京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24983号 / 生博第512号 / 新制||生||68(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 荒木 崇, 教授 鈴木 淳, 教授 谷口 雄一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection / Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection

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La morphologie des cellules et leurs interactions avec l’environnement découlent de divers procédés mécaniques qui contribuent à la richesse et à la diversité de la vie qui nous entoure. À titre d’exemple, les cellules mammifères se conforment à différentes géométries en fonction de l’architecture de leur cytosquelette tandis que les bactéries et les levures adoptent une forme circulaire par turgescence. Je présente, dans cette thèse, la découverte d’un mécanisme de morphogénèse supplémentaire, soit la déformation de surface cellulaire via l’assemblage de protéines par démixtion de phases aqueuses non miscibles et l’adhésion entre les matériaux biologiques. J’expose de façon spécifique comment ce mécanisme régule le recrutement et le mouvement dynamique des protéines qui induisent l’invagination de la membrane plasmique lors de l’endocytose clathrine-dépendante (CME). Le phénomène de démixtion des protéines dans le cytoplasme est analogue à la séparation de phase de l’huile en solution aqueuse. Il constitue un mécanisme cellulaire important et conservé, où les protéines s’agglomèrent grâce aux interactions intermoléculaires qui supplantent la tendance du système à former un mélange homogène. Plusieurs exemples de compartiments cellulaires dépourvus de membrane se forment par démixtion de phase, tels que le nucléole et les granules de traitement de l’ARN [1-6]. Ces organes ou compartiments dénommés NMO, du terme anglais « non-membranous organelles », occupent des fonctions de stockage, de traitement et de modification chimique des molécules dans la cellule. J’explore ici les questions suivantes : est-ce que les NMO occupent d’autres fonctions à caractère morphologique ? Quels signaux cellulaires régulent la démixtion de phase des protéines dans la formation des NMO ? Fondée sur la physique mécanique du contact entre les matériaux, j’émets l’hypothèse que des compartiments cellulaires nanoscopiques, formés par démixtion de phase, génèrent des forces mécaniques par adhésion interfaciale. Le travail mécanique ainsi obtenu déforme le milieu cellulaire et les surfaces membranaires adjacents au NMO nouvellement créé. Le but de mon doctorat est de comprendre comment les cellules orchestrent, dans le temps et l’espace, la formation des NMO associés au CME et comment ceux-ci génèrent des forces mécaniques. Mes travaux se concentrent sur les mécanismes de démixtion de phase et d’adhésion de contact dans le processus d’endocytose chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour enquêter sur le rôle des modifications post-traductionnelles dans ces mécanismes, nous avons premièrement analysé la cinétique de phosphorylation des protéines en conditions de stress. Mes résultats démontrent que le recrutement et la fonction de certaines protéines impliquées dans le CME se régulent via des mécanismes de phosphorylation. Outre les processus de contrôle post-traductionnel, nous avons élucidé le rôle des domaines de faible complexité dans l’assemblage de plusieurs protéines associées avec le CME. De concert avec les modifications de phosphorylation, des domaines d’interaction protéine-protéine de type PrD (du terme « prion-like domains ») modulent directement le recrutement des protéines au sein des NMO associés au CME. La nature intrinsèquement désordonnée de ces PrD favorise un mécanisme d’assemblage des protéines par démixtion de phase tel que postulé. Finalement, mes travaux confirment que la formation de ces NMO spécifiques génère des forces mécaniques qui déforment la membrane plasmique et assurent le processus de CME. D’un point de vue fondamental, mes recherches permettent de mieux comprendre l’évolution d’une stratégie cellulaire pour assembler des compartiments cellulaires sans membrane et pour fixer les dimensions biologiques associées au CME. De manière plus appliquée, cette étude a le potentiel de générer des retombées importantes dans la compréhension et le traitement de maladies neurodégénératives souvent associées à une séparation de phase aberrante et à la formation d’agrégats protéiques liés à la pathologie. / Evolution has resulted in distinct mechanical processes that determine the shapes of living cells and their interactions with each other and with the environment. These molecular mechanisms have contributed to the wide variety of life we observe today. For example, mammalian cells rely on a complex cytoskeleton to adapt specific shapes whereas bacteria, yeast and plants use a combination of turgor pressure and cell walls to have their characteristic bloated form. In this dissertation, I describe my discovery of an unforeseen additional mechanism of morphogenesis: protein aqueous-aqueous phase separation and adhesive contact between biomaterials as a simple and efficient ways for cells to organize internal matter and accomplish work to shape internal structures and surfaces. I specifically describe how a fundamental process of phospholipid membrane and membrane-embedded protein recycling, clathrin-mediated endocytosis (CME), is driven by this mechanism. Analogous to water and oil emulsions, proteins, and biopolymers in general, can phase separate from single to a binary aqueous phase. For proteins that de-mix from the bulk environment, the intermolecular interactions (or cohesive energy) that favors protein condensation only needs to overcome the low mixing entropy of the system and represents a conserved and energy efficient cellular strategy [2, 3, 7, 8]. So far, various examples of phase separated cellular compartments, termed non-membranous organelles (NMOs), have been discovered. These include the nucleoli, germ line P granules and P bodies, to name a few [1-6]. NMOs are involved in many conserved biological processes and can function as storage, bioreactor or signaling bodies. Cells use phase separation as a scheme to organize internal matter, but do NMOs occupy other complex functions, such as morphogenesis? What specific signals trigger protein phase separation? Based on mechanical contact theory, I proposed that hundreds of nanometer- to micron-scale phase separated bodies can deform the cellular environment, both cytoplasm and membranes, through interfacial adhesion. I studied how mechanical contact between a phase-separated protein fluid droplet and CME nucleation sites on membranes drive endocytosis in the model organism budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Specifically, this dissertation describes first, my investigations of post-translational modifications (phosphorylation) of several CME-mediating proteins and the implications of these modifications in regulating CME. I then describe how my efforts to understand what was distinct about the proteins that are phosphorylated led me to propose their phase separation into droplets capable of driving invagination and vesicle formation from plasma membrane. I used fluorescence microscopy, mass spectrometry and micro rheology techniques to respectively determine the spatiotemporal dynamics, phosphorylation modifications and material properties of coalesced CME-mediating proteins. I further investigated how phase separation of these proteins might generate mechanical force. I demonstrate that changes in the phosphorylation of some endocytic proteins regulates their recruitment to CME nucleation sites. We achieved reliable predictions of functional phosphosites by combining information on the conservation of the post-translational modifications with analysis of the proportion of a protein that is dynamically phosphorylated with time. The same dynamically phosphorylated proteins were enriched for low amino acid compositional complexity “prion-like domains”, which we demonstrated were essential to these proteins undergoing aqueous-aqueous phase separation on CME nucleation sites. I then demonstrate how phase separated droplet can produce mechanical work to invaginate membranes and drive CME to completion. In summary, I have discovered a fundamental molecular mechanism by which phase separated biopolymers and membranes could apply work to shape each other. This mechanism determines the natural selection of spatial scale and material properties of CME. Finally, I discuss broader implications of this dissertation to mechanistic understandings of the origins of neurodegenerative diseases, which likely involve pathological forms of protein phase separation and/or aggregation.