, we designed an experimental spiking model where the CaSki HPV16-positive UCC cell line was serially diluted and spiked into human blood collected from healthy volunteers. CaSki CTCs were enriched using either Ficoll density centrifugation, red blood cell (RBC) lysis or RBC lysis combined with cell surface markers negative or positive enrichment. CTCs were detected using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to measure the gene expression of human papillomavirus (HPV) viral oncogenes (E6 and E7), cytokeratin 19 (CK19), or the cyclin dependent kinase inhibitor p16INK4A. Finally, ten HPV16- positive UCC patients and six healthy controls were recruited to validate CTCs detection in vivo. Result: In the spiking model, RBC lysis alone or combined with negative or positive enrichment suggests detection limits close to 1 CTC per mL of blood for all molecular biomarkers used. The sensitivity of detection increased when using positive and negative enrichment probably by reducing the peripheral blood mononuclear cell-derived RNA background. Unlike HPV oncogenes, CK19 and p16INK4A were detected in normal individuals, thus appropriate basal expression levels need to be accurately determined compared to cancer patients. Alternatively, Ficoll density gradient had a detection limit of only about 1000 cells per mL of blood. Finally CTCs were detected in 2/10 patients using CK19. None of the patients had E6/E7 transcripts and p16INK4A was expressed at similar level across all samples (cancer and healthy). Conclusion: qRT-PCR of HPV16 E6 and E7 is the most sensitive and specific biomarker used to detect CTCs in the spiking model. In early disease UCC patients, only CK19 revealed the presence of CTCs suggesting that these cells are rare at that stage of the disease. Keywords: uterine cervical cancer, circulating tumor cells, qRT-PCR, E6 and E7 oncoprotein, CK19, p16INK4A, immune-magnetic enrichment, molecular detection.