En dépit de progrès considérables, le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Actuellement, 90% des décès liés au cancer sont causés par la propagation de cellules cancéreuses vers des organes distants. Une fois implantées et disséminées, les métastases sont beaucoup plus difficiles à détruire par les moyens de la chimiothérapie.A la suite d’un processus d’intravasation, certaines cellules tumorales s’échappent de la tumeur primaire et empruntent les systèmes circulatoires avant d’être ensuite extravasées, puis distribuées et finalement disséminées dans divers organes. Ainsi, dans l’environnement circulatoire, ces cellules tumorales circulantes (CTCs) se trouvent particulièrement accessibles aux agents thérapeutiques. Dans ce cadre, nous avons imaginé d’utiliser des nanoparticules à architecture contrôlée, afin d’intercepter de manière sélective ces cellules dans l’environnement sanguin.Dans cet objectif, nous avons synthétisé par ouverture de cycle de la lactone correspondante des copolymères amphiphiles di- et tri-blocs du poly(glutamate de benzyle). Leur auto-assemblage a permis d'obtenir des nanoparticules amphiphiles de taille inférieure à 100 nm et de potentiel ζ négatif, dont la géométrie contrôlable va de la forme sphérique (rapport d'aspect 1.3) à la forme ellipsoïdale (oblats) (rapport d'aspect 2,6) et qui présentant en surface des chaînes de PEG sous des conformations et des densités de surface contrôlées.En raison de leur capacité de circuler dans le compartiment sanguin, ces nanoparticules ont une probabilité d’interaction optimale avec les CTCs.L’impact de la modification de leur architecture a été établi en étudiant les capacités d’interactions des différentes nanoparticules préparées, d’une part avec les protéines plasmatiques et d’autre part, avec les différents types cellulaires rencontrés dans le compartiment sanguin.Les résultats les plus marquants montrent que l’élongation des nanoparticules (oblats) et l’anisotropie de leur surface, caractérisée par leur balance hydrophile/lipophile, gouvernent profondément leurs interactions. De manière fort intéressante, il apparaît que l’élongation des particules dont la surface est uniformément hydrophile diminue l’intensité de leur capture par les différents types cellulaires modèles étudiés (HUVECs modèle de cellules endothéliales), cellules RAW 276.7 (modèle de macrophages) et cellules PC3 (cancer de la prostate) et B16 (mélanome). En revanche, lorsque ces nanoparticules présentent une anisotropie de surface, leur capture par ces différents types cellulaires est augmentée avec l’élongation des particules (facteur d’élongation de 2,1).Dans un dernier volet expérimental, ces nanoparticules ont été modifiées par greffage de la protéine MART1 à leur surface. Ces immuno-nanoparticules ont montré une certaine capacité de reconnaissance des cellules B16 (modèle du mélanome). Leur efficacité après injection intraveineuse devra toutefois être précisée in vivo. / Despite the considerable progress, cancer remains one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. Currently, 90% of cancer deaths are caused by the spread of cancer cells to distant organs. Once implanted and disseminated, metastases are much more difficult to destroy by means of chemotherapy.Following a process of intravasation, some tumor cells escape from the primary tumor and migrate through the circulatory systems before being extravasated, then distributed and finally disseminated in various organs. Thus, in the circulatory environment, these circulating tumor cells (CTCs) are particularly accessible to therapeutic agents. In this context, we have imagined the use of nanoparticles with controlled architecture, in order to selectively intercept these cells in the blood environment.For this purpose, we have synthesized by ring opening of the corresponding lactone, amphiphilic di- and tri-block copolymers of poly (benzyl glutamate). Their self-assembly made it possible to obtain amphiphilic nanoparticles smaller than 100 nm in size and with a negative ζ potential, whose controllable geometry ranges from spherical (aspect ratio 1.3) to ellipsoidal (oblates) (aspect ratio 2, 6) and having PEG chains on the surface under controlled surface conformations and densities.Due to their ability to circulate in the blood compartment, these nanoparticles have an optimal probability of interaction with CTCs.The modification impact of their architecture has been established by studying the interaction capacities of the different nanoparticles prepared. On the one hand with the plasma proteins and on the other hand, with the different cell types encountered in the blood compartment.The most striking results show that the elongation of the nanoparticles (oblates) and the anisotropy of their surface, characterized by their hydrophilic / lipophilic balance, strongly govern their interactions. Interestingly, it appears that the elongation of particles whose surface is uniformly hydrophilic decreases the intensity of their capture by the different types of cell models studied (HUVEC model endothelial cells), RAW 276.7 cells (macrophage model) and cells PC3 (prostate cancer) and B16 (melanoma). Although, when these nanoparticles exhibit surface anisotropy, their capture by these different cell types is increased with the elongation of the particles (elongation factor of 2.1).In a final experimental part, these nanoparticles were modified by grafting the MART1 protein on their surface. These immuno-nanoparticles showed a certain recognition capacity of B16 cells (melanoma model). However, their efficacy after intravenous injection should be specified in vivo.

Précédemment, il a été démontré au laboratoire qu’une vaccination des souris avec des lipopolyplexes (LPR) contenant l’ARNm de l’antigène de mélanome MART1 permet d’induire la formation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques et de retarder le développement de mélanomes B16F10 et de métastases pulmonaires. Les LPR sont des complexes ternaires constitués d’ARNm, d’un polymère cationique histidylé et de liposomes cationiques histidylés. L’objectif de ma thèse était d’améliorer cette vaccination antitumorale en développant de nouveaux liposomes capables de cibler les cellules dendritiques (DC). Le ciblage a été réalisé en incorporant un glycolipide mannosylé aux liposomes afin de favoriser leur reconnaissance par le récepteur mannose. A partir de ces liposomes, des formulations de complexes ternaires à base d’ADN (LPD mannosylés ou Man11-LPD100) ou à base d’ARN (LPR mannosylés ou Man11- LPR100) ont été mis au point. Les résultats montrent que : in vitro les formulations Man11-LPD100 sont mieux internalisés et transfectent plus efficacement les DC que les LPD100 non mannosylés. Les formulations Man11-LPR100 transfectent avec une plus grande efficacité les DC par rapport aux Man11- LPD100. Par ailleurs, une forte réduction de la toxicité des formulations a été obtenue en dialysant les liposomes. Il est également possible de conserver les formulations sous forme déshydratée. Une imagerie par scintigraphie effectuée chez la souris a permis de constater que 9% des LPD sont captés dans la rate après une injection IV. Nous avons mis en évidence après un isolement de DC spléniques que les formulations Man11-LPR100 transfectent 4 fois plus de DC que les LPR non manosylés. Enfin, l’immunisation des souris avec Man11-LPR100 contenant l’ARNm MART1 permet une vaccination plus efficace contre la tumeur B16F10 et une meilleure survie. En conclusion, les LPR Man11-LPD100 sont de bons vecteurs pour cibler et transfecter les DC spléniques avec l’ARNm d’un antigène tumoral et pour induire la réponse immune contre les cellules tumorales. / Previously, it has been demonstrated that mice vaccination with lipopolyplexes (LPR) containing melanoma antigen MART1 mRNA can induce the generation of specific cytotoxic T cells and delay B16F10 melanoma growth and lung metastases. LPR are ternary complexes consisting of mRNA, a histidylated cationic polymer and histidylated cationic liposomes. The objective of my thesis was to enhance this antitumor vaccination through the development of new liposomes that can target specifically dendritic cells (DC). The targeting of DC was achieved by incorporating a mannosylated glycolipid within liposomes to enhance their recognition by the mannose receptor. From these liposomes, formulations based ternary complexes of DNA (mannosylated-LPD or Man11-LPD100) or formulations based on mRNA (mannosylated LPR or Man11 LPR100) were developed. The results show that formulations made with Man11-LPD100 are better internalized and transfect efficiently DC than LPD100. Man11 LPR100 transfect with greater efficiency DC compared to DNA based formulation (Man11-LPD100). Furthermore, a strong reduction of the toxicity of LPD was obtained by liposomes dialysis. It is also possible to preserve their activity by freeze-drying. Mice scintigraphy revealed that 9% of LPD are captured in the spleen following IV injection. We demonstrated after isolation of splenic DC that Man11-LPR100 transfect DC 4 times more than LPR100. Finally, immunization of mice with Man11-LPR100 containing mRNA MART1 allows a more effective vaccination against B16F10 tumor and a better mice survival than non-mannosylated ones. In conclusion, Man11-LPR100 are promising vectors to target and transfect splenic DC with a tumor antigen mRNA aiming to an induction of an immune response against tumor cells.

Der monoklonale Antikörper SM5-1 wurde in Vorarbeiten mittels eines Immunisierungsprotokolls (Kooperation Prof. Guo, Cleveland, USA) von einer humanen Melanom-Zell-Linie gewonnen. In der vorliegenden Arbeit wurde an nicht-melanozytären benignen Geweben, 16 Nävi, 84 nicht-melanozytären Tumoren sowie 745 Melanomproben das Färbeverhalten von SM5-1 mittels Immunhistochemie charakterisiert. SM5-1 wurde zunächst mit HMB-45 und anti-S100 an 250 primären und 151 metastasierten Melanomen und in einer zweiten Stichprobe mit Antikörpern gegen Melan-A/MART-1 (A103) und Tyrosinase (T311) an 101 primären und 243 metastasierten Melanomen verglichen. Es zeigte sich, dass SM5-1 für normale Zellen negativ ist. SM5-1, anti-S100 und HMB-45 färbten 100% der Nävi und 97 - 99% der 250 primären Melanome. Während SM5-1 und anti-S100 96% der 151 Melanommetastasen korrekt identifizierten, waren für HMB-45 nur 83% der Proben positiv. Alle HMB-45 negativen Metastasen reagierten mit SM5-1. Weder SM5-1 noch HMB-45 färbten nicht-melanozytäre Tumore, wohingegen der unspezifischere Antikörper anti-S100 21 von 84 dieser Tumore färbte. Insgesamt wurde beim primären und metastasierten Melanom für SM5-1 eine Sensitivität von 98%, für HMB-45 von 93% und für anti-S100 von 97% beobachtet. Im Vergleich der Antikörper SM5-1, A103 und T311 färbten SM5-1 92,4%, A103 82,9% und T311 71,2% der insgesamt 344 primären und metastasierten Melanome. SM5-1 zeigte innerhalb einer Tumorzellpopulation ein homogeneres Färbeverhalten und eine höhere Färbeintensität bei den 243 Melanommetastasen als A103 und T311. Der monoklonale Antikörper SM5-1 zeigte gegenüber den gebräuchlichen Antikörpern erhebliche Vorteile bei der immunhistochemischen Beurteilung des Melanoms, insbesondere bei dessen Metastasen. Somit kann er als Marker der ersten Wahl bei der immunhistochemischen Diagnostik von Melanomen empfohlen werden. Um die Rolle des durch SM5-1 erkannten Antigens zu verstehen, sind jedoch noch weitere Untersuchungen notwendig. / Antibodies such as HMB-45 and anti-S100 protein have been widely used as markers of malignant melanoma. Using a subtractive immunization protocol in preliminary works (cooperation Prof. Guo, Cleveland, USA), the monoclonal antibody SM5-1 was generated from a mouse model of human melanoma. The immunhistochemical staining of SM5-1 was studied in paraffin-embedded specimens of normal non-melanocytic tissue, melanocytic nevi of the skin (n = 16), non-melanocytic neoplasms (n = 84) and 745 melanomas. 250 primary melanomas and 151 metastases were compared with HMB-45 and anti-S100 staining. Further 101 primary melanomas and 243 metastases were compared with Melan-A/MART-1 (A103) and tyrosinase (T311). Staining of normal cells for SM5-1 was found to be negative. SM5-1, anti-S100 and HMB-45 reacted with nevi and 97 - 99% of 250 primary melanomas. Whereas SM5-1 and anti-S100 showed a high degree of positive staining in 96% of 151 metastases, only 83% reacted with HMB-45. All HMB-45-negative melanoma metastases were found to be positive for SM5-1. Whereas neither SM5-1 nor HMB-45 stained any of 84 specimens from non-melanocytic neoplasms, anti-S100 was positive in 21/84. Altogether SM5-1 has a sensitivity of 98%, HMB-45 of 93% and anti-S100 of 97% for primary and metastatic melanomas. SM5-1 stained 92,3%, A103 82,9% and T311 71,2% of 344 primary and metastatic melanomas. SM5-1 showed a stronger and more homogeneous reactivity as A103 und T311 in metastases (n = 243). All tested antibodies had a comparable staining intensity for primary melanomas (n = 101). The monoclonal antibody SM5-1 appears to have advantages for the immunhistochemical analysis of melanoma over currently available antibodies, especially for melanoma metastases. Therefore it is useful as a first line reagent in immunohistochemistry of melanoma. Further studies are needed to elucidate the exact nature of the antigen recognized by SM5-1.

Précédemment, il a été démontré au laboratoire qu'une vaccination des souris avec des lipopolyplexes (LPR) contenant l'ARNm de l'antigène de mélanome MART1 permet d'induire la formation de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques et de retarder le développement de mélanomes B16F10 et de métastases pulmonaires. Les LPR sont des complexes ternaires constitués d'ARNm, d'un polymère cationique histidylé et de liposomes cationiques histidylés. L'objectif de ma thèse était d'améliorer cette vaccination antitumorale en développant de nouveaux liposomes capables de cibler les cellules dendritiques (DC). Le ciblage a été réalisé en incorporant un glycolipide mannosylé aux liposomes afin de favoriser leur reconnaissance par le récepteur mannose. A partir de ces liposomes, des formulations de complexes ternaires à base d'ADN (LPD mannosylés ou Man11-LPD100) ou à base d'ARN (LPR mannosylés ou Man11- LPR100) ont été mis au point. Les résultats montrent que : in vitro les formulations Man11-LPD100 sont mieux internalisés et transfectent plus efficacement les DC que les LPD100 non mannosylés. Les formulations Man11-LPR100 transfectent avec une plus grande efficacité les DC par rapport aux Man11- LPD100. Par ailleurs, une forte réduction de la toxicité des formulations a été obtenue en dialysant les liposomes. Il est également possible de conserver les formulations sous forme déshydratée. Une imagerie par scintigraphie effectuée chez la souris a permis de constater que 9% des LPD sont captés dans la rate après une injection IV. Nous avons mis en évidence après un isolement de DC spléniques que les formulations Man11-LPR100 transfectent 4 fois plus de DC que les LPR non manosylés. Enfin, l'immunisation des souris avec Man11-LPR100 contenant l'ARNm MART1 permet une vaccination plus efficace contre la tumeur B16F10 et une meilleure survie. En conclusion, les LPR Man11-LPD100 sont de bons vecteurs pour cibler et transfecter les DC spléniques avec l'ARNm d'un antigène tumoral et pour induire la réponse immune contre les cellules tumorales.

Une réponse antitumorale suite à l'induction de lymphocytes T cytotoxiques peut être générée après transfert in vitro ou directement in vivo d'ARNm d'antigènes tumoraux dans les cellules dendritiques (DCs). Cependant, peu de vecteurs permettent une introduction efficace d'ARNm dans les DCs. Nous avons élaboré des nanoparticules d'ARNm avec des polymères cationiques histidylés (polyplexes), des lipides cationiques histidylés (lipoplexes) ou un mélange des deux (lipopolyplexes). Ces vecteurs deviennent fusiogènes en milieu acide et favorisent la délivrance de l'ARNm dans le cytosol lors de son endocytose. Une optimisation de l'ARNm en ajoutant en 5' une coiffe 3'-O-méthyl-m75'GpppS'G (ARCA) et en 3' une queue de 100 adénosines (A 100) a permis la synthèse d'un transcrit ARCA-ARNm-A 100 qui permet une bonne expression de l'antigène dans les DCs. La polyéthylèneimine hisidylée a été identifiée comme étant un bon agent de transfert de l'ARNm de l'antigène du mélanome MART-1 dans les DCs matures in vitro. Pour une vaccination par injection directe de l'ARNm codant l'antigène, nous avons développé de nouvelles nanoparticules tripartites (lipopolyplexes) correspondant à des polyplexes d'ARNm ARCA-MART1-A100 avec un dérivé PEGylé de la polylysine histidylée encapsulés dans des liposomes histidylés. Par injection systémique, ces lipopolyplexes induisent un effet protecteur spécifique et significatif contre la progression tumorale cutanée et métastatique pulmonaire du mélanome murin B16F10. La mise en place d'une réponse immune de type Thl avec une forte sécrétion d'IFN-y et une activité T cytotoxique a pu être mise en évidence montrant ainsi l'intérêt des lipopolyplexes histidylés.