Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:22:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Florencio_Moises_M.pdf: 812754 bytes, checksum: c44bcd00e211d80d4501ad8f58305353 (MD5) Previous issue date: 2014 / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Engenharia de Alimentos

Diversos biomateriais podem ser aplicados como suportes na imobilização de células totais de fungos filamentosos ou enzimas isoladas, visando a manutenção e o prolongamento da atividade enzimática em processos biocatalíticos. Exemplos promissores de biomateriais são a fibroína da seda e o alginato de sódio. A fibroína é um material protéico com alta estabilidade térmica, elasticidade, resistência à tensão, não sofre ataque microbiano, baixo custo de purificação e alta tenacidade, o alginato é um biopolímero versátil, devido a suas propriedades gelificantes em soluções aquosas. Assim, neste trabalho empregou-se micélios do fungo derivado de ambiente marinho, Penicillium citrinum CBMAI 1186, livres e imobilizados em biopolímeros (fibra de algodão, fibra de fibroína da seda e fibra de paina) na biorredução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação α,β-C=C de enonas α,β-, α,β,γ,δ- e di-α,β-insaturadas previamente sintetizados pela a reação de condensação aldólica. Foi possível a utilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 na redução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação dupla carbono-carbono de sistemas α,β-insaturados. A imobilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 em biopolímeros (algodão, fibroína da seda, paina e quitosana) permitiu a prolongamento da atividade celular do fungo. O protocolo desenvolvido foi capaz de obter compostos até então descritos apenas por síntese clássica. Também foi realizado reações de resolução enzimática de derivados de haloidrinas por diferentes lipases microbianas de: Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus e Aspergillus niger. A lipase de P. fluorescens foi imobilizada em esferas de fibroína do bicho da seda (método 1, via adsorção) e em blenda com alginato de cálcio (método 2, via encapsulação) em diferentes condições, tais como, variação de solvente, variação da quantidade de enzima imobilizada e tempo de reação. As condições otimizadas foram empregadas em diferentes haloidrinas, rendendo elevados excessos enantioméricos (ee > 99%) e alta razão enanantiomérica (E > 200) para os produtos acetilados. Foi possível desenvolver um protocolo simples, barato e prático para a síntese enantiosseletiva de haloidrina reforçando a versatilidade da fibroína e do alginato como suportes de imobilização para catalisadores heterogêneos. Também foi possível utilizar a lipase imobilizada (método 2) na reação de transesterificação para obtenção do biodiesel etílico. As melhores condições para o bom funcionamento do biocatalisador foram: 30% do biocatalisador, 20% de n-hexano, relação óleo e etanol de 1:4 a 32 ºC por 48 h em agitação magnética (400 rpm). Essas condições permitiram a formação de 42% de rendimento do biodiesel etílico. O biocatalisador apresentou algumas limitações reacionais, tais como, fragilidade frente a elevadas temperaturas (> 32 ºC) e prolongado tempo de agitação magnética. Porém, permaneceu apto no meio por 4 ciclos consecutivas. Conclui-se que os biomateriais (fibroína, alginato e quitosana) podem ser utilizados como alternativas versáteis na imobilização de micélios de fungos filamentoso e de enzimas isoladas para aplicações em biocatalíticas. / Various biomaterials have been used as matrices for immobilization of whole filamentous fungi or isolated enzymes in order to maintain and extend enzyme activity in biocatalytic processes. Promising examples of biomaterials include silk fibroin and sodium alginate. Fibroin is a protein with high thermal stability, elasticity, and tensile strength; the ability to resist microbial attacks; and low purification costs. Owing to its gelling properties in aqueous solutions, alginate is a versatile biopolymer. In this work, we used the mycelia of a marine fungus, Penicillium citrinum CBMAI 1186, in the free form as well as immobilized in biopolymers (cotton fiber, silk fibroin, and kapok fiber) for the chemoselective, regioselective, and enantioselective bioreduction of the α,β-C=C bond of unsaturated α,β-, α,β,γ,δ-, and di-α,β-enones previously synthesized by aldol condensation. P. citrinum CBMAI 1186 successfully performed chemoselective, regioselective, and enantioselective reduction of the double carbon-carbon bond in unsaturated α,β-systems. Immobilization of P. citrinum CBMAI 1186 in biopolymers (cotton, silk fibroin, kapok fiber, and chitosan) prolonged the biocatalytic activity of the fungus. This protocol could be used to obtain compounds that have until now only been produced using classic synthesis methods. Enzymatic resolution of derivatives of halohydrins by lipases from Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus, and Aspergillus niger was also carried out. P. fluorescens lipase was immobilized in silk fibroin spheres (method 1, via adsorption) and in a calcium alginate blend (method 2, via encapsulation) under different conditions, i.e., different solvents, quantity of immobilized enzyme, and reaction time. The optimized conditions were used to resolve different halohydrins, and the acetylated products were obtained at high enantiomeric excess (ee > 99%) and high enantiomeric ratio (E > 200). A simple, inexpensive, and convenient protocol was developed for the enantioselective synthesis of halohydrins. The results highlight the versatility of fibroin and alginate as immobilization matrices for heterogeneous catalysts. The lipase immobilized by method 2 was also used in a transesterification reaction to obtain ethyl biodiesel. The optimum conditions for biocatalysis were: 30% biocatalyst, 20% n-hexane, and oil-to-ethanol ratio of 1:4 at 32°C for 48 h on a magnetic stirrer (400 rpm). Under these conditions, the yield of ethyl biodiesel reached 42%. Biocatalysts have some limitations, such as low stability at temperatures > 32°C and prolonged time of magnetic stirring. However, the catalysts remained active for 4 consecutive cycles. In conclusion, biomaterials (fibroin, alginate, and chitosan) can be used as versatile alternatives for immobilization of fungal mycelium and isolated enzymes for use in biocatalysis.

Diversos biomateriais podem ser aplicados como suportes na imobilização de células totais de fungos filamentosos ou enzimas isoladas, visando a manutenção e o prolongamento da atividade enzimática em processos biocatalíticos. Exemplos promissores de biomateriais são a fibroína da seda e o alginato de sódio. A fibroína é um material protéico com alta estabilidade térmica, elasticidade, resistência à tensão, não sofre ataque microbiano, baixo custo de purificação e alta tenacidade, o alginato é um biopolímero versátil, devido a suas propriedades gelificantes em soluções aquosas. Assim, neste trabalho empregou-se micélios do fungo derivado de ambiente marinho, Penicillium citrinum CBMAI 1186, livres e imobilizados em biopolímeros (fibra de algodão, fibra de fibroína da seda e fibra de paina) na biorredução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação α,β-C=C de enonas α,β-, α,β,γ,δ- e di-α,β-insaturadas previamente sintetizados pela a reação de condensação aldólica. Foi possível a utilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 na redução quimiosseletiva, regiosseletiva e enantiosseletiva da ligação dupla carbono-carbono de sistemas α,β-insaturados. A imobilização do fungo P. citrinum CBMAI 1186 em biopolímeros (algodão, fibroína da seda, paina e quitosana) permitiu a prolongamento da atividade celular do fungo. O protocolo desenvolvido foi capaz de obter compostos até então descritos apenas por síntese clássica. Também foi realizado reações de resolução enzimática de derivados de haloidrinas por diferentes lipases microbianas de: Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus e Aspergillus niger. A lipase de P. fluorescens foi imobilizada em esferas de fibroína do bicho da seda (método 1, via adsorção) e em blenda com alginato de cálcio (método 2, via encapsulação) em diferentes condições, tais como, variação de solvente, variação da quantidade de enzima imobilizada e tempo de reação. As condições otimizadas foram empregadas em diferentes haloidrinas, rendendo elevados excessos enantioméricos (ee > 99%) e alta razão enanantiomérica (E > 200) para os produtos acetilados. Foi possível desenvolver um protocolo simples, barato e prático para a síntese enantiosseletiva de haloidrina reforçando a versatilidade da fibroína e do alginato como suportes de imobilização para catalisadores heterogêneos. Também foi possível utilizar a lipase imobilizada (método 2) na reação de transesterificação para obtenção do biodiesel etílico. As melhores condições para o bom funcionamento do biocatalisador foram: 30% do biocatalisador, 20% de n-hexano, relação óleo e etanol de 1:4 a 32 ºC por 48 h em agitação magnética (400 rpm). Essas condições permitiram a formação de 42% de rendimento do biodiesel etílico. O biocatalisador apresentou algumas limitações reacionais, tais como, fragilidade frente a elevadas temperaturas (> 32 ºC) e prolongado tempo de agitação magnética. Porém, permaneceu apto no meio por 4 ciclos consecutivas. Conclui-se que os biomateriais (fibroína, alginato e quitosana) podem ser utilizados como alternativas versáteis na imobilização de micélios de fungos filamentoso e de enzimas isoladas para aplicações em biocatalíticas. / Various biomaterials have been used as matrices for immobilization of whole filamentous fungi or isolated enzymes in order to maintain and extend enzyme activity in biocatalytic processes. Promising examples of biomaterials include silk fibroin and sodium alginate. Fibroin is a protein with high thermal stability, elasticity, and tensile strength; the ability to resist microbial attacks; and low purification costs. Owing to its gelling properties in aqueous solutions, alginate is a versatile biopolymer. In this work, we used the mycelia of a marine fungus, Penicillium citrinum CBMAI 1186, in the free form as well as immobilized in biopolymers (cotton fiber, silk fibroin, and kapok fiber) for the chemoselective, regioselective, and enantioselective bioreduction of the α,β-C=C bond of unsaturated α,β-, α,β,γ,δ-, and di-α,β-enones previously synthesized by aldol condensation. P. citrinum CBMAI 1186 successfully performed chemoselective, regioselective, and enantioselective reduction of the double carbon-carbon bond in unsaturated α,β-systems. Immobilization of P. citrinum CBMAI 1186 in biopolymers (cotton, silk fibroin, kapok fiber, and chitosan) prolonged the biocatalytic activity of the fungus. This protocol could be used to obtain compounds that have until now only been produced using classic synthesis methods. Enzymatic resolution of derivatives of halohydrins by lipases from Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea, Rhizopus niveus, and Aspergillus niger was also carried out. P. fluorescens lipase was immobilized in silk fibroin spheres (method 1, via adsorption) and in a calcium alginate blend (method 2, via encapsulation) under different conditions, i.e., different solvents, quantity of immobilized enzyme, and reaction time. The optimized conditions were used to resolve different halohydrins, and the acetylated products were obtained at high enantiomeric excess (ee > 99%) and high enantiomeric ratio (E > 200). A simple, inexpensive, and convenient protocol was developed for the enantioselective synthesis of halohydrins. The results highlight the versatility of fibroin and alginate as immobilization matrices for heterogeneous catalysts. The lipase immobilized by method 2 was also used in a transesterification reaction to obtain ethyl biodiesel. The optimum conditions for biocatalysis were: 30% biocatalyst, 20% n-hexane, and oil-to-ethanol ratio of 1:4 at 32°C for 48 h on a magnetic stirrer (400 rpm). Under these conditions, the yield of ethyl biodiesel reached 42%. Biocatalysts have some limitations, such as low stability at temperatures > 32°C and prolonged time of magnetic stirring. However, the catalysts remained active for 4 consecutive cycles. In conclusion, biomaterials (fibroin, alginate, and chitosan) can be used as versatile alternatives for immobilization of fungal mycelium and isolated enzymes for use in biocatalysis.

Submitted by Kamila Costa (kamilavasconceloscosta@gmail.com) on 2015-07-14T19:57:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Silmara M Miranda.pdf: 1535464 bytes, checksum: 2e2afc8694fa41a1cb6af9490965b12b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T19:32:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Silmara M Miranda.pdf: 1535464 bytes, checksum: 2e2afc8694fa41a1cb6af9490965b12b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T19:36:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Silmara M Miranda.pdf: 1535464 bytes, checksum: 2e2afc8694fa41a1cb6af9490965b12b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-16T19:36:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Silmara M Miranda.pdf: 1535464 bytes, checksum: 2e2afc8694fa41a1cb6af9490965b12b (MD5) Previous issue date: 2014-06-27 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Filamentous fungi are organisms with the ability to produce various secondary metabolites, among them, mycotoxins, characterized by the toxic properties that have the human and animal organism. Are produced mostly by species of the genera Aspergillus and Penicillium, by engaging with relevant food contamination and mycotoxin production. The study aimed to identify the mycoflora and mycotoxins in samples of cassava produced in TNL in the Amazon region, Brazil flour. 30 samples of cassava flour in the local market and evaluated for moisture and water activity (aw), fungi (isolation, purification and identification by traditional taxonomy) and mycotoxins were collected. Confirmation of toxigenic fungal species was made by molecular biology, scanning electron microscopy was performed in three toxigenic species and mycotoxins were identified by MALDI-TOF. The results of moisture and (aw) ranging from 7.08 to 13.55% and 0.37 to 0.69 respectively. Among the samples analyzed, 30% had fungi and of these 18.5% were toxigenic. The species most frequently identified were Aspergillus flavus, Penicillium waksmanii and Penicillium citrinum. Among the toxigenic fungi Penicillium citrinum, Aspergillus flavus and Aspergillus amoenus were found. MALDI-TOF showed the presence of aflatoxin B1, patulin and citrinana more frequently. We conclude that greater attention to cassava flour, one of the most consumed foods in the north of the country is needed as toxigenic fungi and mycotoxins were found in the samples analyzed. / Fungos filamentosos são organismos com a capacidade de produzir diversos metabólitos secundários, dentre eles, as micotoxinas, caracterizadas pelas propriedades tóxicas que apresentam ao organismo humano e animal. São produzidas em sua maioria por espécies dos gêneros Aspergillus e Penicillium, relevantes pelo envolvimento com contaminação de alimentos e produção de micotoxinas. O estudo objetivou identificar a micobiota e ocorrência de micotoxinas em amostras de farinha de mandioca produzidas em Coari na região Amazônica, Brasil. Foram coletadas 30 amostras de farinha de mandioca no mercado local e avaliadas quanto à umidade e atividade de água (aw), fungos (isolamento, purificação e identificação pela taxonomia tradicional) e micotoxinas. A confirmação das espécies fúngicas toxigênicas foi feita pela biologia molecular, foi realizada microscopia eletrônica de varredura em três espécies toxigênicas e micotoxinas foram identificadas por MALDI-TOF. Os resultados de umidade e (aw) variaram de 7,08 a 13,55% e 0,37 a 0,69 respectivamente. Entre as amostras analisadas, 30% apresentaram fungos e destes 18,5% foram toxigênicos. As espécies identificadas com maior frequência foram Aspergillus flavus, Penicillium waksmanii e Penicillium citrinum. Entre os fungos toxigênicos foram encontrados Penicillium citrinum, Aspergillus flavus e Aspergillus amoenus. MALDI-TOF demonstrou presença de aflatoxina B1, citrinana e patulina com maior frequência. Conclui-se que é necessário maior orientação para os produtores da farinha de mandioca, um dos alimentos mais consumido na região Norte do país, pois fungos toxigênicos e micotoxinas foram encontrados nas amostras analisadas.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-19T13:51:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-19T13:51:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-19T13:51:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cellulolytic enzymes are highly specific biocatalysts. These are classified according to the place where they work in the cellulosic fiber: endoglucanases initiate hydrolysis exoglucanases act on reducing terminals produced by endoglucanases and β-glucosidases act on the product of catalysis of exoglucanases releasing glucose monomers . Penicillium fungi are widely reported as a great producer of cellulolytic enzymes. Aiming to contribute to the catalytic process and obtaining new sources of enzymes , this study evaluated the physicochemical properties of enzymes produced cellulolytic fungus Penicillium citrinum isolated from bagasse cane sugar mill Jayoro of S / A, located in the municipality of Presidente Figueiredo -AM - Brazil . And the enzyme production profile was repaired during submerged fermentation with the strain of Trichoderma reesei QM9414 which is widely reported as a great producer of cellulolytic enzymes. P. citrinum showed equivalent performance to T. reesei QM9414 in volumetric enzyme activity (U/mL) and superior performance in specific activities (U/mg). About properties of endoglucanases and β-glucosidase from P. citrinum, the optimum temperature for activity was 60 ° C for both enzymes. The optimum pH for endoglucanases activity was pH 4.2 and the activity of β-glucosidase pH 6.0. P. citrinum produced at least two endoglucananes with apparent molecular masses of ~ 50kDa and ~ 35kDa , visualized on SDS-PAGE gels and in gel activity ( zymogram ) . An elution fraction obtained from size exclusion chromatography, showed only β-glucosidase activity and revealed bands of approximately 100 kDa . The performance and characteristics of these endo and β- glucosidases demonstrate that P. citrinum represents a new alternative for production of cellulolytic enzymes for hydrolysis of fiber. / As enzimas celuloliticas são biocatalizadores altamente específicos. Estas, são classificadas de acordo com o local em que atuam na fibra celulósica: endoglucanases iniciam a hidrólise, exoglicanases agem nos terminais redutores produzidos pelas endoglicanases e as beta-glicosidases atuam no produto da catálise das exoglicanases liberando monômeros de glicose. Fungos do gênero Penicillium são amplamente reportados como ótimos produtores de enzimas celuloliticas. Visando contribuir para os processos biocataliticos e obtenção de novas fontes de enzimas, neste trabalho avaliou-se as propriedades físico-químicas de enzimas celuloliticas produzidas fungo Penicillium citrinum isolado do bagaço de cana-de-açucar da Usina Jayoro S/A, localizada no município de Presidente Figueiredo-AM-Brasil. E comparou-se o perfil de produção enzimática durante a fermentação submersa com o da estirpe Trichoderma reesei QM9414 que é amplamente reportado como um otimo produtor de enzimas celulolíticas. P. citrinum apresentou desempenho equivalente à T. reesei QM9414 nas atividades enzimáticas volumétricas (U/mL) e desempenho superior nas atividades especificas (U/mg). Quanto as propriedades das endoglicanases e beta-glicosidase de P. citrinum, a temperatura ótima de atividade foi 60ºC para ambas as enzimas. O pH ótimo para a atividade endoglicanásica foi pH 4,2 e para a atividade de beta-glicosidase pH 6,0. P. citrinum produziu pelo menos duas endoglicananes com massas moleculares aparente de ~ 50kDa e ~ 35kDa, visualizadas em gel de SDS-PAGE e em gel de atividade (zimograma). Uma fração obtida da eluição de cromatografia de exclusão molecular, apresentou somente atividade de beta-glicosidase e revelou bandas de aproximadamente 100kDa. O desempenho e as características dessas endo e beta-glicosidades demonstram que P. citrinum representa uma alternativa para produção de novas enzimas para hidrolise da fibra celulolitica.