Le besoin clinique de nouvelles technologies pour favoriser la régénération des tissus et des organes lésés ou malades a permis l'émergence de l'ingénierie tissulaire. Ce concept s'est révélé être une stratégie prometteuse afin de fournir une alternative aux maladies vasculaires dans un futur plus ou moins proche. Les modèles issus du génie tissulaire vasculaire ont également le potentiel d'être utilisés comme des modèles in vitro de tissus pour l'étude des processus physiopathologiques ainsi que pour des essais précliniques de médicaments et de différents dispositifs médicaux. De nombreuses approches existent dans ce domaine ayant chacune ses avantages et inconvénients, mais aucune n'a encore eu un réel succès. Dans ce contexte, le projet de cette thèse a été de concevoir, développer et valider un modèle de la paroi vasculaire en mimant la structure d'une artère naturelle. Brièvement, une artère est composée de trois couches composées chacune d'un type cellulaire différent qui lui confèrent des propriétés et des fonctions propres à chaque type de cellules. Celles-ci sont enchevêtrées dans une matrice extracellulaire majoritairement composée de collagène. En se basant sur les travaux précédents du Laboratoire de Biomatériaux et Bioingénierie de l'Université Laval, le gel de collagène de type I a été utilisé comme matrice tridimensionnelle grâce à son fort potentiel pour supporter et guider les cellules vasculaires dans le processus de régénération du tissu in vitro. L’objectif a été le développement d'un modèle de tri-culture avec un échafaudage à base de collagène pour imiter intimement l'organisation cellulaire en tri-couches des artères natives. Dans un premier temps, un modèle plat a été élaboré et caractérisé. Puis dans un deuxième temps, une nouvelle méthode pour créer des tubes cellularisés de collagène a été mise au point. Et enfin, dans un troisième temps, le développement d'un protocole pour la création d'une tri-culture tubulaire soutenue par une matrice de collagène a été conçu et validé. / The tremendous clinical need for the development of technologies to facilitate the regeneration of injured or diseased tissues and organs allowed the openning of tissue engineering field. The concept of vascular tissue engineering has emerged as a promising strategy in order to provide an alternative to animal models of vascular diseases. Engineered arterial models have the potential to be used instantly as an in vitro models of vascular tissue for the investigation of patho/physiological processes and as preclinical tests for drugs and devices. Many approaches exist in this area, each with its advantages and disadvantages but none of the approaches yet had a real success. With this in mind, the objective of this thesis was to design, develop and validate an easy and fast-to-prepare vascular wall model mimicking the natural artery structure. Briefly, an artery is composed of three layers, consisting of different cell types that confer each layer with certain properties and functions. These cells are embedded in extracellular matrix mainly composed of collagen. Based on the previous work of the Laboratory for Biomaterials and Bioengineering of Laval University, type I collagen gel was used as a three dimensional matrix; thanks to its strong potential to support and guide the vascular cells in the process of tissue regeneration in vitro. The objective was therefore to develop a tri-culture model based on collagen scaffold to closely mimic the cellular organization in tri-layers of native arteries. First, a flat model was developed and characterized. Then secondly, a new method for creating cellularized collagen tubes was developed. And finally, the development of a protocol for the establishment of a tubular tri-culture supported by a collagen matrix was designed and valided.

Ce projet de recherche porte sur la reconstruction du ligament croisé antérieur du genou (LCA) par génie tissulaire. Fréquente chez les sportifs et les personnes actives, la rupture du LCA compromet la stabilité fonctionnelle du genou. Notre équipe de recherche a développé un ligament reconstruit par génie tissulaire qui pourrait éventuellement servir d’option de remplacement, suite à une rupture du LCA. Notre modèle expérimental étant la chèvre, les expériences de greffe sur des périodes variant entre 1 et 13 mois, ont démontré une revascularisation, une innervation, un renouvellement de la matrice, la formation de cartilage structuré aux insertions osseuses, ainsi qu’un gain de force et de rigidité. Dans le but d’optimiser la procédure de production et d’implantation en prévision d’éventuels essais cliniques, des tests ont été effectués in vitro pour préparer une prochaine série de greffes d’un substitut du LCA de 2e génération. Ce nouveau substitut ligamentaire n’est pas ancré par des blocs osseux, alors sa fixation à l’articulation du genou sera effectuée en utilisant des endoboutons, une pratique devenue courante en chirurgie de reconstruction du LCA (Chapitre 1). L’adaptation de la technologie aux méthodes d’implantation privilégiées en clinique constitue une étape essentielle pour évaluer son potentiel chez l’humain. La conception et la production de substituts du LCA par génie tissulaire présentent un potentiel très intéressant et prometteur au plan clinique.

Plusieurs facteurs peuvent limiter la capacité, ou le désir, d’un individu d’effectuer un exercice physique. Entre autres, la perception de la difficulté de l’effort et une faible résistance à la fatigue peuvent limiter la performance tant chez des athlètes d'élite que des individus sédentaires. Les athlètes, les entraîneurs, les médecins et autres intervenants sont donc continuellement à la recherche d’interventions pouvant améliorer la capacité à l’effort et la résistance à la fatigue neuromusculaire. De nombreux travaux démontrent que l'augmentation de l'apport en substrat énergétique au niveau du muscle actif et des niveaux de la machinerie métabolique, soit des activités à la hausse d’enzymes clés impliquées dans le métabolisme énergétique, pourraient réduire les effets néfastes d'une activité physique inhabituelle, améliorant ainsi la tolérance à l'exercice et la performance globale. Cette performance est souvent évaluée au moyen de la puissance aérobie maximale (PAM), soit la quantité de travail produit au niveau du muscle squelettique dans les conditions de consommation maximale d’oxygène au niveau de l’organisme dans son ensemble. La résistance à la fatigue est, de son côté, souvent évaluée par la durée ou le travail total qui peut être fournit dans un effort d’intensité dans le temps. Outre l’entraînement, l’apport nutritionnel, incluant l’utilisation de compléments nutritionnels, peut également améliorer la résistance à la fatigue et la PAM globale en modifiant, entre autres, le potentiel métabolique des muscles squelettiques. Le complément alimentaire Blue Calorad® (BC) est un breuvage contenant du collagène de milieu marin hydrolysé, de l'extrait de myrtille et des polyphénols combinés dans une formule brevetée. Il a été rapporté que ce médicament réduit le stress induit par l'exercice, améliore l'endurance et la récupération grâce à des effets antifatigue. Ces allégations proviennent cependant des rapports anecdotiques des consommateurs. Par conséquent, une évaluation objective des effets et des mécanismes potentiels sous-jacents de ces effets s’impose. Il est plausible que le Blue Calorad® ait des effets sur la performance car, individuellement, les ingrédients du produit, dont les bleuets, le collagène et les polyphénols, amélioreraient la santé et la capacité d'exercice chez des modèles humains et animaux en bonne santé. Les adaptations physiologiques aiguës et chroniques induites par ces éléments modulent certains mécanismes qui se révèlent limitants pour la performance. L'étude présentée dans l’article de ce mémoire a examiné l’hypothèse selon laquelle le Blue Calorad® agit de la sorte. Nos résultats démontrent que la consommation ad libitum de Blue Calorad®, pendant une durée de 5 semaines chez des rattes non entraînées, permet d’augmenter leur performance sur tapis roulant en ralentissant l’apparition de la fatigue. Cette amélioration de la performance n’a pas été accompagnée iv de changements significatifs des paramètres physiologiques choisis, soient la composition corporelle, certaines variables plasmatiques, le glycogène musculaire et plusieurs éléments de la machinerie musculaire squelettique des métabolismes anaérobie et aérobie. Ces résultats appuient les rapports anecdotiques des consommateurs du produit et suggèrent que le Blue Calorad® pourrait produire un effet ergogénique chez l’humain, bien que les mécanismes de son action demeurent inconnus. / Maximal aerobic power (MAP), the ability of the muscles to use oxygen received from the heart and the lungs to produce energy, is an important determinant of performance among both athletes at the elite level and sedentary individuals seeking to partake structured physical activity. Athletes, coaches, physicians and others use varied interventions to enhance performance, with the goal of delaying the onset of fatigue. Many authors have suggested that increasing energy supply and upregulating activities of key enzymes involved in the skeletal muscle metabolism could mitigate the deleterious impact of unaccustomed physical activity thereby improving exercise and overall performance. Aside from physical training, a well-structured and balanced nutrition plan may also enhance exercise tolerance and overall MAP by altering anaerobic and aerobic skeletal muscle metabolic potential. Blue Calorad® (BC), is a liquid dietary supplement containing marine hydrolyzed collagen, blueberry extract, and polyphenols combined in a proprietary formula, which has been reported to reduce exercise-induced stress and enhance endurance and recovery via its potential anti-fatigue effects. Claims surrounding this product are based solely on anecdotal evidence provided by consumers and therefore, potential mechanisms behind its effects have yet to be discovered. BC has yet to be tested in humans. However, blueberries, collagen and polyphenols have been reported to enhance health and exercise capacity in both healthy human and animal models. The acute and chronic physiological adaptations induced by these elements mimic some of the mechanisms that prove to be limiting to overall physical performance and when enhanced these could thereby potentiate the effects of an increased performance. The study presented later in this paper examined this hypothesis. Our results suggest that ad libitum consumption of BC over a 5-week period in sedentary female rats increases performance during two MAP tests. Although the BC supplementation did not clearly enhance the chosen physiological parameters such as body composition, plasma variables, muscle glycogen and ultimately anaerobic and aerobic mechanisms related to skeletal muscle metabolic potential, the increased performance responses could prove beneficial to sedentary individuals or those seeking to newly partake in a physical activity regime.

Dans les tissus périphériques, les lymphocytes T interagissent, grâce aux intégrines de la famille βi, avec les constituants de la matrice extracellulaire dont la plus abondante est le collagène. Cependant, la régulation des fonctions effectrices des lymphocytes T par ces intégrines reste peu connue. Les intégrines liant le collagène peuvent être des régulateurs importants pour la survie et pour les fonctions ostéoclastogéniques des lymphocytes T menant à la dégradation osseuse associée à l'arthrite rhumatoïde. Nos travaux ont démontré que l'interaction des lymphocytes T leucémiques avec le collagène de type I (Coll I) via l'intégrine a2β1 inhibe l'apoptose de ces cellules induite par la doxorubicine : une drogue utilisée en chimiothérapie. Nous avons montré que le Coli I protège les lymphocytes T leucémiques des effets cytotoxiques dé la doxorubicine en inhibant l'expression de RANKL. Ces résultats suggèrent fortement que l'intégrine a2β1 peut contribuer à la résistance des lymphocytes T leucémiques face aux traitements chimiothérapeutiques. Nous avons également montré que cette intégrine inhibe l'expression de RANKL et augmente celle de l'IFNγ par les lymphocytes T effecteurs activés par le TCR. Puisque RANKL est une cytokine importante pour le développement des ostéoclastes qui sont impliquées dans la dégradation osseuse inflammatoire et que l'IFNγ inhibe l'effet de RANKL, nos résultats suggèrent que l'intégrine a2β1 pourrait protéger les tissus osseux de la dégradation osseuse et pourrait représenter un mécanisme homéostatique. Par contre, nous avons montré que l'activation de l'intégrine alpl par le Coli IV augmente la production de RANKL sans affecter celle de l'lFNγ par les lymphocytes T effecteurs. De plus, le Coli IV synergise avec l'IL-7 pour augmenter la production de RANKL par ces cellules. Ainsi, les lymphocytes T activés par le Coli IV et l'IL-7 ont la capacité d'induire le développement des ostéoclastes à partir de monocytes et leurs effets sont également additifs. Le Coli IV augmente également la capacité de l'IL-7 à protéger les lymphocytes T contre l'apoptose induite par la privation en IL-2. Ces résultats montrent que l'intégrine aipi peut contribuer à la pathogénécité des lymphocytes T arthritiques en augmentant

Au cours des trente dernières années, l’ingénierie du tissu vasculaire a connu un essor considérable dû à un besoin clinique important de greffons vasculaires adéquats pour le remplacement d’artères de faible diamètre. En effet, les greffes autologues ou synthétiques actuels de faible diamètre s’accompagnent souvent d’une défaillance à l’intérieur de 5 à 10 ans. Malgré les efforts injectés dans les dernières années, la translation vers la clinique d’artères régénérées ne connait pas les résultats escomptés. L’un des défis majeur dans l’ingénierie tissulaire est le contrôle des fonctions cellulaires qui dicte la maturation des constructions. De nombreuses études ont été menées sur la réponse des cellules musculaires lisses (abréviation en anglais : SMC désignant «smooth muscle cell») en 2D sous contrainte cyclique, mais peu ont examiné l'effet de la contrainte cyclique sur les SMC en 3D afin d'optimiser les stratégies de contrôle de bioréacteurs pour la maturation et régénération des tissus. Ainsi, ce projet de recherche vise à faire l’étude des effets de stimuli mécaniques cycliques sur des échafaudages cellularisés de collagène. Le collagène a été utilisé comme échafaudage dû à ses excellentes propriétés biologiques et aussi car il est présent dans la paroi des artères physiologiques. Un système permettant d’imposer des stimuli mécaniques cycliques en 2D aux constructions 3D de collagène cellularisées a donc été développé. Les contraintes cycliques ont révélé une orientation préférentielle des cellules dans le sens de la contrainte, ainsi qu’une orientation des fibrilles de collagène dans ce même sens par les cellules. De plus, le remodelage effectué par les cellules a permis d’augmenter les propriétés viscoélastiques de la construction et d’obtenir un comportement mécanique à la relaxation de contrainte semblable aux veines saphènes. Les cellules ont également démontré une désensibilisation face aux contraintes cycliques. Cette recherche a ainsi permis de répondre à certaines questions reliées aux comportements cellulaires dans un environnement 3D sous condition de stimulation mécanique. L’approfondissement des connaissances des comportements cellulaires en environnement 3D sous contrainte cyclique demeurent un défi clé dans l’obtention d’artères régénérées ayant des propriétés physiologiques similaires à celles d’artères natives. / In the last thirty years, vascular tissue engineering has emerged as an important field in tissue engineering due to a significant clinical need for adequate vascular graft for replacement of small diameter artery. Indeed, the current autologous or synthetic grafts of small diameter present a high failure rate within 5 to 10 years. Despite the efforts injected in the recent years, the clinical translation of engineered artery constructs is far from being successful. One of the challenges encountered in tissue engineering is the control of cellular functions that dictates the maturation of tissue engineering constructs. Furthermore, numerous studies have been conducted on the response of smooth muscle cells (SMC) in 2D under cyclic strain, but a few have examined the effect of cyclic strain on SMCs in 3D to optimize the control strategies of bioreactors for tissue maturation and generation. Thus, this research project aims to study the effects of cyclic mechanical stimuli on cellularised collagen scaffolds. Collagen has been used as a scaffold due to its excellent biological properties and since it is found in the wall of physiological arteries. A system for imposing cyclic mechanical stimuli in 2D to 3D cellularised collagen constructs was therefore developed. The cyclic stresses revealed a preferential orientation of the cells in the direction of the strain, as well as an orientation by the cells of the collagen fibrils in the same direction. Moreover, the remodeling performed by the cells led to an improvement of the viscoelastic properties of the construct and to a mechanical behavior similar to the saphenous vein under stress-relaxation. The cells also shown a desensitization to cyclic mechanical stimuli. Thus, this research allowed to answer some of the questions related to cellular behavior in a 3D environment under mechanical stimulation. Deepening our knowledge of cell behavior in 3D environment under cyclic mechanical stimuli remains a key challenge in obtaining regenerated artery with similar physiological properties than native arteries.

Le besoin de substituts pour vaisseaux sanguins de petit calibre a attiré une attention considérable sur le développement de constructions artérielles dans des bioréacteurs à partir de systèmes d’échafaudage. Les gels formés à partir de collagène reconstitué représentent des substrats idéaux pour le remodelage du à l’activité cellulaire, mais leur faible résistance et élasticité limitent leur utilisation comme échafaudages pour la régénération du tissu vasculaire. Ces caractéristiques proviennent de la perte d’organisation structurelle liée au processus d’extraction du collagène. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet était d’améliorer les propriétés mécaniques des gels de collagène afin de supporter la croissance et la maturation du tissu vasculaire sous contrainte cyclique. En considérant l’importance de l’état d’agrégation du collagène pour les propriétés mécaniques des tissus natifs, la stratégie de ce projet a été de modifier la microstructure des matrices de collagène reconstitué en agissant sur trois aspects : 1) les interactions intermoléculaires et la fibrillogenèse ont été ajustées en variant les paramètres expérimentaux (pH, température, force ionique et concentration du collagène); 2) des liaisons covalentes ont été introduites afin de fixer des fibrilles voisines; 3) les gels ont été compactés et les fibrilles alignées grâce à l’action de remodelage des cellules. Des mesures de spectrophotométrie et des images par MEB ont confirmé les effets des conditions expérimentales et du remodelage sur la microstructure des gels. Notamment, la présence des cellules a permis la formation de matrices plus compactes et orientées, surtout en présence de contraintes mécaniques. Des essais mécaniques ont démontré que les stratégies adoptées ont engendré le renforcement de la structure. En particulier, des essais cycliques ont établi que la variation des conditions expérimentales combinée à la réticulation ont produit des matrices dont l’hystérèse diminue et l’élasticité augmente. En conclusion, l’ensemble de ces études a permis la réalisation à court terme (24-48 h) de structures à base de collagène présentant une résistance mécanique, une rigidité et une élasticité accrues. Ces résultats suggèrent que ces matrices sont de bons candidats comme supports pour la régénération de tissus vasculaires sous conditionnement cyclique. / The need for small-caliber vascular replacements has attracted considerable attention on the development of scaffold-based vascular constructs in bioreactors. Reconstituted collagen gels represent ideal substrates for cell-mediated remodeling, but their low strength and low elasticity, limits their application as scaffold for the regeneration of the vascular tissue. These features result from collagen extraction and the consequent loss of structural organization. The objective of this project was to improve the mechanical performances of collagen gels in order to support the growth and the maturation of the vascular tissue under cyclic conditioning. Considering how fundamental collagen assembly is for the mechanical behavior of native tissues, the microstructure of reconstituted collagen lattices was modified by working on three aspects: 1) The intermolecular interactions and the aggregation of collagen monomers were tailored by modulating the experimental conditions, including pH, temperature, ionic strength and collagen concentration; 2) Inter-fibril crosslinking was carried out in order to fix neighboring collagen fibrils through their reactive side chains; 3) Gels were compacted and fibrils were aligned through cell-mediated remodeling. Spectrophotometric analyses and SEM confirmed the effects of changes in experimental conditions and cell-mediated remodeling on collagen gels microstructure. Notably, the presence of SMCs lead to tighter and highly oriented lattices, moreover in the presence of mechanical constraints. Mechanical tests showed that the adopted procedures contributed to the stiffening of collagen lattices. In particular, the modulation of the experimental conditions combined with crosslinking lead to lattices presenting lower hysteresis and higher elasticity as shown by cyclic tests. In conclusion, this study produced, in a short time (24-48 h), collagen gel-based lattices with improved stiffness, strength, and elastic recoil. The results suggest that these lattices are serious candidates for the role of temporary supports during the maturation period under cyclic loading.

Le Laboratoire de génie tissulaire est reconnu pour ses réalisations en ce domaine. Le principal défi soulevé par cette approche est le choix de la matrice des tissus reconstruits. Mes travaux ont consisté à établir une technologie de synthèse de collagène humain recombinant à des fins expérimentales et cliniques. Ce collagène sera utilisé éventuellement pour produire des substituts du ligament croisé antérieur (LCA) du genou, par génie tissulaire. Ces substituts ligamentaires pourraient être une alternative de remplacement des LCA rupturés. Le Dr. Nazrul Islam a conceptualisé une stratégie moléculaire pour construire un plasmide incluant les gènes codant pour les deux chaînes du collagène humain de type 1 et les deux sous-unités de l'enzyme prolyl-4-hydroxylase. Des cellules d'insecte ont été transfectées avec ce vecteur, en exploitant le système de bacul ovi rus, pour synthétiser le collagène recombinant. J'ai participé à chaque étape et à la mise au point des protocoles optimisé à grande échelle de cette nouvelle technologie, pour ensuite purifier le collagène et le caractériser biochimiquement. Mes superviseurs et moi-même considérons que ces travaux ont réussi et que bientôt, des substituts ligamentaires humains seront greffés pour évaluer leur intégration dans une articulation du genou in vivo.

Recréer des tissus en laboratoire pour remplacer ou améliorer la fonctionnalité d’un organe défaillant, ou créer un tissu modèle pour tester de nouveaux médicaments comme alternative aux expérimentations animales, n’est plus aujourd’hui du domaine de la science fiction. L’ingénierie tissulaire vasculaire s’appuie sur la capacité des cellules à régénérer un néo-tissu lorsque placées dans des conditions de culture appropriées. Face au manque de vaisseaux sanguins autologues lors de pontages coronariens ou périphériques, elle apporte un nouvel espoir de plus en plus concret quant à la création de substituts en laboratoire pour le remplacement de vaisseaux sanguins de petit diamètre (< 6 mm). L’approche adoptée dans le cadre de cette thèse consiste à utiliser une protéine naturelle, le collagène, comme support de la croissance des cellules vasculaires, acteurs majeurs de la régénération tissulaire. Cependant, en dépit des grandes performances biologiques du collagène (reconstitué en laboratoire), son utilisation est limitée par un manque de propriétés mécaniques. L’objectif de cette thèse est de renforcer les structures de collagène supportant les cellules, afin de pouvoir soumettre ces dernières à des stimulations mécaniques et biochimiques requises pour la maturation du tissu en croissance et appliquées dans un bioréacteur "dynamique". Dans un contexte où aucune norme de caractérisation mécanique des hydrogels n’existe, cette thèse a permis de définir les conditions les plus appropriées pour évaluer les comportement mécanique et viscoélastique des échafaudages de collagène seuls : ils doivent être testés dans un environnement pseudo-physiologique (bain de PBS à 37°C) sans préconditionnement mécanique, et mesurés en relaxation de contrainte, qui permet notamment d’accéder au module élastique, paramètre important lorsqu’un matériau subit des sollicitations mécaniques cycliques. Par la suite, et après avoir montré les effets modérés d’un agent de réticulation physique (exposition aux UVs), le développement d’un bioréacteur dit « statique » a permis de mettre en évidence le fort potentiel des cellules musculaires lisses à renforcer les structures tubulaires de collagène lors d’une période de culture statique. Les résultats des techniques de caractérisation mécanique spécifiquement développées et des techniques d’imagerie microscopique montrent qu’à l’issue de cette culture la réorganisation des cellules ainsi que des fibrilles de collagène s’accompagnent d’un remarquable renforcement mécanique et viscoélastique de la construction artérielle, prête à être placée dans un bioréacteur dynamique. Dans la perspective de la régénération tissulaire, outre l’importance de la relation structure-propriété et des interactions cellulesmatrice extracellulaire, ce projet souligne le rôle primordial de la culture en conditions statiques avant la culture dans un bioréacteur dynamique. / Designing biological tissues in laboratory in order to replace or improve the functionality of a failing organ, or create a tissue which could be a model to test new medicinal formulations as alternative to animal experiments, is no longer a dream and is worth being considered. Tissue engineering is based on the ability of cells to regenerate a neo-tissue when cultured in adequate culture conditions. To address the lack of autologous blood vessels for peripheral or coronary bypass, vascular tissue engineering brings new hopes in creating substitutes in vitro in order to replace small diameter blood vessels (< 6 mm). The scientific approach of this thesis work consists in using a natural protein, collagen, as a scaffold to make the vascular cells proliferate. The main objective of this thesis is to reinforce the collagen structures supporting cells, in order to be able to mechanically and biochemically stimulate them during the maturation of the growing tissue in a "dynamic" bioreactor. It is noteworthy to point out that there is no standard method to mechanically characterize hydrogels. This thesis work managed to define the most adequate conditions to estimate the mechanical and the viscoelastic properties of collagen scaffolds: they must be tested in a pseudo-physiological environment (PBS bath at 37°C) without mechanical preconditioning and measured in stress relaxation, which gives the elastic modulus, an important parameter to consider when a material is subjected to cyclic mechanical stimulation. Then, after having shown relative effects of a physical reticulation agent (UVs exposure), the development of a "static" bioreactor showed the high potential of smooth muscle cells to reinforce the tubular collagen structure during a static culture period. The results of the mechanical characterization techniques specifically developed for this project, and microscopic imaging techniques, show that at the end of this culture period, the reorganization of the cells and of the collagen fibrils leads to a noteworthy mechanical and viscoelastic reinforcement of the vascular construct, mature enough to be put in place in a dynamic bioreactor. In the perspective of tissue regeneration, and considering the importance of the structure-properties relations and cells-extracellular matrix interactions, this thesis project establishes the important role of the static culture period preceding the culture period in the dynamic bioreactor.

Les ligaments jouent un rôle important dans le mouvement et la stabilité des articulations. Les accidents et la fatigue chronique sont les principales raisons des ruptures de ligaments qui n’ont généralement pas de capacité de guérison, ce qui conduit à de graves dysfonctionnements du ligament et des articulations. La construction des ligaments en bioingénierie donne un nouvel espoir thérapeutique. Pour construire un tel tissu, les cellules sont très importantes dans la mise en oeuvre de la construction d’un biotissu ayant de bonnes propriétés tant biologiques que mécaniques. Quelle source cellulaire et quel microenvironnement doivent être utilisés pour la reconstruction des ligaments ? L’objectif de ce travail était d’étudier la différenciation des cellules souches mésenchymateuses médullaires (CSMM) en fibroblaste. Pour ce faire, d’une part, nous avons co-cultivé des CSMM du rat sans contact avec des fibroblastes ligamentaires, et d’autre part, nous avons stimulé mécaniquement les CSMM. Un suivi des ARNm et des protéines associées caractéristiques des ligaments (collagènes I et III et ténascine-C) a été analysés. Nos résultats expérimentaux ont montré que la culture des CSMM dans un microenvironnement fibroblastique de ligaments ou l’étirement favorisent les synthèses de collagènes I et III et de ténascine-C dans les proportions proches des ligaments. L’ensemble de cette étude suggère qu’il est envisageable d’utiliser les CSMM comme source cellulaire, pour une application clinique, en ingénierie tissulaire du ligaments / Ligaments play an important role in the movement and stability of joints. Accidents and chronic fatigues are the main reasons for ligament lesion which usually is difficult for self healing and leads to serious dysfunction of ligaments and joints. The construction of bioengineering ligaments gives a new way to overcome this problem. Cells are very important in the construction of a biotissue with appropriate biological as well as mechanical properties. Which cellular source and microenvironment should be used for the reconstruction of ligaments? The objective of this work is to study the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) into fibroblast. We co-cultured indirectly rat BMSC with ligament fibroblasts or stimulated them by mechanical stretching. After that, the expressions of characteristics mRNA and protein of ligaments (collagen I, III and tenascin-C) have been analyzed. Our experimental results showed that the culture of BMSC in a microenvironment of ligament fibroblast or under stretching favored the syntheses of collagen I, III and tenascin-C in the proportions close to ligaments. In summary, these studies suggest it is feasible to use BMSC as cellular source for a clinical application in tissue engineering of ligaments

Les objectifs de ce travail étaient l’évaluation de stades précoces et tardifs de l’arthrose grâce à une étude histologique et biologique de l’arthrose sur un modèle de rupture de ligament croisé crânial chez le lapin (RLCC) et l’évaluation de l’effet de l’âge sur l’évolution de la maladie. L’étude biologique a été réalisée par le dosage sérique d’un marqueur de la dégradation du collagène de type II, le CTX-II, jusqu’à 20 semaines post-chirurgie. Chez les animaux adultes, les concentrations du CTX-II étaient influencées par la chirurgie et par le développement de la pathologie. Chez les jeunes animaux, les niveaux de CTX-II étaient plus élevés en début d’étude et diminuaient au cours du temps. Chez ce groupe d'animaux, les taux de CTX-II n’étaient pas modifiés par l’intervention chirurgicale. L’étude histologique a été réalisée avec une analyse histomorphologique du cartilage et des analyses histomorphométriques du cartilage et de l’os sous-chondral. L’évaluation histologique a permis d’observer des changements liés à l’arthrose chez tous les animaux opérés. Les altérations au niveau du cartilage étaient plus sévères chez les animaux adultes que chez les jeunes, ces derniers présentant une meilleure capacité de compensation à l’instabilité articulaire. Il a été démontré que l’analyse de la plaque osseuse sous-chondrale a permis de distinguer les animaux opérés des animaux non-opérés dans les 2 groupes d’âge, mais les surfaces articulaires affectées n’étaient pas toujours les mêmes. En conclusion, ce travail suggère l’intérêt du CTX-II dans l’évaluation de l’arthrose, mais aussi la pertinence d’effectuer plusieurs temps d’analyse pour mieux connaître l’évolution de la maladie. Les analyses histologiques ont permis de mettre en évidence des changements au niveau du cartilage et de l’os sous-chondral. Les différences observées entre les lapins adultes et les jeunes remettent en question l'utilisation d’animaux trop jeunes dans les études portant sur l’arthrose / The goals of this work were the evaluation of early and late stages of osteoarthritis through a histological and biological study of osteoarthritis using a rabbit model of the anterior cruciate ligament transaction (ACLT) and the evaluation of the effect of age on the evolution of the disease. Biological study was performed with longitudinal analysis of serum level of CTX-II, a marker a type II collagen degradation. In adult animals, serum concentration of CTX-II was influenced by the ACLT surgery and varied with time. In the young rabbits, the serum levels of CTX-II were more elevated at the beginning of study and decrease after. In this animal group, the rates of CTX-II were not influenced by surgical operation. Histological study was accomplished with both histomorphological analysis of the cartilage and with histomorphometric study of both cartilage and sub-chondral bone. Histological evaluation showed osteoarthritis changes in all operated animals. Changes of the cartilage appeared more severe in the adult group compared to the young rabbits, suggesting that these last have a better compensation capacity during articular instability. Bony changes allowed to differentiate operated animals from the unoperated, but the affected articular surfaces were not always the same. In conclusion, this study suggest the interest of the CTX-II biomarker in the evaluation of osteoarthritis, but also the pertinence to perform several time points of analysis to know better the disease evolution. The histological analysis allowed to put in an obvious place changes at the levels of the cartilage and of the sub-chondral bone. Difference noticed between the adult animals and the young rabbits offers a new look for the use of too young animals in osteoarthritis studies