L’endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s’est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l’activation de l’endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l’adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d’étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d’abord, nous avons exploré l’utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d’une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d’un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d’optimiser les techniques d’étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l’origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l’effet de diverses matrices et de la densité d’ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l’obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l’HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l’absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l’HTAP et non dans l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L’autre étude a montré l’intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d’HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L’hypothèse récente d’une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l’effet d’un processus d’ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n’a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l’inverse, l’hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC. / The endothelium plays a key role in the development and the homeostasis of vascular functions. It is also well involved in pathological situations like cardiovascular diseases. Thanks to the description of circulating endothelial markers, non invasive study of the endothelium is now possible. Our group was particularly interested in circulating endothelial cells (CECs), the level of which reflects an endothelial activation or lesion, and to circulating endothelial progenitors cells (EPCs), markers of endothelial repair. EPC description by Asahara in 1997 in adult blood, involved in new blood vessel formation by vasculogenesis, offered new perspectives, specially for cell therapy in ischemic diseases. This work consisted in the development of methods to study these markers in different contexts. First, we explored the interest of these markers in the physiopathology of pulmonary arterial hypertension (PAH). Then we evaluated endothelial progenitors mobilization from the vascular wall by a local ischemia process in healthy volunteers, in the perspective of an autologous cell therapy product development. One part of this project was the implementation and optimization of the methods to study CEC and EPC. CEC were quantified by magnetic immunoseparation. This technique was developped in 1992 by F. Dignat-George's group and transferred in our laboratory. EPC were quantified by flow cytometry and cell culture. Two types of EPC are described in culture: the early EPC, which originate from monocyte lineage and which culture is standardized, and the « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), the only cells presenting endothelial progenitor cell properties and which use as a cell therapy product can be considered. ECFC quantification by culture was optimized by assessment of the impact of diverse matrices and seeding concentrations of mononuclear cells isolated from whole blood, on ECFC commitment and their angiogenic properties. Endothelial dysfunction was described as a central element in the development of PAH, which diagnosis is based on the use of right heart catheterization. Due to the lack of noninvasive marker for this disease, CEC and circulating progenitors were quantified in two studies. One of them realized in adult patients showed a specific increase of CEC in PAH and not in post-embolic PH. CEC would then reflect the presence of specific endothelial lesions and not the clinical state of the patients. The other study demonstrated the interest of CEC quantification in the therapeutic care of children with PAH secondary to congenital heart disease, for whom patients in irreversible state had a higher level of CEC. We then defined a new noninvasive biomarker.that can be used for the diagnosis and prognosis of PAH. EPC are rare events in whole blood, difficult to expand and for which, mobilization protocols revealed insufficient. The recent hypothesis of a vascular reservoir for endothelial progenitor led us to study the effect of a local ischemia procedure on the mobilization of these cells in healthy volunteers. Two age groups were included to assess the impact of aging on this procedure. Despite a significant endothelial dilation with the local ischemia, no EPC were mobilized, whatever the age group. Ischemia even altered ECFC angiogenic properties.

Malgré l’efficacité thérapeutique avérée des agents anti-angiogéniques et des agents anti-vasculaires (VDA), le mécanisme d’action précis des stratégies ciblant les vaisseaux sanguins tumoraux, les raisons de leur efficacité ainsi que les mécanismes de résistance à ces drogues sont encore mal compris. Il est rapidement apparu essentiel d’identifier des biomarqueurs capables de refléter l’angiogénèse tumorale ou les effets sur la vascularisation tumorale de ces traitements. Compte tenu de leur importance dans des pathologies vasculaires, les cellules endothéliales matures circulantes (CEC) et les progéniteurs endothéliaux circulants (CEP) ont d’emblée été pressenties comme des candidats intéressants pour être des biomarqueurs de réponse aux stratégies ciblant la vascularisation tumorale. Nous avons exploré l’intérêt de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse dans des tumeurs pédiatriques, et leur rôle en tant que biomarqueurs de traitement par des agents anti-angiogéniques chez des sujets adultes atteints de cancer. Ces travaux ont mis en lumière l’intérêt des CEP et ont été à la source d’un travail plus « mécanistique » où nous avons étudié dans différents modèles murins le rôle des CEC et CEP dans le mécanisme d’action des agents anti-vasculaires et plus particulièrement le rôle fonctionnel des CEP dans la résistance à ces molécules. Par des stratégies d’association d’agents anti-angiogéniques aux VDA destinées à inhiber les CEP, nous montrons l’augmentation de l’activité anti-tumorale des VDA et offrons un rationnel mécanistique pour optimiser les schémas thérapeutiques actuels des traitements anti-vasculaires. Nos données apportent des arguments en faveur du rôle potentiel de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse, des traitements anti-angiogéniques et de la résistance aux traitements anti-vasculaires. / Despite their therapeutic impact and clinical benefit, the mecanisms of action of anti-angiogenic agents and vascular disrupting agents (VDA), the reasons for their efficacy as well as the mechanisms underlying resistance to these drugs are not fully understood. Thus, identifying surrogate biomarkers of tumor angiogenesis and of the effects of these new therapeutic agents targeting tumor blood vessels has become a crucial objective. Because of their importance in vascular diseases, mature circulating endothelial cells (CEC) and circulating endothelial progenitor cells (CEP) were suggested to be potential candidate biomarkers of disease response and relapse to vascular targeting strategies. We investigated the role of these cells as biomarkers of tumor angiogenesis in pediatric solid tumors, as well as biomarkers of response to anti-angiogenic therapies in adult cancer patients. By revealing the particularly important role of CEP, these initial studies led to a more “mechanistic” study in which the cellular and molecular effects of a VDA were evaluated with regard to CEC and CEP in different mouse models; in particular, the “catalytic” role of CEP was explored as a mechanism of resistance to VDA. By combining anti-angiogenic agents aimed to inhibit CEP mobilized by the VDA, we demonstrate an increase in the anti-tumor activity of the VDA and offer a mechanistic rational to optimize VDA-based therapeutic strategies. Our data support the role of CEC and CEP as biomarkers of angiogenesis, of anti-angiogenic strategies and of resistance to vascular-disrupting therapies.

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Dans la dysfonction endothéliale, le compartiment endothélial circulant joue simultanément le rôle d’acteur impliqué dans la régénération du tissu lésé et celui d’indicateur de l’état d’altération ou de régénération de l’endothélium. Dans l’artérite oblitérante des membres inférieurs (AOMI), l’un des axes de recherche porte sur le développement d’un produit de thérapie cellulaire capable d’induire la formation de néo-Vaisseaux. Face à la difficulté d’obtenir et d`amplifier des cellules progénitrices endothéliales (CPE) chez l’adulte sain, et a fortiori chez le patient, l’une des hypothèses laisse envisager le recours à d’autres types cellulaires ayant des propriétés vasculogéniques. Chez patients atteints de maladies cardiovasculaires, et d’AOMI en particulier, les cellules mononuclées de moelle osseuse et les CPE montrent des propriétés angiogéniques diminuées. Nous avons mis en évidence la capacité des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées de patients atteints d’AOMI à induire une reperfusion, par recrutement de cellules endothéliales in situ, avec la même efficacité que celles de donneurs sains. Les CSM ne se différencient pas en cellules endothéliales mais agissent par paracrinie. La seconde hypothèse d’obtention d’un produit de thérapie cellulaire autologue angiogène est de trier des cellules plus immatures que les CPE afin de les différencier secondairement vers la lignée endothéliale à l’image du modèle pathologique de la cellule souche d’hémangiome CD133+ qui laisse envisager les Very Small Embryonic Like stem cells (VSEL), cellules souches multipotentes CD133+, comme un candidat de cellules post-Natales à potentiel vasculaire. Nous avons dérivés, en culture en conditions angiogéniques, des VSEL qui acquièrent un phénotype mésenchymateux mais présentent un profil sécrétoire proche de celui des CPE. Les VSEL favorisent la revascularisation post-Ischémique et acquièrent un phénotype endothélial in vitro et in vivo suggérant que les VSEL peuvent être à l’origine de la lignée endothéliale. Les VSEL se présentent également comme un biomarqueur de la dysfonction endothéliale mobilisé de la moelle osseuse (MO) vers le sang périphérique (PB) chez les patients souffrant d’AOMI. Les biomarqueurs cellulaires circulants représentent non seulement des marqueurs non invasifs de l’endothélium mais peuvent également apporter des informations utiles pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique des patients souffrant de pathologies associées à une dysfonction endothéliale. Une modification du nombre de CPE et de cellules endothéliales circulantes (CEC) dans la circulation a été rapportée dans différentes situations pathologiques respectivement associées à une régénération et une altération endothéliale telle l’augmentation du taux de CEC chez des patients présentant une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). La technique de référence pour le dénombrement des CEC dans le sang périphérique est l’immunoséparation magnétique (IMS). Cette méthode non automatisée et chronophage, repose sur l’énumération par microscopie à fluorescence des cellules CD146+ préalablement isolées. Bien que reproductible, cette numération est soumise à de nombreux biais de quantification, difficile à mettre en oeuvre et sujette à interprétation. La mise au point d’une méthode de détection automatisée des CEC par cytométrie à focalisation acoustique (AFC) s’est montrée fiable et robuste, dans une cohorte de patients atteints d’HTAP traitée ou non, constituant une alternative pertinente à l’analyse par microscopie. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives dans la détection des biomarqueurs cellulaires circulants impliqués dans la dysfonction endothéliale, proposant les VSEL comme nouvel acteur vasculogénique. / In endothelial dysfunction, circulating endothelial compartment simultaneously plays the role of actor involved in the regeneration of injured tissue and reflects endothelium state. In peripheral arterial disease (PAD), one of the research areas is the development of a cellular therapy product capable of inducing the formation of neo-Vessels. Faced with the difficulty to obtain and amplify endothelial progenitor cells (EPC) in adults, one of the assumptions lets consider the use of other cell types with vasculogenic properties. In patients with cardiovascular disease, and PAD in particular, bone marrow mononuclear cells and EPC show reduced angiogenic properties. We have demonstrated the ability of isolated mesenchymal stem cells (MSCs) from PAD patients to induce reperfusion by recruitment of endothelial cells in situ, with the same efficiency as that of healthy donors MSCs. MSCs do not differentiate into endothelial cells but act by paracrine. The second hypothesis of obtaining an autologous angiogenic cell therapy product is to sort cells more immature than the CPE and to differentiate them secondarily into endothelial lineage as the pathological cell model of hemangioma stem cells CD133 + which lets consider the Very Small Embryonic like stem cells (VSEL), CD133 + multipotent stem cells as a potential candidate of postnatal vascular cell. We have derived and cultured in angiogenic conditions VSEL that acquired a mesenchymal phenotype but exhibited a secretory profile similar to that of EPC. VSEL promote post-Ischemic revascularization and acquire an endothelial phenotype in vitro and in vivo suggesting that VSEL may be responsible for the endothelial lineage. VSEL also appear as a biomarker of endothelial dysfunction mobilized from bone marrow (BM) to peripheral blood (PB) in patients with PAD. Cellular circulating biomarkers are not only non-Invasive markers of endothelium but can also provide useful information for the diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring of patients with endothelial dysfunction associated pathologies. Changing the number of EPC and circulating endothelial cells (CEC) in the circulation has been reported in different pathological situations respectively associated with endothelial regeneration and alteration such as the increase of CEC in patients with pulmonary arterial hypertension (PAH). The reference technique for the enumeration of CEC in peripheral blood is magnetic immunoseparation (IMS). This non-Automated and time-Consuming method, based on the enumeration by fluorescence microscopy of CD146 + cells isolated. Although reproducible, this count is subject to many through quantification, difficult to implement and subject to interpretation. The development of an acoustic focusing cytometry (AFC) method for automated detection of CEC has proved reliable and robust results, in a cohort of patients with PAH treated or not, constituting a relevant alternative analysis to microscopy. All of this work opens new perspectives in the detection of cellular circulating biomarkers involved in endothelial dysfunction, suggesting VSEL as new vasculogenic actor.