Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A ConBr à uma proteÃna tetramÃrica presente em sementes de Canavalia brasiliensis e que possui afinidade para os aÃÃcares D-mannose e D-glucose. à vasto o uso desta lectina em ensaios biotecnolÃgicos devido as suas propriedades biolÃgicas. à comumente utilizada conjugada ao FITC, um fluorÃforo amplamente utilizado nas diversas Ãreas da biotecnologia para anexar um marcador fluorescente a proteÃnas atravÃs do grupamento amina. No entanto, a influÃncia deste fluorÃforo na atividade de tais proteÃnas precisa ser mais bem evidenciada. Essa pesquisa visou obter informaÃÃes sobre as alteraÃÃes na estrutura secundÃria da proteÃna ConBr nativa e conjugada com FITC, alÃm de iniciar um estudo desta lectina tambÃm conjugada com pontos quÃnticos. Amostras de ConBr nativa, conjugada com o FITC (ConBr-FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 2% em massa (ConBr/FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 20% em massa (ConBr/FITC (20%)) e processada mas nÃo conjugada com o FITC (ConBr-), foram analisadas por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) atravÃs da tÃcnica de reflectÃncia total atenuada (ATR). Foram realizados testes de atividade hemaglutinante especÃfica com ConBr nativa, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr- e ConBr conjugada com pontos quÃnticos (ConBr-QD Zn/Cd). A atividade hemaglutinante especÃfica nos extratos foi determinada usando-se suspensÃes de hemÃcias de coelho a 3% em placas de microtitulaÃÃo. Os dados obtidos nos ensaios de atividade especÃfica foram submetidos ao teste estatÃstico de Mann-Whitney. Quando os espectros de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) foram comparados, observou-se que o pico da lectina nativa referente Ãs estruturas de folhas β, nÃo sofreu qualquer modificaÃÃo quando a proteÃna foi conjugada com FITC, entreteanto, notou-se uma diminuiÃÃo da intensidade na regiÃo do espectro referente Ãs estruturas em α-hÃlice, o que permite inferir uma reduÃÃo da quantidade destas estruturas. Houve tambÃm um aumento de intensidade na regiÃo referente Ãs estruturas irregulares. Os espectros de ConBr nativa, ConBr- e ConBr/FITC (2%) nÃo sugeriram alteraÃÃes na estrutura secundÃria. Nos testes de atividade hemaglutinante especÃfica de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) houve uma diminuiÃÃo da atividade especÃfica para esta Ãltima em relaÃÃo a primeira e estes resultados demonstraram diferenÃa estatisticamente significativa entre si. ConBr nativa e ConBr- nÃo apresentaram diferenÃas estatÃsticas significativas entre si. A atividade de ConBr/FITC (2%) tambÃm nÃo apresentou diferenÃas estatÃsticas em relaÃÃo à ConBr nativa. Em conjunto, estes resultados contribuem e reforÃam a proposiÃÃo de que à a ligaÃÃo do FITC à proteÃna que promove a alteraÃÃo estrutural na regiÃo de α-hÃlice. A atividade especÃfica de ConBr-QD Zn/Cd diminuiu drasticamente quando comparada com a atividade de ConBr nativa, apresentando diferenÃa estatisticamente significativa entre estas amostras. AnÃlises estatÃsticas realizadas com os dados obtidos no teste de atividade especÃfica e anÃlise dos espectros de infravermelho sugerem alteraÃÃes na estrutura secundÃria da lectina ConBr conjugada ao FITC. PorÃm, ainda à necessÃria a elucidaÃÃo da natureza dessa alteraÃÃo e se essa à realmente devida à ligaÃÃo da proteÃna ao fluorÃforo. / ConBr is a tetrameric protein found in Canavalia brasiliensis seeds and has affinity for D-mannose and D-glucose carbohydrates. It is vast use of this lectin in biotechnological assays due their biological properties, and itâs used commonly linked to FITC, a fluorophore widely used in various fields of biotechnology to attach to proteins a fluorescent marker through amine grouping. However, the fluorophore influence in proteins activity must be further highlighted. This research aimed obtain informations about native ConBr secondary structure and FITC-conjugated changes and start a study of this lectin conjugated quantum dots also. Samples of native ConBr, ConBr-FITC conjugated (FITC-ConBr (2%)), ConBr mixed with the FITC proportion of 2% by mass (ConBr/FITC (2%)), ConBr mixed with FITC at 20 mass% (ConBr/FITC (20%)) and processed but not conjugated with FITC ConBr (ConBr-) were analyzed by Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), mode ATR (Attenuated Total Refectance). The native ConBr, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr-, and conjugated quantum dots ConBr (QD ConBr-Zn / Cd) specific haemagglutinating activity were performed. The specific haemagglutinating activity in the extracts was determined using the rabbit erythrocytes suspensions at 3% in microtiter plates. The specific activity data were tested using the Mann-Whitney test. When the native ConBr and FITC-ConBr (2%) spectra were compared, it was found the peak of the native lectin relating to β-sheet structures not suffered modification when the protein was conjugated with FITC, but there was a intensity reduction in the spectrum region relating to α-helix structures, which allows a reduction in the amount these structures. There was an intensity increase of irregular structures also. Native ConBr, ConBr- e ConBr/FITC (2%) spectra suggested no changes in secondary structure. There was a ConBr-FITC (2%) hemagglutinating activity decrease and that result showed statistically significant difference to native ConBr. Native ConBr and ConBr- do not have significantly differences. The ConBr/FITC (2%) activity didnât showed statistical differences regarding native ConBr. These results contribute and reinforce the proposition that is the FITC binding to protein promotes the structural change in the α-helix region. The ConBr-QD Zn/Cd specific activity decreased compared with the activity of native ConBr, demonstrating statistically significant differences between these samples. Statistical analyzes using the data obtained in the specific activity test and infrared spectra analysis suggest lectin ConBr FITC-conjugated secondary structure changes. However, itâs still necessary elucidate the nature of this change, and whether this is really due to the protein-fluorophore binding.

nÃo hà / Lectins are a group of proteins present in various living organisms, particularly in plants and especially in Leguminosae seeds. Among this family, a species that stands out for having large amount of lectin in the seed is the Canavalia brasiliensis. One approach for the investigation of lectins on biological systems is the detection there of by techniques involving antibody. Such techniques may include from classical immunochemical assays (immunodiffusion, immunoelectrophoresis and rocketimunoeletroforese) to ELISA experiments and advanced microscopy techniques. In this sense, antibodies become biotechnological tools invaluable since they are capable of specifically recognizing epitopes of the target molecules. Immunoglobulins (Igs) are proteins present in high concentration in the blood plasma of mammals. They are vectors of humoral immunity, with the primary function to join the foreign antigens to the individual so as to neutralize them. In the case of poultry the main immunoglobulin class (IgYs) can be found not only in blood, but also in egg yolk. This fact enables fast and efficient purification of these molecules facilitating its use as biotechnological inputs. Thus, this study aimed to produce antibodies against the lectin extracted from Canavalia brasiliensis seed (ConBr) (Fabaceae) in laying hens, implementing production methodology of new biotechnological inputs for the study of lectins. For this laying hens were immunized with 200 or 400μg of lectin Canavalia brasiliensis (ConBr) for 15 weeks at 10-day intervals. Collected eggs from vaccinated birds had their isolated and precipitated yolk in 0-30% fraction with ammonium sulfate for partial purificaÃÃoo of IgYs. Confirmation of the presence of antibodies was made by immunodiffusion assays agarose gel. The fraction showed 0-30%, from the first week after the immunization, capable of recognizing ConBr IgYs. This profile appeared in all groups over the 15-week experiment. The production of specific IgYs against the lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) proved feasible and remained throughout the experiment, possibly in reasonable quantities. In this sense, IgYs produced in this work provide a powerful biotechnological tool to be made available for future studies. / As lectinas constituem um grupo de proteÃnas presentes em diversos organismos vivos, sobretudo em vegetais e especialmente em sementes de Leguminosae. Dentre essa famÃlia, uma espÃcie que se destaca por possuir grande quantidade de lectina na semente à a Canavalia brasiliensis. Uma das possÃveis abordagens para a investigaÃÃo de lectinas em sistemas biolÃgicos à a detecÃÃo das mesmas atravÃs de tÃcnicas que envolvam anticorpos. Tais tÃcnicas podem incluir desde ensaios clÃssicos de imunoquÃmica (imunodifusÃo, imunoeletroforese e rocketimunoeletroforese), atà experimentos de ELISA e tÃcnicas avanÃadas de microscopia. Neste sentido, os anticopos tornam-se ferramentas biotecnolÃgicas de grande valia uma vez que sÃo capazes de reconhecer especificamente epÃtopos das molÃculas alvo. As imunoglobulinas (Igs) são proteínas presentes em grande concentração no plasma sanguÃneo de mamÃferos. São os vetores da imunidade humoral, tendo como função principal unir-se aos antígenos estranhos ao indivÃduo, de modo a neutralizá-los. No caso das aves a principal classe de imunoglobulinas (IgYs) pode ser encontrada nÃo somente no sangue mas tambÃm nas gemas dos ovos. Esse fato permite purificaÃÃo rÃpida e eficiente dessas molÃculas facilitando seu uso como insumos biotecnolÃgicos. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo produzir anticorpos contra a lectina extraÃda da semente de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras, implementando metodologia de produÃÃo de novos insumos biotecnolÃgicos para o estudo de lectinas. Para tanto galinhas poedeiras foram imunizadas com 200 ou 400μg da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) por 15 semanas em intervalos de 10 dias. Ovos coletados das aves imunizadas tiveram suas gemas isoladas e precipitadas na fraÃÃo 0-30% com sulfato de amÃnio para a purificaÃÃo parcial das IgYs. A confirmaÃÃo da presenÃa dos anticorpos foi feita por ensaios de imunodifusÃo em gel de agarose. A fraÃÃo 0-30% apresentou, a partir da primeira semana apÃs a imunizaÃÃo, as IgYs capazes de reconhecer ConBr. Esse perfil se apresentou em todos os grupos ao longo das 15 semanas de experimento. A produÃÃo das IgYs especÃficas contra a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) se mostrou viÃvel e permaneceu durante todo experimento, possivelmente em quantidades razoÃveis. Neste sentido, as IgYs produzidas nesse trabalho constituem uma potente ferramenta biotecnolÃgica a ser disponibilizada para estudos futuros.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_cristian_kaefer.pdf: 618934 bytes, checksum: 3a187e51605cfbd7fbc2329acd8b0568 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / The outer membrane of mammalian sperm is covered by the glycocalyx, a layer rich in carbohydrates which is crucial for the functions and interactions of male gametes with the extracellular environment. Several factors affect the motility and functional integrity of sperm, being the damage caused by excessive production of reactive oxygen species (ROS), an important factor. Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrate residues. These proteins are useful tools for investigating the distribution and changes of membrane glycoconjugates. Studies have investigated the oxidative stress in sperm cells, however, to date, no studies have been conducted to evaluate the effect of plant lectins on oxidative stress in spermatozoa. The present study aimed to investigate the pattern of binding and the effects of lectins ConA, extracted from Canavalia ensiformis, ConBol, extracted from C. boliviana, and ConBr, extracted from C. brasiliensis, on motility, viability, lipid peroxidation, and ROS generation in bovine sperm. The three lectins bound to sperm, but with some differences. It was observed that the lectin ConA did not bind to the equatorial segment located between the acrosomal cap and post-acrosomal region. In 18% of sperm cells labeled with ConBol there was not binding in the acrosome region and 45% of ConBr labeled cells showed a fragmented binding to the sperm head. Sperm incubation with Canavalia lectins produced a decrease in motility. ConA and ConBr demonstrated a strong effect to decline motility soon after incubation (13.3 ± 3.3% in both lectins vs. 60 ± 5.7%) (P<0.05). The lowest motility values found was at the 15 µg/ml concentration after 2h incubation for ConBr (1.6 ±1.7%). The cell viability and lipid peroxidation were not affected by any lectin tested (P>0.05). However, ConA, ConBol and ConBr lectins showed similar behavior causing a increase of ROS production over time compared with control (P<0.05). In conclusion, this study demonstrates that sperm incubation with ConA, ConBol and ConBr lectins induce a decrease in motility and an increase generation of ROS that can led to a spermatozoon dysfunction. / A membrana externa dos espermatozoides de mamíferos é coberta pelo glicocálice, uma camada rica em carboidratos que é crucial para as funções e interações dos gametas masculinos com o ambiente extracelular. Vários fatores afetam a motilidade e a integridade funcional dos espermatozoides, sendo o dano causado pela produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) um importante fator. Lectinas são proteínas que se ligam de forma especifica a resíduos de carboidratos. Essas proteínas são ferramentas úteis para a investigação da distribuição e alteração de glicoconjugados de membrana. Estudos investigaram o estresse oxidativo em células espermáticas, porém, até o momento, não foram realizados trabalhos para avaliar o efeito de lectinas vegetais no estresse oxidativo em espermatozoides. O presente estudo teve por objetivo investigar o padrão de ligação e os efeitos das lectinas ConA, extraída de Canavalia ensiformis, ConBol, extraída de C. boliviana, e ConBr, extraída de C. brasiliensis, na motilidade, viabilidade, peroxidação lipídica, e geração de ROS em espermatozoides bovinos. Foi observado que as três lectinas se ligaram aos espermatozóides, mas com algumas diferenças. A lectina ConA não se ligou ao segmento equatorial, localizado entre a capa acrossomal e a região pós-acrossomal. Em 18% dos espermatozoides marcados com ConBol não houve ligação da lectina na região do acrossoma. Já em 45% das células marcadas com ConBr houve uma ligação de aspecto fragmentado a cabeça do espermatozoide. A incubação com as lectinas do gênero Canavalia produziu um decréscimo na motilidade. ConA e ConBr demonstraram um grande efeito na diminuição da motilidade espermática logo após a incubação (13.3 ± 3.3% em ambas as lectinas vs. 60 ± 5.7%) (P<0.05). A motilidade mais baixa ocorreu com a concentração de 15 µg/ml de ConBr após 2h de incubação (1.6 ±1.7%). A viabilidade celular e a peroxidação lipídica não foram afetadas por nenhuma das lectinas testadas (P>0.05). No entanto, as lectinas ConA, ConBol e ConBr apresentaram comportamento similar causando um aumento na produção de ROS ao longo do tempo comparado com o controle (P<0.05). Em conclusão, este estudo demonstra que as lectinas ConA, ConBol e ConBr ligam-se aos carboidratos de membrana de espermatozoides bovinos e induzem uma diminuição da motilidade e aumento na geração de ROS, que pode levar a perda da função celular.