Clostridium perfringens is a leading cause of food poisoning annually in the United States. Ingested C. perfringens vegetative cells respond to the acidic conditions of the stomach by initiating sporulation. The process of sporulation is essential in the formation of an enterotoxin (CPE) that is responsible for the symptoms of acute food poisoning. During sporulation, the cell must differentiate into the mother cell and the forespore. Studies in Bacillus subtilis have shown that gene expression during sporulation is compartmentalized, with different genes expressed in the mother cell and the forespore. The cell-specific RNA polymerase sigma factors coordinate the development of the differentiating cell. These sigma factors are Ï F, Ï E, Ï G, and Ï K. The C. perfringens cpe gene, encoding the enterotoxin CPE, is transcribed from three promoters, P1, P2, and P3. P2 and P3 were previously proposed to be Ï E-dependent, and P1 was proposed to be Ï K-dependent based on consensus recognition sequences. In this study, mutations were introduced into the sigE and sigK genes of C. perfringens. In the sigE and sigK mutants, promoter fusion assays indicated that there was no transcription of cpe in either mutant. We also determined through transcriptional analyses that Ï E-associated RNA polymerase and Ï K-associated RNA polymerase co-regulate the transcription of each other. RT-PCR analyses indicated that Ï K is a very early acting sigma factor. The evidence provided here shows that the regulation of sporulation in C. perfringens is not the same as it is in B. subtilis, as previously proposed. / Master of Science

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm). / The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the ∝-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an ∝-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of ∝-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of ∝-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm). / The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the ∝-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an ∝-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of ∝-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of ∝-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

Doenças, como a enterite necrótica aviária (NE), têm se tornado reemergentes em função não apenas do sistema de criação intensivo de frangos de corte atualmente em uso, como também da restrição imposta ao uso dos aditivos antimicrobianos por diversos países, dentre os quais, aqueles da União Européia. A NE é uma doença que acomete aves de produção e seu agente etiológico primário é o Clostridium perfringens tipo A. Pouco se conhece a respeito dos mecanismos pelos quais o estresse modula o desenvolvimento da NE. O presente trabalho foi realizado para avaliar os efeitos do estresse por calor sobre o desenvolvimento da NE em frangos de corte. Empregou-se, para tal, modelos experimentais de NE em que se usou infecção isolada por C. perfringens e/ou em co-infecção com Eimeria spp. O estresse por calor foi aplicado de forma contínua ou intermitente em longo prazo. Foram propostos sete experimentos; em cinco deles os animais foram criados em câmaras isoladoras e, nos dois restantes, em galpões. Foram feitas avaliações da imunidade sistêmica, de órgãos linfoides secundários e do intestino delgado para determinar os efeitos imunomodulatórios da infecção e/ou do estresse por calor. Para caracterização dos efeitos neuroimunes, fizemos uma análise integrada dos achados imunes, de atividade do Sistema Nervoso Central e/ou de ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Foram utilizadas medidas quantitativas e semiquantitativas para avaliar os diferentes graus de lesão tecidual decorrentes do processo infeccioso e/ou parasitário com ou sem estresse por calor. Para analisar os efeitos do estresse no processo infeccioso/parasitário empregamos, também, cultivos microbiológicos e técnicas usadas para determinação da proliferação do C. perfringens e da Eimeria spp. Os resultados mostraram que o estresse por calor: reduziu a inflamação intestinal e o dano tecidual em modelo de NE empregando infecção isolada por C. perfringens preparada em caldo tioglicolato; reduziu a formação de centros germinais esplênicos e intestinais com consequente modulação da produção de imunoglobulinas séricas e secretórias; ativou núcleos do SNC relacionados á atividade do eixo HPA; ativou o eixo cérebro-intestinal; diminuiu a infecção intestinal por Eimeria spp., com consequente redução do desenvolvimento da NE e da lesão tecidual dela resultante; modulou a atividade de sistemas de neurotransmissão central relacionados com o comportamento das aves e ativação do eixo HPA; alterou o perfil neuroquímico cerebral quando em associação com a NE; facilitou o desenvolvimento da infecção por C. perfringens em animais não desafiados por fatores predisponentes da NE; reduziu a lesão tecidual no modelo de co-infecção por C. perfringens e Eimeria spp.; modulou o balanço de citocinas para um padrão Th2 no intestino dos animais infectados ou não; alterou as subpopulações de linfócitos esplênicos e circulantes, bem como a função proliferativa destas células e a resposta das mesmas à expressão de citocinas. Desta forma, concluímos que o estresse por calor e/ou inflamação intestinal de origem infecciosa ou química ativam o eixo HPA por mecanismo que envolve o eixo cérebro-intestinal, reduzindo os sinais clínicos da NE por interferir na patogênese do C. perfringens e da Eimeria spp / Diseases such as necrotic enteritis (NE) are coming back not only as a consequence of the intensive farming procedures now being used but also as a consequence of the restrictions imposed by the European Union countries to the use of antimicrobials as feed additives. NE is a disease that affects poultry production; its primary etiologic agent is Clostridium perfringens type A. Little is known about the mechanisms by which stress modulates the development of NE. Thus, to evaluate the effects of heat stress on NE development, sevenstudies were done using experimental models of NE that used C. perfringens infection per se or in combination with Eimeria spp. Heat stress was used throughout the experiments, being applied continuously or intermittently but always for long-term. Five experiments were performed using animals reared in isolator chambers and two others employing animals reared in sheds. Evaluations of systemic immunity, secondary lymphoid organs and small intestine portions were used to determine the immunomodulatory effects of the infections and/or of the heat stress. Neuroimmune effects were assessed using an integrative approach of the observed immune, Central Nervous System (CNS) and/or hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis changes. Quantitative and semi-quantitative techniques were utilized to measure and compare the different degrees of tissue damage resulting from the infectious processes in the presence and absence of heat stress. Microbiological techniques were also used to determine C. perfringens and Eimeria spp. proliferations. Results showed that heat stress: reduced intestinal inflammation and tissue damage in the NE model that used C. perfringens together with thioglycolate broth culture medium intake; reduced the formation of splenic and intestinal germinal centers with subsequent production of serum and secretory immunoglobulins; activated some brain areas related to animals behavior and HPA axis activity; modified the brain-gut axis relationship during NE development; reduced Eimeria spp. infection leading to a subsequent reduction in the NE development and in the scores of tissue injury; together with NE, modified neuronal brain-amine systems activity and, as a consequence, changed animals behavior, HPA axis activity and brain amine systems fuction within some brain areas; predisposed the birds to C. perfringens infection in the presence or absence of NE inducing factors; reduced the tissue damages observed in the course of C. perfringens and Eimeria spp.co-infection; modulated cytokines to a Th2 pattern in animals infected or not; altered the splenic and peripheral blood lymphocytes subpopulations and, changed the proliferative function of immune cells and cytokine expression.Thus, we conclude that the heat stress and/or intestinal inflammation of infectious or chemical origin activate the HPA axis by a mechanism involving the brain-gut axis, reducing the clinical signs of NE by interfering in the pathogenesis of C. perfringens and Eimeria spp

Doenças, como a enterite necrótica aviária (NE), têm se tornado reemergentes em função não apenas do sistema de criação intensivo de frangos de corte atualmente em uso, como também da restrição imposta ao uso dos aditivos antimicrobianos por diversos países, dentre os quais, aqueles da União Européia. A NE é uma doença que acomete aves de produção e seu agente etiológico primário é o Clostridium perfringens tipo A. Pouco se conhece a respeito dos mecanismos pelos quais o estresse modula o desenvolvimento da NE. O presente trabalho foi realizado para avaliar os efeitos do estresse por calor sobre o desenvolvimento da NE em frangos de corte. Empregou-se, para tal, modelos experimentais de NE em que se usou infecção isolada por C. perfringens e/ou em co-infecção com Eimeria spp. O estresse por calor foi aplicado de forma contínua ou intermitente em longo prazo. Foram propostos sete experimentos; em cinco deles os animais foram criados em câmaras isoladoras e, nos dois restantes, em galpões. Foram feitas avaliações da imunidade sistêmica, de órgãos linfoides secundários e do intestino delgado para determinar os efeitos imunomodulatórios da infecção e/ou do estresse por calor. Para caracterização dos efeitos neuroimunes, fizemos uma análise integrada dos achados imunes, de atividade do Sistema Nervoso Central e/ou de ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Foram utilizadas medidas quantitativas e semiquantitativas para avaliar os diferentes graus de lesão tecidual decorrentes do processo infeccioso e/ou parasitário com ou sem estresse por calor. Para analisar os efeitos do estresse no processo infeccioso/parasitário empregamos, também, cultivos microbiológicos e técnicas usadas para determinação da proliferação do C. perfringens e da Eimeria spp. Os resultados mostraram que o estresse por calor: reduziu a inflamação intestinal e o dano tecidual em modelo de NE empregando infecção isolada por C. perfringens preparada em caldo tioglicolato; reduziu a formação de centros germinais esplênicos e intestinais com consequente modulação da produção de imunoglobulinas séricas e secretórias; ativou núcleos do SNC relacionados á atividade do eixo HPA; ativou o eixo cérebro-intestinal; diminuiu a infecção intestinal por Eimeria spp., com consequente redução do desenvolvimento da NE e da lesão tecidual dela resultante; modulou a atividade de sistemas de neurotransmissão central relacionados com o comportamento das aves e ativação do eixo HPA; alterou o perfil neuroquímico cerebral quando em associação com a NE; facilitou o desenvolvimento da infecção por C. perfringens em animais não desafiados por fatores predisponentes da NE; reduziu a lesão tecidual no modelo de co-infecção por C. perfringens e Eimeria spp.; modulou o balanço de citocinas para um padrão Th2 no intestino dos animais infectados ou não; alterou as subpopulações de linfócitos esplênicos e circulantes, bem como a função proliferativa destas células e a resposta das mesmas à expressão de citocinas. Desta forma, concluímos que o estresse por calor e/ou inflamação intestinal de origem infecciosa ou química ativam o eixo HPA por mecanismo que envolve o eixo cérebro-intestinal, reduzindo os sinais clínicos da NE por interferir na patogênese do C. perfringens e da Eimeria spp / Diseases such as necrotic enteritis (NE) are coming back not only as a consequence of the intensive farming procedures now being used but also as a consequence of the restrictions imposed by the European Union countries to the use of antimicrobials as feed additives. NE is a disease that affects poultry production; its primary etiologic agent is Clostridium perfringens type A. Little is known about the mechanisms by which stress modulates the development of NE. Thus, to evaluate the effects of heat stress on NE development, sevenstudies were done using experimental models of NE that used C. perfringens infection per se or in combination with Eimeria spp. Heat stress was used throughout the experiments, being applied continuously or intermittently but always for long-term. Five experiments were performed using animals reared in isolator chambers and two others employing animals reared in sheds. Evaluations of systemic immunity, secondary lymphoid organs and small intestine portions were used to determine the immunomodulatory effects of the infections and/or of the heat stress. Neuroimmune effects were assessed using an integrative approach of the observed immune, Central Nervous System (CNS) and/or hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis changes. Quantitative and semi-quantitative techniques were utilized to measure and compare the different degrees of tissue damage resulting from the infectious processes in the presence and absence of heat stress. Microbiological techniques were also used to determine C. perfringens and Eimeria spp. proliferations. Results showed that heat stress: reduced intestinal inflammation and tissue damage in the NE model that used C. perfringens together with thioglycolate broth culture medium intake; reduced the formation of splenic and intestinal germinal centers with subsequent production of serum and secretory immunoglobulins; activated some brain areas related to animals behavior and HPA axis activity; modified the brain-gut axis relationship during NE development; reduced Eimeria spp. infection leading to a subsequent reduction in the NE development and in the scores of tissue injury; together with NE, modified neuronal brain-amine systems activity and, as a consequence, changed animals behavior, HPA axis activity and brain amine systems fuction within some brain areas; predisposed the birds to C. perfringens infection in the presence or absence of NE inducing factors; reduced the tissue damages observed in the course of C. perfringens and Eimeria spp.co-infection; modulated cytokines to a Th2 pattern in animals infected or not; altered the splenic and peripheral blood lymphocytes subpopulations and, changed the proliferative function of immune cells and cytokine expression.Thus, we conclude that the heat stress and/or intestinal inflammation of infectious or chemical origin activate the HPA axis by a mechanism involving the brain-gut axis, reducing the clinical signs of NE by interfering in the pathogenesis of C. perfringens and Eimeria spp

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Die nekrotische Enteritis (NE) und Kokzidiose des Huhnes sind häufige Darmerkrankungen weltweit und führen jedes Jahr zu hohen Wirtschaftsverlusten als Folge der Mortalität und Kosten für Behandlung und Bekämpfung. Die beiden Erkrankungen werden meistens bei Mastbroilern zwischen der 3. und 6. Lebenswoche festgestellt. Weil die leistungsfördernden Antibiotika im Geflügelfutter in der EU nicht mehr eingesetzt werden dürfen, ist das Risiko der NE in den letzten Jahren gestiegen. Fischmehl, Stress und Krankheiten sind prädisponierende Faktoren für die Entstehung der NE aber auch die Hühnerkokzidiose spielt in der Hinsicht eine wichtige Rolle. Die Mechanismen der Pathogenese bei der Wechselwirkung zwischen Kokzidiose und NE sind unklar. Bisher wurden verschiedene Infektionsmodelle zur Erforschung der NE unter Beteiligung von Ko-Infektionen zwischen Eimerien und C. perfringens eingesetzt. Dabei steht neben der Krankheitsentstehung auch die effiziente Bekämpfung dieser Erkrankung als großes Problem der Geflügelindustrie im Forschungsmittelpunkt. C. perfringens ist auch bei gesunden Tieren ein häufiger Darmbewohner, wobei bestimmte Stämme verschiedene Toxintypen wie Alpha-, TpeL- und Beta-Toxine produzieren können und damit ursächlich zur Entstehung der NE beitragen, aber ohne andere prädisponierende Auslöser kommt es in der Regel nicht zum Ausbruch. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei In-vivo-Modelle zur experimentellen Induktion der NE des Huhnes entwickelt. Ziele waren sowohl die genauere Untersuchung der Pathogenese der NE durch Ko-Infektionen mit Eimerien und Kokzidien als auch die Evaluierung von potentiellen neuartigen Bekämpfungsmöglichkeiten. Außerdem wurde ein In-ovo-Modell etabliert.

Clostridium perfringens causa enterite necrótica aviária devido à produção de toxinas que lesam o intestino. Neste estudo, de 94 amostras nove apresentaram C. perfringens, totalizando 22 isolados. Todos exceto um isolado, possuíram os genes nanI (95%) e/ou nanJ (81%), e 19/22, mostraram atividade neuraminidase em hemácias de frango. A atividade hemaglutinante foi observada em poucos isolados (26%). Todos os isolados foram plc positivos (toxina α), sendo classificados como tipo A. Sete isolados (31,8%) abrigaram o gene tpeL que codifica a toxina TpeL. Isolados tpeL+ mostraram efeito citotóxico característico da ação desta toxina. Alguns isolados mostraram capacidade de aderir e invadir células Vero. A maioria dos isolados foi resistente à sulfaquinoxalina (100%), cefalexina (95%) e eritromicina (95%) e sensíveis (100%) à cefoxitina, amoxicilina, enrofloxacina, amoxicilina-ácido clavulânico, penicilina-estreptomicina, cloranfenicol e metronidazol. Todos os isolados foram agrupados geneticamente em sete clusters, apresentando se como um grupo heterogêneo. / Clostridium perfringens cause avian necrotic enteritis due to production of toxins that damage the intestine. In this study, nine out of 94 samples had C. perfringens, totaling 22 isolates. All the isolates with exception of one, possessed the genes nanI (95 %) and/or nanJ (81 %), and 19/22 showed neuraminidase activity in chicken erythrocytes. The hemagglutinating activity was observed in a few isolates (26 %). All isolates were plc positive (toxin α) being classified as type A. Seven isolates (31.8%) harbored tpeL gene encoding the toxin TpeL. TpeL + isolates showed characteristic cytotoxic effect of the action of this toxin. Some isolates showed ability to adhere and invade Hep-2 cells. Most of the isolates were resistant sulphaquinoxaline (100%), cephalexin (95%) and erythromycin (95%) and sensitivity (100%) to cefoxitin, amoxicillin, enrofloxacin, amoxicillin - clavulanic acid, penicillin -streptomycin, chloramphenicol and metronidazole. All isolates were genetically grouped into seven clusters, presenting itself as a heterogeneous group.

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.