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Étude du rôle spécifique du système à deux composantes PhoBR et du système Pst (phosphate specific transport) dans la virulence d’une souche pathogène aviaire de Escherichia coli (APEC)Bertrand, Nicolas 12 1900 (has links)
Les souches d’Escherichia coli pathogènes aviaires (APEC) sont responsables d’infections respiratoires et de septicémies chez la volaille. Le régulon Pho est contrôlé conjointement par le système à deux composantes PhoBR et par le système de transport spécifique du phosphate (Pst). Afin de déterminer l’implication de PhoBR et du système Pst dans la pathogenèse de la souche APEC O78 χ7122, différentes souche mutantes phoBR et pst ont été testées pour divers traits de virulence in vivo et in vitro. Les mutations menant à l’activation constitutive du régulon Pho rendaient les souches plus sensibles au peroxyde d’hydrogène et au sérum de lapin comparativement à la souche sauvage. De plus, l’expression des fimbriae de type 1 était affectée chez ces souches. L’ensemble des mutants Pho-constitutifs étaient aussi significativement moins virulents que la souche sauvage dans un modèle de coinfection de poulet, incluant les souches avec un système Pst fonctionnel. De plus, l’inactivation du régulateur PhoB chez un mutant Pst restaure la virulence. Par ailleurs, l’inactivation de PhoB n’affecte pas la virulence de la souche χ7122 dans notre modèle. De manière intéressante, le degré d’atténuation des souches mutantes corrèle directement avec le niveau d’activation du régulon Pho. Globalement, les résultats indiquent que l’activation du régulon Pho plutôt que le transport du phosphate via le système Pst joue un rôle majeur dans l’atténuation des APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains are associated with respiratory infections and septicemia in poultry. The Pho regulon is jointly controlled by the two-component regulatory system PhoBR and by the phosphate-specific transport (Pst) system. To determine the involvement of the PhoBR regulon and the Pst system in the pathogenesis of the APEC O78 strain χ7122, different phoBR and pst mutant strains were tested for in vivo and in vitro virulence traits. Mutations resulting in constitutive activation of the Pho regulon rendered strains more sensitive than the wild-type to hydrogen peroxide and to the bactericidal effects of rabbit serum. In addition, production of type 1 fimbriae was also impaired in these strains. Using a chicken competitive infection model, all PhoB constitutive mutants were out-competed by the wild-type parent, including strains containing a functional Pst system. In addition, cumulative inactivation of the Pst system and the PhoB regulator resulted in a restoration of virulence. Loss of the PhoB regulator alone did not affect virulence in the chicken infection model. Interestingly, the level of attenuation of the mutant strains correlated directly with the level of activation of the Pho regulon. Overall, results indicate that activation of the Pho regulon rather than phosphate transport by the Pst system plays a major role in the attenuation of APEC.
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Etude structurale et fonctionnelle d’acteurs de la transformation génétique naturelle de Streptococcus pneumoniae / Structural and functional study of key actors in streptococcus pneumoniae genetic transformationBoudes, Marion 07 December 2011 (has links)
Streptococcus pneumoniae est la cause principale de pneumonies, otites, méningites et septicémies. La transformation génétique naturelle constitue l’élément clé de son adaptation aux changements environnementaux. Elle s’effectue par intégration d’ADN d’origine externe dans le chromosome de la bactérie, et a lieu pendant un état physiologique particulier appelé compétence.Mon travail de thèse a consisté à étudier les acteurs principaux de la régulation de la compétence (ComD, ComE) et les protéines impliquées dans la prise en charge, le traitement de l’ADN transformant et la recombinaison (DprA, RecA). J’ai notamment résolu la structure du facteur de transcription ComE par cristallographie aux rayons X, et réalisé une étude fonctionnelle de sa fixation sur un de ses promoteurs. Les résultats obtenus ont permis de proposer un mécanisme selon lequel la dimérisation induite par la phosphorylation de ComE, couplée à sa fixation sur la séquence promotrice d’ADN, provoquerait une courbure de l’ADN. Cette courbure permettrait la fixation de l’ARN polymérase, activant ainsi la transcription des gènes nécessaires à la mise en place de la compétence. / Streptococcus pneumoniae is the leading cause of community-acquired infections worldwide. The natural genetic transformation is the key to its adaptation to environmental changes. It takes place with the integration in its chromosome of exogenous DNA, during a physiological state called competence.During my thesis I have focused on the main actors of competence regulation (ComD, ComE) and on proteins involved in exogenous DNA processing and recombination (DprA, RecA). In particular, I have solved the structure of the transcriptional activator ComE by X-ray crystallography, and carried out a functional study of its binding to its promoter. The results obtained allowed us to propose a mechanism regarding the transcriptional activation by ComE of the genes necessary for the set up of the competence : the phosphorylation-induced dimerization, coupled to the binding of ComE to its DNA promoter, would curve the DNA and allow the binding of the RNA polymerase.
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Etude de l'activation du système Zra : régulation de l'activation de ZraS par ZraP la protéine accessoire du système / Study of the activation of Zra system : regulation of ZraS zinc activation by the accessory protein of the systeme ZraPTaher, Raleb 16 November 2018 (has links)
Les bactéries sont exposées aux perturbations externes causées par les changements environnementaux ou la présence d’agents antibactériens nocifs. L’enveloppe bactérienne forme une barrière entre le milieu externe et l’intérieur de la cellule et se trouve donc potentiellement exposée aux dommages causées par les perturbations et forme la première ligne de défense pour les bactéries. Pour survivre à ces conditions, les bactéries ont développé des systèmes à deux composantes (TCS) qui détectent et permettent la réponse à ces stress.Bien qu’ils soient associés à la protéine périplasmique ZraP, ZraSR constitue un de ces TCS. La présence de cette protéine accessoire associé au système ZraSR montre une homologie avec le système CpxPAR qui capte un grand nombre de stress d’enveloppe. Le système Zra est activé en présence de zinc et cause l’expression de zraP, zraS et zraR. Les protéines ZraP et ZraR ont été étudiées mais aucun travail n’a encore impliqué l’étude de la protéine membranaire ZraS et son mécanisme d’activation. En effet, l’étude des senseurs de TCS s’est beaucoup focalisée sur la compréhension de la partie cytoplasmique mais très peu sur le domaine périplasmique. Dans le cas du système Zra, il y a encore des interrogations sur l’activation ainsi que la régulation de ce système. Lors de ma thèse j’ai concentré mes recherches sur le domaine périplasmique de ZraS. Nous avons d’abord voulu comprendre comment le zinc active le système Zra mais aussi par quel moyen la protéine ZraP influe sur cette activation par le zinc. Pour cela, la caractérisation biochimique du domaine périplasmique de ZraS a été effectué et l’effet du zinc sur ce domaine a été observé. De ce fait, nous avons aussi tenté de déterminer quels sont les résidus de ce domaine qui permettent la liaison du zinc. Par une approche in vivo et in vitro, nous avons voulu comprendre le rôle régulateur de ZraP sur le système Zra. Ce travail s’inscrit dans l’objectif de mieux comprendre les différents mécanismes d’activation des différents ESR. / Bacteria are exposed to external perturbations due to environmental changes or to the presence of noxious agents. Because the bacterial cell envelope forms the barrier between the inside and the outside of the cell it is highly susceptible to be damaged by these perturbations but it is also the first line of defense. To survive gram-negative bacteria have developed two component systems (TCS) that detect and respond to these envelope stresses.ZraSR is one of these TCS, although it is atypical because associated with ZraP, a periplasmic protein. The presence of an accessory protein associated with ZraSR system shows that it is functionally homologous to the CpxPAR system, a sensor of a variety of envelope stress signals. In presence of zinc, Zra system is activated and allows the expression of zraP, zraS and zraR. The periplasmic protein ZraP and the response regulator ZraR have been studied but the activation of the membrane histidine kinase by zinc has not been studied yet. Indeed, studying of TCS sensors was focused on the understanding of the cytoplasmic domain and less on the periplasmic part.During my thesis, I tried to concentrate my study on the periplasmic domain of ZraS. We first tried to understand how the zinc is activating the Zra system but also how ZraP is regulating this activation. For that purpose, we characterized ZraS periplasmic domain and analyzed the effect of zinc binding on it. Hence, we also tried to identify all of ZraS residues that are coordinating the zinc. By combining in vitro and in vivo assays, we tried to determine ZraP role in the regulation of Zra system. This study could help for the understanding of the mechanisms important for the activation of bacterial stress response systems.
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Étude du rôle spécifique du système à deux composantes PhoBR et du système Pst (phosphate specific transport) dans la virulence d’une souche pathogène aviaire de Escherichia coli (APEC)Bertrand, Nicolas 12 1900 (has links)
Les souches d’Escherichia coli pathogènes aviaires (APEC) sont responsables d’infections respiratoires et de septicémies chez la volaille. Le régulon Pho est contrôlé conjointement par le système à deux composantes PhoBR et par le système de transport spécifique du phosphate (Pst). Afin de déterminer l’implication de PhoBR et du système Pst dans la pathogenèse de la souche APEC O78 χ7122, différentes souche mutantes phoBR et pst ont été testées pour divers traits de virulence in vivo et in vitro. Les mutations menant à l’activation constitutive du régulon Pho rendaient les souches plus sensibles au peroxyde d’hydrogène et au sérum de lapin comparativement à la souche sauvage. De plus, l’expression des fimbriae de type 1 était affectée chez ces souches. L’ensemble des mutants Pho-constitutifs étaient aussi significativement moins virulents que la souche sauvage dans un modèle de coinfection de poulet, incluant les souches avec un système Pst fonctionnel. De plus, l’inactivation du régulateur PhoB chez un mutant Pst restaure la virulence. Par ailleurs, l’inactivation de PhoB n’affecte pas la virulence de la souche χ7122 dans notre modèle. De manière intéressante, le degré d’atténuation des souches mutantes corrèle directement avec le niveau d’activation du régulon Pho. Globalement, les résultats indiquent que l’activation du régulon Pho plutôt que le transport du phosphate via le système Pst joue un rôle majeur dans l’atténuation des APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains are associated with respiratory infections and septicemia in poultry. The Pho regulon is jointly controlled by the two-component regulatory system PhoBR and by the phosphate-specific transport (Pst) system. To determine the involvement of the PhoBR regulon and the Pst system in the pathogenesis of the APEC O78 strain χ7122, different phoBR and pst mutant strains were tested for in vivo and in vitro virulence traits. Mutations resulting in constitutive activation of the Pho regulon rendered strains more sensitive than the wild-type to hydrogen peroxide and to the bactericidal effects of rabbit serum. In addition, production of type 1 fimbriae was also impaired in these strains. Using a chicken competitive infection model, all PhoB constitutive mutants were out-competed by the wild-type parent, including strains containing a functional Pst system. In addition, cumulative inactivation of the Pst system and the PhoB regulator resulted in a restoration of virulence. Loss of the PhoB regulator alone did not affect virulence in the chicken infection model. Interestingly, the level of attenuation of the mutant strains correlated directly with the level of activation of the Pho regulon. Overall, results indicate that activation of the Pho regulon rather than phosphate transport by the Pst system plays a major role in the attenuation of APEC.
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Factors contributing to the competitiveness of Lactobacillus reuteri in sourdough and rodent gutSu, Shu-Wei Unknown Date
No description available.
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Identification des gènes impliqués lors de l'établissement de Lactobacillus casei dans l'intestin et caractérisation de l'opéron LSEI_0219-0221 / Identification of the genes involved in the establishment of Lactobacillus casei in the gut and characterization of the LSEI_0219_0221Scornec, Hélène 04 November 2014 (has links)
Chez les bactéries en contact direct avec leur milieu, la transcription des gènes et la synthèse des protéines sont régulées de manière efficace à chaque changement des paramètres environnementaux afin de permettre la survie cellulaire. Dans le cas des bactéries commensales de l’intestin, ces régulations doivent aussi permettre les interactions symbiotiques et la colonisation dont les mécanismes moléculaires, encore peu connus, sont probablement liés, entre autres, à la surface des bactéries (molécules exposées et sécrétées…). Lactobacillus casei, bactérie commensale, possède environ 330 gènes prédits comme intervenant dans la composition et la fonctionnalité de la surface cellulaire. Afin d’avoir une vue globale de la totalité des gènes qui interviennent dans l’établissement de L. casei dans l’intestin, une approche de génétique inverse a été réalisée. Pour cela, une banque de mutants aléatoires étiquetés de L. casei par « Signature-Tagged Mutagenesis » a été créée puis annotée et réorganisée grâce au séquençage des régions d’insertion du transposon. Les mutants ont été criblés quant à leur capacité à s’établir dans l’anse iléale ligaturée de lapin et quantifiés par qPCR. Parmi les 47 gènes identifiés comme étant impliqués dans l’établissement in vivo, trois gènes en opéron codant pour un système à deux composants et une « penicillin-binding protein » ont été caractérisés. Ces trois gènes sont impliqués dans la modulation de la surface cellulaire et plus particulièrement dans la régulation des hydrolases du peptidoglycane qui sont nécessaires à la protection de la bactérie dans l’environnement intestinal. / In bacteria which are in direct contact with their environment, genes transcription and proteins synthesis are efficiently regulated at each change of environmental parameters to allow cell survival. For intestinal commensal bacteria, these regulations must also allow symbiotic interactions and colonization whose molecular mechanisms, so far little known, are probably related, among others, to the bacteria surface (molecules exposed and secreted…). Lactobacillus casei, a commensal bacterium, has about 330 predicted genes involved in the composition and functionality of the cell surface. To have a global view of the whole genes involved in the establishment of L. casei in the gut, a reverse genetics approach was performed. For that, a library of L. casei random labeled-mutants by Signature-Tagged Mutagenesis was generated then annotated and reassembled thanks to the sequencing of transposon insertion sites. Mutants were screened for their ability to establish themselves in the rabbit ligated ileal loop and quantified by qPCR. Among the 47 genes identified as involved in the in vivo establishment, three genes in an operon encoding a two-component system and a penicillin-binding protein were characterized. These three genes are involved in the cell surface modulation and particularly in the regulation of peptidoglycan hydrolases which are required for the bacteria protection in the intestinal environment.
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Caractérisation de mutants surproduisant le système d'efflux actif MexXY/OprM chez pseudomonas aeruginosa / Characterization of pseudomonas aeruginosa mutants overproducing the MexXY/OprM efflux systemMuller, Cédric 12 December 2012 (has links)
Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur de l'Homme capable de mettre en jeu tout un ensemble de mécanismes pour résister aux antibiotiques. Parmi eux, le système d'efflux actif MexXY(OprM) s'oppose, lorsqu'il est surproduit, à l'accumulation intracellulaire de différents composés dont certains, comme les aminosides et les fluoroquinolones, sont largement utilisés dans le traitement des infections à P. aeruginosa. Chez les souches cliniques, la surproduction de la pompe MexXY résulte de mutations soit dans le gène répresseur de l'opéron mexXY, mexZ (mutants agrZ) soit dans des loci génétiques encore inconnus (mutants agrUI). Au cours de ce travail, nous avons carcatérisés deux types de mutants agr W dérivés de la souche de référence PAO 1. Les premiers, agr WI, présentent une augmentation de la résistance aux antibiotiques substrats de la pompe Mex.XY comparable à celle observée chez les mutants agrZ tandis que les seconds, agrW2, sont en plus résistants aux carbapénèmes et aux peptides cationiques ( colistine ). Par une approche de séquençage à haut débit des génomes, nous avons identifié chez les mutants agrWI une mutation dans deux des quatre allèles codant pour la sous-unité ribosomale 23S et chez les mutants agrW2 une mutation dans le régulateur de réponse d'un système à deux composants dénommé ParR. A l'aide d'expériences de RT-qPCR, d'inactivation et de complémentation génique deux voies distinctes d'activation de MexXY/OprM ont été identifiées. Parallèlement, la comparaison des transcriptomes globaux des mutants agrWI, agrW2 avec celui de la souche PAOl nous a permis de mieux comprendre dans quel processus cellulaire s'intègre la pompe Mex.XY /OprM. / Pseudomonas aeruginosa is a nosocomial pathogen naturally resistant to many antibiotics thanks to numerous resistant mechanisms. Among them, overproduction of the MexXY/OprM efflux system leads to decrease significantly the susceptibility of P. aeruginosa to aminoglycosides and fluoroquinolones. In clinical strains, upregulation of this pump often results from mutations occurrinJ in mexZ ( agrZ mutants), the local repressor gene of the mexXY operon. Analysis of MexXYoverproducing mutants selected in vitro from the reference strain PAO 1 led to identification of two new classes of mutants (agrWmutants) harboring an intact mexZ gene. The first, named agrWI mutants, shows an increase resistance to Mex.XY substrates similar to that observed in agrZ mutants while the second, dubbed agrW2, are more resistant to carbapenems and cationic peptides (colistin) in addition to aminoglycosides and fluoroquinolones. Whole-genome sequencing experiments revealed in agrWI mutants a mutation in two of the four alleles encoding the 23S ribosomal subunit and in agr W2 mutants, a mutation in the response regulator of a two-component system called ParR. By using RT-qPCR, inactivation and complementation experiments, two distinct activation pathway of the MexXY /OprM efflux system have been identified. Meanwhile, transcriptomic profiles of agrWJ and agrW2 mutants compared with the PAOl reference strain has allowed us to better understand the physiologie function of the MexXY/OprM efflux pump
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Rôle des systèmes à deux composants dans l’adaptation de la bactérie phytostimulatrice Azospirillum à la rhizosphère / Role of two component systems in the adaptation of the phytostimulatory bacterium Azospirillum to the rhizosphereBorland, Stéphanie 02 April 2015 (has links)
Les systèmes à deux composants jouent un rôle prépondérant dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et de caractériser des systèmes à deux composants chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum nécessaires à l'adaptation à la rhizosphère de sa plante-hôte. L'analyse de la distribution génomique des gènes appartenant à la famille des systèmes à deux composants dans les génomes d'Azospirillum disponibles a révélé l'existence d'un grand nombre de gènes codant des hisitidine kinases hybrides, et une analyse plus approfondie a montré une organisation multidomaines complexe de cette famille de protéines. Afin de comprendre leur rôle chez Azospirillum, nous avons, dans un premier temps, sélectionné et inactivé quatre gènes codant des histidine kinases hybrides présentant une architecture multidomaines complexe. A l'aide d'une approche multidisciplinaire combinant génétique, biochimie et phylogénie, nous avons mis en évidence pour la première fois chez Azospirillum, un système atypique à trois-composants nommé PreSKR contrôlant un grand nombre de processus impliqués dans la survie et la colonisation de la rhizosphère, qui agirait en modulant le taux intracellulaire de c-di-GMP. Dans un second temps, nous nous sommes focalisés sur une histidine kinase hybride exprimée au contact de la plante hôte ; cette protéine, appelée RsiK, s'avère être impliquée dans la perception de surfaces et la régulation de la formation de biofilms. L'analyse du régulon par RNA-seq a révèlé que 78 gènes étaient contrôlés par ce système. La prévalence de la famille des histidine kinases hybrides chez Azospirillum couplée à l'approche fonctionnelle réalisée sur deux d'entre elle souligne l'importance des phosphorelais encore largement méconnus chez les bactéries rhizosphériques / Bacterial two-component systems play an important role in the ability of bacteria to adapt to various environments. The aim of this thesis was to identify and characterize two-component systems involved in the adaptation of the phytostimulatory bacteria Azospirillum to its host plant. Analysis of the genomic distribution of genes encoding two-component systems across Azospirillum available genomes revealed the existence of a high number of genes encoding hybrid histidine kinases, and further analyses highlighted a complex multi-domain organization of this family of proteins. In order to understand their role in Azospirillum, as a first step we selected and inactivated four genes encoding complex hybrid histidines kinases. Using a multidisciplinary approach which combines genetics, biochemistry and phylogeny, we brought to light for the first time in Azospirillum, an atypical three-component system named PreSKR which controls a wide variety of processes involved in survival and rhizosphere colonization likely by modulating c-di-GMP levels. As a second step, we focused on a gene encoding a hybrid histidine kinase named RsiK which is induced in contact with its host plant. RsiK is involved in surface sensing and biofilm formation regulation. Transcriptomic analysis of rsiK regulon by RNA-seq showed that 78 genes were under the control of this system. The prevalence of genes encoding hybrid histidine kinase family in Azospirillum, coupled with the functional characterization of two of them, highlight the importance of phosphorelays, still largely unrecognized in rhizospheric bacteria
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Investigating the effect of implementing Data-Oriented Design principles on performance and cache utilizationNyberg, Frank January 2021 (has links)
Game engines process a lot of data under strict deadlines. Therefore, measures to increase performance are important in this area. Data-Oriented Design (DOD) promotes principles that are meant to increase performance by better cache utilization. The purpose of this thesis is to examine a selection of these principles to give a better understanding of how DOD affects CPU time and the rate of cache misses, with focus on the area of game development. More specifically, the principles examined are removal of run-time polymorphism, iteration over contiguous data, and lowering the amount of data in hot loops. Also, the Entity-Component-System pattern is examined, which is based upon DOD principles. The approach was to first present a theoretical background on the subject, and then to conduct tests by implementing a simulation of movement and collision detection utilizing said principles. The tests were written in C++ and executed on an Intel Core i7 4770k with no rendering. CPU time was measured in updated entities per μs, and cache utilization was measured in the form of cache miss rate. The results showed that the DOD principles did increase performance. Cache miss rate was also lower, with the exception of when removing run-time polymorphism. The conclusion is that Data-Oriented Design, used in game development, is likely to result in better performance, mostly as a result of better cache utilization.
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Etude fonctionnelle des undécaprényl-pyrophosphate phosphatases BacA et LpxT, enzymes membranaires impliquées dans la biogenèse de l’enveloppe bactérienne / Functional characterization of undecaprenyl-pyrophosphate phosphatases BacA and LpxT, integral membrane proteins involved in the biogenesis of the bacterial envelopeManat, Guillaume 09 May 2016 (has links)
Chez les bactéries, l’undécaprényl-phosphate (C55-P) est utilisé comme transporteur lipidique de sous-unités glycanes à travers la membrane plasmique. Après la synthèse de son précurseur (C55-PP) par UppS, ce dernier doit être déphosphorylé. Le transfert final des sous-unités glycanes sur une molécule acceptrice du côté périplasmique libère également du C55-PP qui va être déphosphorylé pour être recyclé. Quatre C55-PP phosphatases membranaires ont été identifiées chez E. coli : trois enzymes appartenant à la famille des PAP2 (PgpB, YbjG et LpxT) et une protéine appartenant à une nouvelle famille de phosphatases (BacA). Au cours de cette étude, nous avons caractérisé les propriétés biochimiques et la topologie membranaire de BacA. Les conditions optimales de son activité (pH, détergent, cations, température) ont été déterminées et une étroite spécificité de substrats, avec une préférence pour le C55-PP, a été observée. Trois résidus essentiels à son activité, Glu21, Ser27 et Arg174, ont été identifiés par mutagénèse, nous permettant de proposer un mécanisme catalytique basé sur l’attaque nucléophile du C55-PP par un résidu sérine. La topologie membranaire de BacA, déterminée expérimentalement à l’aide de fusions de protéines, n’a validé aucun des modèles in silico précédemment proposés. Ainsi, BacA comprend 7 segments transmembranaires et présente deux larges boucles périplasmiques portant les résidus hautement conservés du site actif. Nos résultats démontrent que toutes les C55-PP phosphatases d’E. coli identifiées à ce jour (BacA et PAP2) catalysent la déphosphorylation du C55-PP du même côté de la membrane plasmique (côté périplasmique), nous interrogeant sur l’identité de l’enzyme catalysant la déphosphorylation du C55-PP synthétisé de novo. LpxT est une PAP2 qui possède une activité kinase assurant le transfert du phosphate β du C55-PP sur une molécule de lipide A, pour former du lipide A-1-PP. Nous avons cartographié par mutagénèse dirigée le site actif de LpxT et mis en évidence l’importance d’une triade catalytique caractéristique des PAP2 (His150, His190, Asp194) et d’autres résidus spécifiques à LpxT et ses proches homologues. L’activité de LpxT est inhibée par un petit peptide, PmrR, dont l’expression est sous contrôle du système à deux composants PmrA-PmrB. Notre étude a montré que cette inhibition intervenait via une interaction directe entre ces deux partenaires. Nous montrons que l’induction du système PmrA-PmrB conduit à une résistance à la polymyxine B (peptide antimicrobien cationique) et à une sensibilité au déoxycholate (composant majeur de la bile) et que la modification catalysée par LpxT produit un effet opposé. La résistance à la polymyxine B est corrélée à la force des signaux induisant le système PmrA-PmrB, mais également le système PhoP-PhoQ et nous avons clairement identifié les signaux nécessaires à cette résistance chez E. coli. / In bacteria, the undecaprenyl-phosphate (C55-P) is used as a lipid carrier of glycans subunits across the plasma membrane. After synthesis of its precursor (C55-PP) by UppS, this latter must be dephosphorylated. The transfer of the glycans subunit onto a final acceptor molecule at the periplasmic side also releases C55-PP that will be dephosphorylated to be recycled. Four C55-PP membrane phosphatases have been identified in E. coli : three enzymes belonging to the PAP2 family (PgpB, YbjG and LpxT) and a protein belonging to a new family of phosphatases (BacA).In this study, we characterized the biochemical properties and membrane topology of BacA. The optimal conditions for its activity (pH, detergent, cation, temperature) were determined and narrow substrate specificity, with a preference for the C55-PP, was observed. Three essential residues to its activity, Glu21, Ser27 and Arg174 were identified by mutagenesis, allowing us to propose a catalytic mechanism based on the nucleophilic attack of the C55-PP by a serine residue. The membrane topology of BacA determined experimentally using protein fusions did not validated previous in silico models. Thus, BacA has 7 transmembrane segments and contains in particular two large periplasmic loops carrying the highly-conserved active site residues. Our results demonstrate that all C55-PP phosphatases of E. coli identified to date (BacA and PAP2) catalyze the dephosphorylation of C55-PP on the same side of the plasma membrane (periplasmic side), questioning us about the identity of the enzyme catalyzing the dephosphorylation of C55-PP synthesized de novo. LpxT is a PAP2 enzyme with a specific kinase activity, transferring the β-phosphate group of C55-PP on a molecule of lipid A, to generate lipid A-1-PP. We mapped, by directed mutagenesis, the active site of LpxT and highlighted the importance of a catalytic triad characteristic to the PAP2 enzymes (His150, His190, Asp194) and other specific residues of LpxT and its closer homologues. The activity of LpxT is inhibited by a small membrane peptide, called PmrR, whose expression is under the control of the two-component system PmrA-PmrB. Our study showed that this inhibition occurred via a direct interaction between these two partners. We showed that the induction of PmrA-PmrB system leads to resistance to the polymyxin B (cationic antimicrobial peptide) and sensitivity to deoxycholate (component major bile) and that the modification catalyzed LpxT produces an opposite effect. The robustness of the resistance to the polymyxin B is connected to the force of the signals inducing PmrA-PmrB system, but also the system PhoP-PhoQ and we clearly identified the signals needed to this resistance in E. coli.
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