Made available in DSpace on 2018-08-01T23:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9883_020 - dissertação TAMARA versão final.pdf: 2105125 bytes, checksum: 50519568ec39d1cda73a314a2f0dfd25 (MD5) Previous issue date: 2016-05-11 / A planta Cannabis sativa, popularmente conhecida como maconha, contém compostos denominados canabinoides, sendo o 9-tetrahidrocanabinol (9- THC) o componente mais ativo. Após clonagem e caracterização dos receptores canabinoides, descobriu-se que os mesmos se ligam a 9-THC e também a ligantes endógenos, denominados endocanabinoides (ECs), capazes de modular vários sistemas neurotransmissores, emergindo como importantes reguladores de várias funções fisiológicas cerebrais. O efeito dos canabinoides endógenos e exógenos nos processos de aquisição, consolidação e recuperação da informação, tanto na aprendizagem como na memória, ainda é controverso. Além disso, existem evidências de que os processos de aquisição e consolidação possuem bases biológicas distintas com provável participação do sistema colinérgico hipocampal e cortical nessas diferenças. Com o objetivo de compreender as bases moleculares de processos cognitivos que envolvem a participação do sistema colinérgico central, pela ativação dos receptores canabinoides, propusemos a utilização de um agonista canabinoide, o WIN 55, 212-2 (WIN-2). Para isso, camundongos da linhagem Swiss foram tratados com WIN-2 na dose de 2mg/kg e submetidos a teste no labirinto aquático de Morris (MWM) para avaliar aspectos de aquisição e consolidação da tarefa. Observamos que o déficit cognitivo provocado pelo tratamento crônico com WIN-2 está relacionado, principalmente, à memória de curta duração no processo de aquisição da tarefa espacial, enquanto a consolidação permaneceu inalterada. Este prejuízo cognitivo na aquisição pode estar relacionado a um possível aumento da concentração de 2-AG (2-araquidonilglicerol) e diminuição de AEA (anandamida) no córtex pré-frontal, os quais estariam relacionados aos níveis de RNAm das enzimas de síntese e degradação dos endocanabinóides. Apesar das alterações comportamentais observadas neste trabalho serem sutis, verificamos modulação do sistema colinérgico pelo sistema endocanabinoide, uma vez que o tratamento com WIN-2 no período de consolidação da memória provocou uma diminuição na liberação basal de acetilcolina (ACh) no hipocampo. Entretanto, esta diminuição não foi associada com os déficits cognitivos observados. Portanto, o presente trabalho corrobora o envolvimento de ambos os sistemas estudados na modulação de processos cognitivos e assim esperamos, futuramente, auxiliar no desenvolvimento de tratamentos com abordagens farmacológicas e não-farmacológicas, que busquem atenuar os déficits cognitivos provocados pelo abuso de drogas, assim como por doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer.

Universidade do Estado do Rio de Janeiro / O etanol e a nicotina são as drogas mais comumente usadas no mundo. Como claramente indicado por estudos epidemiológicos, existe uma forte associação entre o tabagismo e o consumo de etanol principalmente durante o período da adolescência. Entretanto, existem poucos estudos em neurobiologia básica que avaliem o efeito da exposição combinada de nicotina e etanol durante o período da adolescência. Considerando que a nicotina é um agonista do receptor colinérgico nicotínico (nAChR) e que tem sido demonstrado que o etanol interage com os nAChRs, o presente trabalho tem como foco o estudo dos efeitos da exposição à nicotina e/ou ao etanol no sistema colinérgico durante a adolescência. Do 30 ao 45 dia pós-natal (PN) camundongos da cepa C57BL/6 foram expostos à nicotina (NIC) e/ou etanol (ETOH). Quatro grupos foram analisados: 1) exposição concomitante (NIC+ETOH) à solução de nicotina (50μg/ml) e etanol (25%, 2g/kg i.p. em dias alternados), 2) exposição a NIC, 3) exposição ao ETOH, 4) exposição ao veículo. Foram quantificadas a expressão/afinidade aos nAChRs (α4β2), a atividade da colina acetiltransferase (ChAT) e, a expressão/afinidade do [3H]hemicolinium-3 (HC-3) ao transportador de alta afinidade pré-sinaptico de colina, ao final da exposição (PN45), após curto (PN50) e longo período de retirada (PN75). Ao final da exposição, o grupo NIC+ETOH apresentou upregulation de nAChRs, refletindo simples somação dos efeitos da NIC e ETOH no córtex cerebral e sinergismo no mesencéfalo. A upregulation devido à exposição combinada foi mantida mesmo após alguns dias de retirada das drogas. Um mês após o término da exposição, os valores foram semelhantes aos obtidos para os animais veículo. Em PN45, machos NIC apresentaram aumento da ChAT no córtex cerebral, mas o ETOH foi capaz de reverter este efeito. Ao contrário, fêmeas NIC apresentaram diminuição da ChAT. No mesencéfalo, somente ETOH promoveu aumento da ChAT. Já em PN50, o grupo NIC apresentou aumento na ChAT que foi revertido na retirada combinada de NIC+ETOH. Em PN75, o grupo NIC+ETOH apresentou redução da ChAT. Em relação ao HC-3, não houve alterações ao final da exposição. ETOH e NIC+ETOH apresentaram redução da marcação alguns dias após a retirada das drogas, a qual persistiu até PN75. O presente trabalho fornece evidências experimentais que indicam que nicotina e etanol interagem durante a adolescência resultando em alterações nos sistema colinérgico durante a exposição e durante a retirada das drogas. / Nicotine and ethanol are the most commonly consumed drugs. As clearly indicated by epidemiological studies, there is a close interrelationship between smoking and alcohol consumption manly during adolescence period. However, there are few studies on the basic neurobiology of the effects of the combined nicotine and ethanol exposure in the adolescent brain. Since nicotine is a cholinergic agonist and it has been shown that ethanol interferes with nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), the current proposal will focus on the cholinergic effects of nicotine and/or ethanol treatment during adolescence. From the 30th to the 45th postnatal day (PN), C57BL/6 mice were exposed to nicotine free base (NIC) and/or ethanol (ETOH). Four groups were analyzed: 1) concomitant (NIC+ETOH) exposure of nicotine (50 μg/ml) and ethanol (25%, 2 g/kg i.p. every other day); 2) NIC exposure; 3) ETOH exposure; 4) vehicle. We assessed nAChR (α4β2) binding, choline acetyltransferase (ChAT) activity and [3H]hemicholinium-3 (HC-3) binding to the high affinity presynaptic choline transporter at the end of exposure period (PN45), at short (PN50) and long term (PN75) withdrawal. At the end of exposure period, NIC+ETOH elicited a pronounced upregulation which reflect simple additivity of the effects of nicotine and ethanol in the cerebral cortex and synergism in the midbrain. On PN45, male NIC mice presented an increase in ChAT in the cerebral cortex. However, ETOH reversed this effect. In contrast, female NIC mice presented decreased ChAT activity. In the midbrain, ETOH increased ChAT. On PN50, NIC mice presented an increase in ChAT activity that was reversed by ETOH withdrawal. In addition, NIC+ETOH long term withdrawal elicited a decrease in ChAT activity. Regarding HC-3, binding was not affected on PN45. ETOH and NIC+ETOH withdrawal promoted a decrease at short and long-term withdrawal. These results provide experimental evidences that nicotine and ethanol during adolescence interact resulting in cholinergic system alterations during exposure and withdrawal.

Universidade do Estado do Rio de Janeiro / O etanol e a nicotina são as drogas mais comumente usadas no mundo. Como claramente indicado por estudos epidemiológicos, existe uma forte associação entre o tabagismo e o consumo de etanol principalmente durante o período da adolescência. Entretanto, existem poucos estudos em neurobiologia básica que avaliem o efeito da exposição combinada de nicotina e etanol durante o período da adolescência. Considerando que a nicotina é um agonista do receptor colinérgico nicotínico (nAChR) e que tem sido demonstrado que o etanol interage com os nAChRs, o presente trabalho tem como foco o estudo dos efeitos da exposição à nicotina e/ou ao etanol no sistema colinérgico durante a adolescência. Do 30 ao 45 dia pós-natal (PN) camundongos da cepa C57BL/6 foram expostos à nicotina (NIC) e/ou etanol (ETOH). Quatro grupos foram analisados: 1) exposição concomitante (NIC+ETOH) à solução de nicotina (50μg/ml) e etanol (25%, 2g/kg i.p. em dias alternados), 2) exposição a NIC, 3) exposição ao ETOH, 4) exposição ao veículo. Foram quantificadas a expressão/afinidade aos nAChRs (α4β2), a atividade da colina acetiltransferase (ChAT) e, a expressão/afinidade do [3H]hemicolinium-3 (HC-3) ao transportador de alta afinidade pré-sinaptico de colina, ao final da exposição (PN45), após curto (PN50) e longo período de retirada (PN75). Ao final da exposição, o grupo NIC+ETOH apresentou upregulation de nAChRs, refletindo simples somação dos efeitos da NIC e ETOH no córtex cerebral e sinergismo no mesencéfalo. A upregulation devido à exposição combinada foi mantida mesmo após alguns dias de retirada das drogas. Um mês após o término da exposição, os valores foram semelhantes aos obtidos para os animais veículo. Em PN45, machos NIC apresentaram aumento da ChAT no córtex cerebral, mas o ETOH foi capaz de reverter este efeito. Ao contrário, fêmeas NIC apresentaram diminuição da ChAT. No mesencéfalo, somente ETOH promoveu aumento da ChAT. Já em PN50, o grupo NIC apresentou aumento na ChAT que foi revertido na retirada combinada de NIC+ETOH. Em PN75, o grupo NIC+ETOH apresentou redução da ChAT. Em relação ao HC-3, não houve alterações ao final da exposição. ETOH e NIC+ETOH apresentaram redução da marcação alguns dias após a retirada das drogas, a qual persistiu até PN75. O presente trabalho fornece evidências experimentais que indicam que nicotina e etanol interagem durante a adolescência resultando em alterações nos sistema colinérgico durante a exposição e durante a retirada das drogas. / Nicotine and ethanol are the most commonly consumed drugs. As clearly indicated by epidemiological studies, there is a close interrelationship between smoking and alcohol consumption manly during adolescence period. However, there are few studies on the basic neurobiology of the effects of the combined nicotine and ethanol exposure in the adolescent brain. Since nicotine is a cholinergic agonist and it has been shown that ethanol interferes with nicotinic acetylcholine receptors (nAChR), the current proposal will focus on the cholinergic effects of nicotine and/or ethanol treatment during adolescence. From the 30th to the 45th postnatal day (PN), C57BL/6 mice were exposed to nicotine free base (NIC) and/or ethanol (ETOH). Four groups were analyzed: 1) concomitant (NIC+ETOH) exposure of nicotine (50 μg/ml) and ethanol (25%, 2 g/kg i.p. every other day); 2) NIC exposure; 3) ETOH exposure; 4) vehicle. We assessed nAChR (α4β2) binding, choline acetyltransferase (ChAT) activity and [3H]hemicholinium-3 (HC-3) binding to the high affinity presynaptic choline transporter at the end of exposure period (PN45), at short (PN50) and long term (PN75) withdrawal. At the end of exposure period, NIC+ETOH elicited a pronounced upregulation which reflect simple additivity of the effects of nicotine and ethanol in the cerebral cortex and synergism in the midbrain. On PN45, male NIC mice presented an increase in ChAT in the cerebral cortex. However, ETOH reversed this effect. In contrast, female NIC mice presented decreased ChAT activity. In the midbrain, ETOH increased ChAT. On PN50, NIC mice presented an increase in ChAT activity that was reversed by ETOH withdrawal. In addition, NIC+ETOH long term withdrawal elicited a decrease in ChAT activity. Regarding HC-3, binding was not affected on PN45. ETOH and NIC+ETOH withdrawal promoted a decrease at short and long-term withdrawal. These results provide experimental evidences that nicotine and ethanol during adolescence interact resulting in cholinergic system alterations during exposure and withdrawal.

A farmacodependência é considerada uma doença crônica e sujeita à recaídas, na qual o indivíduo perde o controle sob a utilização de determinada droga de abuso. Conforme o usuário persiste com o uso da droga, ocorrem alterações anatômicas, fisiológicas e neuroquímicas no sistema nervoso central (SNC), as quais podem culminar no desenvolvimento de um comportamento compulsivo. A neurobiologia deste processo é complexa e envolve mecanismos de plasticidade em diferentes sistemas neurotransmissores. O principal deles é o sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, constituído por neurônios da área ventral do tegmento mesencefálico (VTA) que se projetam para o núcleo accumbens (NAc) e ao córtex pré-frontal (CPF), diretamente relacionado aos processos motivação e recompensa. Contudo, o mesmo não é suficiente para elucidar a complexidade da doença, o que levou ao entendimento da presença de outros sistemas neurotransmissores neste processo. Sabe-se que o sistema colinérgico muscarínico está diretamente envolvido em diferentes doenças neuropsiquiátricas, incluindo a farmacodependência. Além disso, os receptores colinérgicos muscarínicos (mAChRs) estão densamente presentes em regiões límbicas, onde acetilcolina e dopamina interagem por neuromodulação. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi investigar as possíveis alterações plásticas no sistema colinérgico muscarínico resultantes de tratamentos com cocaína que mimetizaram o consumo compulsivo humano. Para tanto, foram realizados ensaios comportamentais com camundongos Swiss machos adultos em campo aberto, tratados durante um (acute binge paradigm, 30 mg/kg) ou 14 dias (escalating dose binge paradigm, 15 - 30 mg/kg) com cocaína. Os animais receberam 3 injeções intraperitoneais (i.p.) de cocaína com intervalos de 60 minutos, durante os quais a atividade locomotora foi avaliada. Após a análise comportamental, os animais foram eutanasiados por decapitação para a remoção do encéfalo e dissecação do estriado, CPF e hipocampo, regiões cerebrais cruciais para o processo fisiopatológico da farmacodependência. Componentes do sistema dopaminérgico (receptores D1 e D2) e colinérgico muscarínico (M1-M5 mAChRs, ChAT, VAChT e AChE) foram avaliados por Immunoblotting. O sangue dos animais foi coletado para a realização das dosagens de cocaína e benzoeilecgonidina por UPLC-MS/MS. O desempenho locomotor total dos animais tratados com cocaína foi superior ao dos animais controle. O grupo tratado com escalonamento de dose desenvolveu sensibilização comportamental aos efeitos psicoestimulantes da cocaína no segundo dia de tratamento e, a partir dele, a atividade locomotora total manteve a mesma magnitude. Além disso, conforme o aumento da dose, os animais mantiveram um nível de atividade superior ao basal, mesmo após o término do experimento. As análises de Immunoblotting mostraram alterações dopaminérgicas e colinérgicas. No estriado observou-se redução da densidade de D2R após o tratamento de 14 dias e aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. Já no hipocampo observou-se redução de D1R e aumento de D2R, M1 e M5 mAChR após o tratamento crônico; e um aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. No CPF, foi evidenciada redução de M3 e de M5 mAChR após o tratamento cônico de 14 dias. Em relação às moléculas colinérgicas, observou-se, após o tratamento crônico, aumento da quantidade de ChAT em todas as estruturas estudadas. Além disso, VAChT mostrou-se aumentado no hipocampo após ambos os tratamentos. As dosagens plasmáticas revelaram a presença de 20,38 ± 3,4 ng/mL de cocaína e 224,6 ± 24,02 ng/mL de benzoilcgonina (BZE) nos animais do grupo agudo e, nos do grupo crônico, 62,26 ± 10,56 ng/mL e 375,1 ± 25,62 ng/mL de cocaína e BZE respectivamente. / Drug addiction is a chronic releapsing disorder characterized by the loss of control in limiting drug intake. As the drug use persists, anatomical, physiological and neurochemical changes occur in the central nervous system (CNS), which may lead to the development of compulsive behaviors. The neurobiology of this process is complex and involves mechanisms of plasticity in different neurotransmitter systems. The main one is the mesocorticolimbic dopaminergic system, composed by neurons from the ventral tegmental area (VTA) that projects to the nucleus accumbens (NAc), which is directly related to motivation and reward processes. However, just dopamine is not enough to elucidate the complexity of the disease, leading to the comprehension of another neurotransmitters system involved. It is known that the cholinergic system is involved in different neuropsychiatric disorders, including drug addiction. Furthermore, cholinergic muscarinic receptors (mAChRs) are densely present in limbic regions, where acetylcholine and dopamine interact by neuromodulation. Considering that, the aim of this study was to evaluate the existence of neuroadaptative changes in the cholinergic muscarinic system induced by cocaine in a compulsive-like behavior model in mice. Swiss-Webster adult male mice received 3 daily injections (i.p) of cocaine or saline, with a 60-min interval among them, either acutely (acute binge paradigm) or for 14 consecutive days (escalating dose binge paradigm). The locomotor activity was monitored in the open field during 60 min, in 5 min bins, after each injection. After behavioral analysis animals were euthanized by decapitation and the brain regions of striatum, hippocampus and prefrontal cortex, involved in the pathophysiology of addiction were dissected. Dopaminergic receptors (D1R and D2R), cholinergic muscarinic receptors (M1-M5 mAChRs), choline acetylytransferase (ChAT), acetylcholine vesicular transporter and acetylcholinesterase (AChE) were quantified by Immunoblotting. Blood samples were collected with heparin and plasma was separated and stored with 2% sodium fluorite at -80ºC for cocaine and benzoilecgonine quantification by UPLC-MS/MS. In the open field, animals treated with cocaine showed an increase in locomotor activity compared to control. Cocaine induced behavioral sensitization, in the escalating dose group on day 2, and after that the locomotor activity had the same magnitude until day 14th. These animals also kept the locomotor activity elevated even after the last injection. Immunobltting shows dopaminergic and cholinergic changes. An increase in M3 was observed in both hippocampus and striatum of animals acutely treated. After 14 days, there was an increase in M1, M5 and D2 and a decrease in D1 in hippocampus. There was also a decrease in D2 in the striatum; and finally, there was a decrease in M5 and M3 in the prefrontal cortex. ChAT densities were higher in all regions after the chronic treatment. Besides that, VAChT were higher in the hippocampus after both acute and chronic treatments. UPLC-MS/MS for cocaine and benzoilecgonine demonstrated the presence of 20,38 ± 3,4 ng/mL of cocaine and 224,6 ± 24,02 ng/mL of BZE in the acute binge group; and, 62,26 ± 10,56 ng/mL and 375,1 ± 25,62 ng/mL of cocaine and BZE, respectively in the escalating dose animals.

O sistema colinérgico está sabidamente envolvido com processos cognitivos. Em trabalho recente mostramos que a infusão do peptídeo A promoveu neurodegeneração e redução da memória de ratos. O treino semanal dos animais em equipamento de esquiva ativa recuperou o desempenho na tarefa e aumentou a densidade de receptores nicotínicos α7 em áreas relacionadas à memória. No presente trabalho, o antagonismo de α7 com metilicaconitina (MLA), em camundongos, promoveu perda cognitiva, porém a recuperação com o treino foi parcial. A infusão conjunta de βA e MLA causou perda da memória, mas essa não foi revertida com o treino semanal. Os animais com MLA apresentaram aumento da atividade da acetilcolinesterase (AChE) e aumento de BDNF, que poderia ser relacionado à resiliência a injúrias. Porém, animais com A e MLA apresentaram aumento da atividade da AChE e redução de BDNF, sugerindo perda dos mecanismos de neuroproteção deflagrados por α7. Com isso, sugere-se que α7 tenha um papel determinante na recuperação da memória e resiliência tecidual, frente à neurodegeneração. / Cholinergic system plays an important role in cognitive processes. In a recent work we showed that infusion of Aβ promoted neurodegeneration and reduction of memory of rats. Week training of animals in active avoidance shuttle box recovered their performance and increased the density of α7 nicotinic receptors in brain areas related to memory. In the present work, infusion of the α7 antagonist methyllycaconitine (MLA), in mice, caused cognitive impairment, but memory recover with week training was partial. Infusion of βA together with MLA promoted memory loss, but this was not recovered with the week training. MLA infused mice presented increase in acetylcholinesterase (AChE) activity and increase in BDNF, which could be related to resilience to tissue injuries. However, animals infused with βA and MLA showed increase in AChE activity and reduction of BDNF, suggesting loss of neuroprotection mechanisms triggered by α7. It is suggested that α7 has a determinant role in memory recover and brain resilience, in neurodegenerative processes.

A farmacodependência é considerada uma doença crônica e sujeita à recaídas, na qual o indivíduo perde o controle sob a utilização de determinada droga de abuso. Conforme o usuário persiste com o uso da droga, ocorrem alterações anatômicas, fisiológicas e neuroquímicas no sistema nervoso central (SNC), as quais podem culminar no desenvolvimento de um comportamento compulsivo. A neurobiologia deste processo é complexa e envolve mecanismos de plasticidade em diferentes sistemas neurotransmissores. O principal deles é o sistema mesocorticolímbico dopaminérgico, constituído por neurônios da área ventral do tegmento mesencefálico (VTA) que se projetam para o núcleo accumbens (NAc) e ao córtex pré-frontal (CPF), diretamente relacionado aos processos motivação e recompensa. Contudo, o mesmo não é suficiente para elucidar a complexidade da doença, o que levou ao entendimento da presença de outros sistemas neurotransmissores neste processo. Sabe-se que o sistema colinérgico muscarínico está diretamente envolvido em diferentes doenças neuropsiquiátricas, incluindo a farmacodependência. Além disso, os receptores colinérgicos muscarínicos (mAChRs) estão densamente presentes em regiões límbicas, onde acetilcolina e dopamina interagem por neuromodulação. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi investigar as possíveis alterações plásticas no sistema colinérgico muscarínico resultantes de tratamentos com cocaína que mimetizaram o consumo compulsivo humano. Para tanto, foram realizados ensaios comportamentais com camundongos Swiss machos adultos em campo aberto, tratados durante um (acute binge paradigm, 30 mg/kg) ou 14 dias (escalating dose binge paradigm, 15 - 30 mg/kg) com cocaína. Os animais receberam 3 injeções intraperitoneais (i.p.) de cocaína com intervalos de 60 minutos, durante os quais a atividade locomotora foi avaliada. Após a análise comportamental, os animais foram eutanasiados por decapitação para a remoção do encéfalo e dissecação do estriado, CPF e hipocampo, regiões cerebrais cruciais para o processo fisiopatológico da farmacodependência. Componentes do sistema dopaminérgico (receptores D1 e D2) e colinérgico muscarínico (M1-M5 mAChRs, ChAT, VAChT e AChE) foram avaliados por Immunoblotting. O sangue dos animais foi coletado para a realização das dosagens de cocaína e benzoeilecgonidina por UPLC-MS/MS. O desempenho locomotor total dos animais tratados com cocaína foi superior ao dos animais controle. O grupo tratado com escalonamento de dose desenvolveu sensibilização comportamental aos efeitos psicoestimulantes da cocaína no segundo dia de tratamento e, a partir dele, a atividade locomotora total manteve a mesma magnitude. Além disso, conforme o aumento da dose, os animais mantiveram um nível de atividade superior ao basal, mesmo após o término do experimento. As análises de Immunoblotting mostraram alterações dopaminérgicas e colinérgicas. No estriado observou-se redução da densidade de D2R após o tratamento de 14 dias e aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. Já no hipocampo observou-se redução de D1R e aumento de D2R, M1 e M5 mAChR após o tratamento crônico; e um aumento na densidade de M3 mAChR após o tratamento agudo. No CPF, foi evidenciada redução de M3 e de M5 mAChR após o tratamento cônico de 14 dias. Em relação às moléculas colinérgicas, observou-se, após o tratamento crônico, aumento da quantidade de ChAT em todas as estruturas estudadas. Além disso, VAChT mostrou-se aumentado no hipocampo após ambos os tratamentos. As dosagens plasmáticas revelaram a presença de 20,38 ± 3,4 ng/mL de cocaína e 224,6 ± 24,02 ng/mL de benzoilcgonina (BZE) nos animais do grupo agudo e, nos do grupo crônico, 62,26 ± 10,56 ng/mL e 375,1 ± 25,62 ng/mL de cocaína e BZE respectivamente. / Drug addiction is a chronic releapsing disorder characterized by the loss of control in limiting drug intake. As the drug use persists, anatomical, physiological and neurochemical changes occur in the central nervous system (CNS), which may lead to the development of compulsive behaviors. The neurobiology of this process is complex and involves mechanisms of plasticity in different neurotransmitter systems. The main one is the mesocorticolimbic dopaminergic system, composed by neurons from the ventral tegmental area (VTA) that projects to the nucleus accumbens (NAc), which is directly related to motivation and reward processes. However, just dopamine is not enough to elucidate the complexity of the disease, leading to the comprehension of another neurotransmitters system involved. It is known that the cholinergic system is involved in different neuropsychiatric disorders, including drug addiction. Furthermore, cholinergic muscarinic receptors (mAChRs) are densely present in limbic regions, where acetylcholine and dopamine interact by neuromodulation. Considering that, the aim of this study was to evaluate the existence of neuroadaptative changes in the cholinergic muscarinic system induced by cocaine in a compulsive-like behavior model in mice. Swiss-Webster adult male mice received 3 daily injections (i.p) of cocaine or saline, with a 60-min interval among them, either acutely (acute binge paradigm) or for 14 consecutive days (escalating dose binge paradigm). The locomotor activity was monitored in the open field during 60 min, in 5 min bins, after each injection. After behavioral analysis animals were euthanized by decapitation and the brain regions of striatum, hippocampus and prefrontal cortex, involved in the pathophysiology of addiction were dissected. Dopaminergic receptors (D1R and D2R), cholinergic muscarinic receptors (M1-M5 mAChRs), choline acetylytransferase (ChAT), acetylcholine vesicular transporter and acetylcholinesterase (AChE) were quantified by Immunoblotting. Blood samples were collected with heparin and plasma was separated and stored with 2% sodium fluorite at -80ºC for cocaine and benzoilecgonine quantification by UPLC-MS/MS. In the open field, animals treated with cocaine showed an increase in locomotor activity compared to control. Cocaine induced behavioral sensitization, in the escalating dose group on day 2, and after that the locomotor activity had the same magnitude until day 14th. These animals also kept the locomotor activity elevated even after the last injection. Immunobltting shows dopaminergic and cholinergic changes. An increase in M3 was observed in both hippocampus and striatum of animals acutely treated. After 14 days, there was an increase in M1, M5 and D2 and a decrease in D1 in hippocampus. There was also a decrease in D2 in the striatum; and finally, there was a decrease in M5 and M3 in the prefrontal cortex. ChAT densities were higher in all regions after the chronic treatment. Besides that, VAChT were higher in the hippocampus after both acute and chronic treatments. UPLC-MS/MS for cocaine and benzoilecgonine demonstrated the presence of 20,38 ± 3,4 ng/mL of cocaine and 224,6 ± 24,02 ng/mL of BZE in the acute binge group; and, 62,26 ± 10,56 ng/mL and 375,1 ± 25,62 ng/mL of cocaine and BZE, respectively in the escalating dose animals.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / O álcool é capaz de causar uma série de danos em tecidos e órgãos, destacando os seus efeitos nocivos ao cérebro ao modular uma série de mecanismos e vias, como alterações nos sistemas de neurotransmissão, ativação de vias pró-oxidantes e indução do sistema pró-inflamatório. Dentre os padrões de consumo de bebidas alcóolicas, um padrão se destaca, o binge alcóolico. Esse comportamento de consumo é caracterizado pela ingestão de altas doses de álcool em um único episódio, seguido de um período sem a ingestão de bebidas alcóolicas. Por ser um comportamento de consumo pouco estudado, a compressão dos efeitos do etanol sobre o cérebro nesse padrão de consumo é de grande importância. Neste contexto, o propósito do presente estudo foi avaliar os efeitos de um modelo que mimetiza o comportamento de consumo binge alcoólico (weekly-binge) sobre a sinalização colinérgica, resposta oxidativa e inflamatória em cérebro de peixe-zebra. Também avaliamos alterações comportamentais locomotoras e exploratórias nos animais submetidos ao mesmo modelo de exposição. O modelo consistiu em três exposições ao etanol (1,4%v/v) por 30 minutos. Os grupos foram divididos conforme o tempo de análise após a terceira e última exposição ao etanol, sendo eles: WB-I (analisado imediatamente após a última exposição), WB-2 (após 2 dias) e WB-9 (após 9 dias). Parte dos animais de cada grupo sofreu eutanásia e tiveram o cérebro total dissecado para as análises bioquímicas, sendo que o restante foi utilizado no teste comportamental. Para verificação de estresse oxidativo, foram avaliados os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), a oxidação de diclorofluoresceína (DCFH) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Parâmetros relacionados a eventos inflamatórios foram avaliados através da análise da expressão dos genes relacionados às citocinas IL-1β, IL-10 e TNF-α. Do sistema colinérgico, foram avaliadas as atividades das enzimas colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE). Na análise comportamental, utilizou-se o teste Novel tank. Ao analisar os parâmetros de estresse oxidativo foi verificado aumento nos níveis de TBA-RS e aumento da oxidação de DCFH apenas no grupo WB-I. Sobre as enzimas antioxidantes, alterações foram observadas nos grupos WB-2 e WB-9, caracterizado pela diminuição de CAT nesses grupos. O weekly-binge não foi capaz de promover alterações da expressão gênica para IL-1β, IL-10 e TNF-α. Sobre o sistema colinérgico, o modelo de exposição foi capaz de aumentar a atividade de ChAT no grupo WB-I enquanto no grupo WB-9 uma diminuição de atividade foi percebida. A atividade de AChE apresentou diminuição nos grupos WB-2 e WB-9. No teste comportamental Novel tank, o weekly-binge foi capaz de promover um efeito ansiolítico no grupo WB-I e WB-2 ao alterar o comportamento exploratório dos animais. Diante os resultados obtidos nos parâmetros do estresse oxidativo e sistema colinérgico, podemos sugerir que vias pró-oxidantes podem alterar a transmissão colinérgica, bem como a alteração comportamental pode ser uma resposta da alteração nesse sistema de neurotransmissão. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos patológicos envolvidos no consumo intermitente do etanol.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A esquizofrenia é um transtorno neuropsiquiátrico grave, cuja fisiopatologia é pouco conhecida. O tabagismo pré-natal vem sendo estudado como fator causador de anormalidades obstétricas, induzindo alterações comportamentais e neuroquímicas associadas à esquizofrenia. O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade locomotora, interação social, memória através do teste de esquiva inibitória, função sensório-motora através do teste de inibição por pré-pulso do reflexo do sobressalto (Bencherif et al.) e a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) em ratos Wistar adultos que foram expostos à fumaça de cigarro durante o gestação. Fêmeas gestantes foram separadas em dois grupos: mães controle (MC) e mães expostas (ME). As fêmeas do grupo ME foram expostas à fumaça de cigarro 3 vezes ao dia, 4 cigarros por vez, totalizando 12 cigarros ao dia, durante o período gestacional (21 dias). Na fase adulta, os filhotes foram divididos em quatro grupos: Filhote Controle+Salina (FC-sal), Filhote Controle+Cetamina (FC-cet), Filhote Exposto+Salina (FE-sal) e Filhote Exposto+Cetamina (FE-cet) e submetidos a uma administração intraperitoneal de salina ou cetamina (25 mg/kg) por sete dias (tratamento repetido). Após a realização deste protocolo, os animais foram submetidos aos testes comportamentais. Em seguida, foram mortos por decapitação e suas estruturas cerebrais (córtex pré-frontal, hipocampo e estriado) foram retiradas e utilizadas para a análise neuroquímica. Os resultados mostraram um aumento da atividade locomotora tanto no grupo FC-cet como no grupo FE-cet, ambos em comparação com o grupo FC-sal. Além disso, o grupo FE-cet também mostrou hiperlocomoção quando comparado ao grupo FE-sal. No teste de interação social, o grupo FC-cet apresentou aumento da latência quando comparado ao grupo FC-sal. Em contrapartida, o grupo FE-cet pareceu minimizar, pelo menos em parte, o déficit social gerado pela cetamina. No teste de esquiva inibitória, os animais foram avaliados em diferentes tipos de memória: memória de trabalho, memória de curta e de longa duração. Os animais do grupo FC-cet apresentaram déficit na memória de trabalho quando comparados ao treino do mesmo grupo e também na memória de longa duração quando comparados ao mesmo tipo de memória do grupo FC-sal. Já os grupos FE-sal e FE-cet, ambos apresentaram prejuízo cognitivo nos três tipos de memória, além de déficit na memória de trabalho quando comparados ao treino de cada grupo. No teste de IPP, os animais do grupo FC-cet, bem como o grupo FE-cet mostraram prejuízo na IPP nas 3 intensidades de pré-pulso (PP) (70dB, 75dB e 80dB), quando comparados ao grupo FC-sal. Porém, é importante ressaltar que em 75dB o grupo FE-cet pareceu minimizar os efeitos prejudiciais ao sistema sensório-motor gerados pela cetamina. Adicionalmente, um aumento da atividade da AChE também foi observado nas 3 estruturas analisadas no grupo FC-cet. Por outro lado, o grupo FE-cet demonstrou exacerbar o efeito gerado pela cetamina em todas as estruturas. Este estudo indica que a exposição pré-natal ao cigarro afeta o comportamento e o sistema colinérgico em estruturas cerebrais da prole adulta submetida ao modelo de esquizofrenia induzido por cetamina. Esses dados apontam para a importância do período pré-natal na patogênese da esquizofrenia.

O sistema colinérgico está sabidamente envolvido com processos cognitivos. Em trabalho recente mostramos que a infusão do peptídeo A promoveu neurodegeneração e redução da memória de ratos. O treino semanal dos animais em equipamento de esquiva ativa recuperou o desempenho na tarefa e aumentou a densidade de receptores nicotínicos α7 em áreas relacionadas à memória. No presente trabalho, o antagonismo de α7 com metilicaconitina (MLA), em camundongos, promoveu perda cognitiva, porém a recuperação com o treino foi parcial. A infusão conjunta de βA e MLA causou perda da memória, mas essa não foi revertida com o treino semanal. Os animais com MLA apresentaram aumento da atividade da acetilcolinesterase (AChE) e aumento de BDNF, que poderia ser relacionado à resiliência a injúrias. Porém, animais com A e MLA apresentaram aumento da atividade da AChE e redução de BDNF, sugerindo perda dos mecanismos de neuroproteção deflagrados por α7. Com isso, sugere-se que α7 tenha um papel determinante na recuperação da memória e resiliência tecidual, frente à neurodegeneração. / Cholinergic system plays an important role in cognitive processes. In a recent work we showed that infusion of Aβ promoted neurodegeneration and reduction of memory of rats. Week training of animals in active avoidance shuttle box recovered their performance and increased the density of α7 nicotinic receptors in brain areas related to memory. In the present work, infusion of the α7 antagonist methyllycaconitine (MLA), in mice, caused cognitive impairment, but memory recover with week training was partial. Infusion of βA together with MLA promoted memory loss, but this was not recovered with the week training. MLA infused mice presented increase in acetylcholinesterase (AChE) activity and increase in BDNF, which could be related to resilience to tissue injuries. However, animals infused with βA and MLA showed increase in AChE activity and reduction of BDNF, suggesting loss of neuroprotection mechanisms triggered by α7. It is suggested that α7 has a determinant role in memory recover and brain resilience, in neurodegenerative processes.

O processo de secreção salivar é dependente de energia, consome glicose e pode mobilizar glicogênio na glândula submandibular. Nos ratos diabéticos a produção de saliva estimulada é reduzida e ocorre acúmulo de glicogênio nas glândulas parótida e submandibular. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vivo o metabolismo de glicogênio das glândulas salivares, submandibular e parótida, de ratos diabéticos após o estimulo com agonistas colinérgico e adrenérgico e também analisar se os animais alimentados ou com restrição alimentar overnight apresentam diferenças no metabolismo de glicogênio das glândulas salivares nas condições estudadas. Os ratos foram divididos em grupos controles (C) e diabéticos (D). Após 30 dias da indução do diabete com estreptozotocina i.p. 60mg/kg p.c., os animais foram subdivididos em alimentados ou em jejum, anestesiados com pentobarbital 50mg/kg p.c. e hidrato de cloral 400mg/kg p.c, administrado i.p. 7,5 mg/kg p.c de pilocarpina ou 5 mg/kg p.c. de isoproterenol, os ratos foram eutanasiados 0(T0), 30(T30), 60(T60) and 120(T120) minutos após a injeção do agonista. As glândulas SM e P foram removidas e analisadas quanto ao conteúdo de proteína total, glicogênio, atividade da glicogênio sintase (GS) e da glicogênio fosforilase (GP), ativa (a) e total (t). Os dados foram analisados estatisticamente pelo ANOVA e o teste de Tukey (p>0,05). A concentração de proteína total não foi afetada pela doença diabetes, nem pela administração dos agonistas, mas apresentou-se maior nos grupos em jejum quando comparados aos grupos alimentados. A concentração de glicogênio inicial foi maior nos ratos diabéticos quando comparados ao controles nas glândulas SM e P. O estímulo com a pilocarpina e com o isoproterenol na SM dos ratos alimentados e em jejum promoveu a degradação do glicogênio observada em T30 e posterior recuperação do conteúdo até o T120 nos grupos controles e diabéticos. Na P os agonistas não mobilizaram o glicogênio no grupo controle e sim no grupo diabético. As enzimas GP e GS tiveram a atividade alterada pelos agonistas e pela doença diabetes, porém não apresentaram um padrão nas condições estudadas. Os animais em jejum apresentaram menor conteúdo de glicogênio que os diabéticos nas glândulas SM e parótida e as enzimas GS apresentou um aumento na relação da forma ativa e total nos grupos em jejum e a GP apresentou menores valores que foi mais evidente na glândula SM. A injeção dos sialogogos apresentou efeitos diferentes no metabolismo de glicogênio das glândulas P e SM, assim como nos animais diabéticos / The salivary secretion process is energydependent, consumes glucose and might mobilize glycogen in the submandibular glands. In diabetics rats the stimulated saliva flow rate is reduced and accumulate glycogen in submandibular (SM) and parotid (P). The aim of this work was evaluated in vivo glycogen metabolism in the SM and P of diabetic rats stimulated with adrenergic or cholinergic agonists, and to analyze if there are any differences in the glycogen metabolism in fed or unfed (alimentary fasting overnight) animals.The rats were divided in control (C) and diabetic (D) groups. Thirty days after diabetes induction with streptozotocin (60mg/kg b.w. i.p.), the animals were subdivided in fed or unfed, anaesthetized with pentobarbital (50mg/kg b.w. i.p.). and chloral hydrate (400mg/kg b.w. i.p.), injected pilocarpine (7.5mg/kg b.w.) or isoproterenol (5mg/kg b.w.) intraperitoneally, and euthanized 0(T0), 30(T30), 60(T60) and 120(T120) minutes post-injection of the agonists. SM and P were excised and assessed for glycogen and protein content and glycogen synthase (GS) and phosphorylase (GP) active (a) and total (t) activities. Data was statistically analyzed by ANOVA and Tukeys test (p<0.05). Protein concentration didn´t alter by diabetes or agonist injections but was higher in unfed when compared to the fed rats. Increased initial glycogen content was found in both groups of glands in diabetic rats when compared to the control group. Pilocarpine and isoproterenol stimulus promoted glycogen degradation in SM of fed and unfed rats on T30 and the T120 SM control and diabetic groups recovered glycogen content as the initial T0 values. In P the agonist mobilized glycogen just in diabetic group. The GP and GS activities were different and didnt present a pattern in this study´s condition. The unfed animals present glycogen content diminished when compared to fed animal in both glands and the relation of active and total glycogen synthase was higher in fast animals and lesser specific activities of active and total glycogen phosphorilase that were more evident in submandibular glands. The secretagogues injection presents different effects on glycogen metabolism of P and SM even so in diabetic animals.