京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22318号 / 医博第4559号 / 新制||医||1041(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邉 大, 教授 林 康紀, 教授 伊佐 正 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Cardiac fibrosis contributes to heart failure by dramatically impairing cardiac function, increasing patient morbidity and mortality. The primary fibrillar collagen expressed in the heart is type I, and increased collagen synthesis is the hallmark of cardiac fibrosis. Our laboratory has shown that the transcription factor scleraxis is sufficient to regulate the gene encoding collagen Iα2. The present thesis identifies and focuses on three key functions of scleraxis in the heart. First, we show that scleraxis is required for production of the cardiac extracellular matrix. Using in vitro and in vivo models, we observed a significant upregulation/reduction of matrix genes in response to induction/loss of scleraxis gene function respectively. In fact, scleraxis overexpression was sufficient to rescue matrix synthesis in scleraxis-null cells. In a murine model of cardiac pressure overload, scleraxis gene deletion blunted the induction of fibrotic collagen gene expression. Second, we provide evidence that scleraxis governs fibroblast-myofibroblast phenotype transition and fibroblast number. Scleraxis gene induction promoted cardiac myofibroblast phenoconversion while knockdown reduced myofibroblast marker gene expression. Scleraxis exerts direct transcriptional control on the a-smooth muscle actin gene-an established marker of myofibroblasts. Scleraxis null mice exhibited a dramatic reduction in cardiac fibroblast numbers- this is attributed to impairment of the epithelial-to-mesenchymal transition program which was marked by a corresponding loss of mesenchymal markers and increased epithelial markers. Loss-of-function experiments using primary cardiac proto-myofibroblasts recapitulated this paradigm, whereas scleraxis gene induction showed a reciprocal effect on mesenchymal markers. Third, data from this study supports the required role of scleraxis in the TGFb/Smad signaling pathway. Scleraxis is strongly upregulated by the potent pro-fibrotic cytokine TGFb, and works synergistically with the canonical Smad signaling pathway to increase Col1a2 expression by cardiac fibroblasts and myofibroblasts. Smad3 induced expression of the fibrillar collagens – an effect that was significantly attenuated following scleraxis knockdown. Smad3 binding to the Col1a2 gene promoter was significantly reduced in scleraxis null hearts. This study involved a comprehensive series of in vitro and in vivo experiments, and is the first to identify scleraxis as a key regulator of multiple fibroblast functions and a potential future target for therapeutic intervention in cardiac fibrosis. / May 2016

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第22133号 / 生博第420号 / 新制||生||55(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 渡邊 直樹, 教授 千坂 修, 教授 原田 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

A key issue in neuroscience is to determine the connection between neuronal circuits and behaviour. In the adult brain, all neuronal circuits include a glutamatergic component. Three proteins designated Vesicular glutamate transporter 1-3 (VGLUT1-3) possess the capability of packaging glutamate into presynaptic vesicles for release of glutamate at the nerve terminal. The present study aimed at determining the role of VGLUT2 in neuronal circuits of higher brain function, emotion, and reward-pocessing. A conditional knockout (cKO) strategy was utilised, and three different mouse lines were produced to delete VGLUT2 in specific neuronal circuits in a temporally and spatially controlled manner. First, we produced a cKO mouse in which Vglut2 was deleted in specific subpopulations of the cortex, amygdala and hippocampus from preadolescence. This resulted in blunted aspects in cognitive, emotional and social behaviour in a schizophrenia-related phenotype. Furthermore, we showed a downstream effect of the targeted deletion on the dopaminergic system. In a subsequent analysis of the same cKO mice, we showed that female cKO mice were more affected their male counterparts, and we also found that female schizophrenia patients, but not male patients, had increased Vglut2 levels in the cortex.  Second, we produced and analysed cKO mice in which Vglut2 was deleted in the cortex, amygdala and hippocampus already from midgestation, and could show that this deletion affected emotional, but not cognitive, function. Third, we addressed the role of VGLUT2 in midbrain dopamine neurons by targeting Vglut2 specifically in these neurons. These cKO mice showed a blunted activational response to the psychostimulant amphetamine and increased operant self-administration of both sugar and cocaine reinforcers. Further, the cKO mice displayed strongly enhanced cocaine-seeking in response to cocaine-associated cues, a behaviour of relevance for addiction in humans. In summary, this thesis work has addressed the role of the presynaptic glutamatergic neuron in different neuronal circuits and shown that the temporal and spatial distribution of VGLUT2 is of great significance for normal brain function.

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux. / The nuclear receptor Nr5a2 is expressed in the ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Conditional disruption of Nr5a2 in granulosa cells beginning with primary follicles by means of Nr5a2-floxed and Amhr2-Cre mice (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) results in failure in cumulus expansion, ovulation and luteinization. We hypothesize that Nr5a2 regulates intercellular connections in ovarian follicles through connexin 43 (Cx43), a gap-junctional protein related to cumulus expansion. The first objective of this study was to determine whether the lack of cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO mice is related to the absence of normal cell-to-cell communication in cumulus/granulosa cells of preovulatory follicles. To address this, immature ovaries of Amhr2Cre-cKO and non-transgenic littermates mice were collected (n=3) after superstimulation to induce follicle development and ovulation. Using RT-PCR, the Cx43 mRNA levels were shown to be downregulated prior to and at the time of the ovulatory stimulus (0 h and 2 h) in the Amhr2Cre-cKO group (P<0.01), which may lead to the failure in the acquisition of oocyte developmental competence. On the other hand, by the time of ovulation (12 h), mRNA levels of Cx43 are upregulated in Amhr2Cre-cKO group, which may prevent the cumulus cells to detach one from another. We conclude that Cx43 is one of the downstream genes under Nr5a2 control and its dysregulation can be one reason for the defect in cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO females. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization in different stages of the follicle maturation, we hypothesized that Nr5a2 modulates the events leading to ovulation in a temporal sequence. By crossing Nr5a2-floxed and Cyp19-Cre mice (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), Nr5a2 was disrupted in granulosa cells of antral and preovulatory follicles. No litters were born to Cyp19Cre-cKO females (n=4) during a 6 months breeding trial. Cyp19Cre-cKO enabled the development of a luteal-like structure, and 1-year-old females presented hemorrhagic follicular cysts and hypertrophic ovarian surface epithelium. Both knockout models display lack of cumulus expansion and ovulation. We conclude that Nr5a2 differentially regulates folliculogenesis and ovulation in granulosa cells of small and antral follicles.

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune. / The nuclear receptor Nr5a2, also known as liver receptor homolog-1 (Lrh-1), is expressed in the mouse ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Granulosa-specific disruption of Nr5a2 in mice from primary follicles onward in the follicle development trajectory has shown that Nr5a2 is a key regulator of ovulation and female fertility. We hypothesized that Nr5a2 modulates peri- and post-ovulatory events in a temporal sequence during folliculogenesis. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization at different stages of the follicular development, we generated two Nr5a2 granulosa-specific knockout mice models: 1) Nr5a2Amhr2-/-, with Nr5a2 depletion from primary follicles forward; and 2) Nr5a2Cyp19-/-, with Nr5a2 depletion from the antral stage of development forward. The lack of Nr5a2 beginning in antral follicles resulted in infertility in Nr5a2Cyp19-/- females, with ovaries displaying non-functional luteal-like structures, synthesizing reduced progesterone levels and failing in supporting pseudopregnancy. Progesterone synthesis was affected by the lack of Nr5a2 through the downregulation of the cholesterol transport-related genes, Scarb1, StAR and Ldlr, as shown by qPCR. The cumulus-oocyte complexes of superstimulated Nr5a2Cyp19-/- immature females underwent expansion in vivo, but ovulation was disrupted, likely due to the downregulation of the progesterone receptor (Pgr) gene. An in vitro cumulus expansion assay showed defective cumulus expansion in Nr5a2Amhr2-/- associated with a dysregulation in the gap junction alpha-1 (Gja1; Cx43). In vitro cumulus expansion in Nr5a2Cyp19-/- was less affected than in Nr5a2Amhr2-/- cumulus-oocyte complexes. Data from qPCR showed a downregulation in the gene expression of Areg, Ereg, Btc and Tnfaip6 in both knockout ovarian cells at 2 h and 4 h post hCG. We found that 85% of the oocytes in both mutant genotypes can undergo germinal vesicle breakdown, confirming their capability to mature in vivo. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) showed the oocytes in both mutant models to be fertilizable and 70% of the resulting embryos proceeded to a blastocyst stage, independent of the genotype. In conclusion, Nr5a2 regulates female fertility along the entire process of the follicular development. Nr5a2 is shown to be essential for luteinization and its disruption in ovarian somatic cells does not compromise oocyte fertilizability. In overview, we provided a novel and comprehensive investigation, using multiple models and techniques to determine the mechanisms by which Nr5a2 regulates the important processes of cumulus expansion, ovulation and formation of the corpus luteum.

Le facteur de transcription E4F1 fût initialement identifié comme une cible cellulaire de l'oncoprotéine virale E1A au cours de l'infection par l'adénovirus sérotype V. E4F1 est une protéine multifonctionelle essentielle au cours du développement embryonnaire précoce et joue des rôles importants dans l'équilibre entre prolifération/survie de différents types cellulaires, notamment des cellules souches. Au niveau moléculaire, E4F1 possède des activités transcriptionelles intrinsèques mais possède également une activité ubiquitine E3 ligase atypique dirigée contre d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeur p53. Récemment, il a été démontré qu'E4F1 régule les voies oncogéniques impliquant p53 et Rb qui jouent un rôle essentiel au cours de la sénescence cellulaire. La sénescence, qui est définie par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, est considéré comme un mécanisme suppresseur de tumeurs essentiel au cours des phases précoces du développement tumoral. L'objectif de ma thèse a été d'évaluer le rôle d'E4F1 au cours de la sénescence cellulaire. Au travers d'études menées sur des fibroblastes humains primaires et des fibroblastes embryonnaires murins dérivés de souris génétiquement modifiées pour le gène E4F1, j'ai examiné comment la perturbation des activités d'E4F1 module l'initiation ou le maintien de la sénescence prématurée induit par l'oncogène RAS, la déplétion du membre de la famille polycomb Bmi1, ou par les dommages à l'ADN. Mes résultats suggèrent que la déplétion d'E4F1 protège partiellement contre l'induction de la sénescence alors que l'expression ectopique d'E4F1 accélère la sénescence par son implication dans la voie INK4A/ARF-p53. L'ensemble de mes résultats supportent la notion qu'E4F1 est un régulateur important de la sénescence cellulaire. / E4F1 was originally identified as a cellular target of the viral oncoprotein E1A during adenoviral infection. E4F1 is a multifunctional protein that is essential during early embryogenesis and plays important roles in the proliferation/survival balance of different cell types including stem cells. At the molecular level, E4F1 exhibits intrinsic transcriptional activities but also an ubiquitin E3 ligase function that targets other transcription factors, including the p53 tumor suppressor. Recent studies indicate that E4F1 impinge on several pathways, including the Rb and p53 pathways, that are known to influence cellular senescence, an irreversible state of cell cycle arrest that is considered to be an essential tumor suppressor mechanism during early steps of tumorigenesis. The objective of my thesis was to evaluate the roles of E4F1 during cellular senescence. Using human primary fibroblasts and mouse embryonic fibroblasts derived from genetic ally engineered mouse models, I investigated how perturbations of E4F1 activities modulated the initiation or the maintenance of premature senescence induced by oncogenic Ras, depletion of the polycomb member Bmi1 or DNA damage. My results suggest that E4F1 depletion partly protects from the induction of cellular senescence whereas ectopic expression of E4F1 accelerates premature senescence through its implication in the Ink4a/ARF-p53 pathway. Altogether, my results support the notion that E4F1 is an important regulator of cellular senescence.

Le récepteur nucléaire Nr5a2 est exprimé dans l’ovaire, plus spécifiquement dans les cellules de granulosa et lutéales. Une déplétion conditionnelle de Nr5a2 dans les cellules de granulosa au stade de follicule primaire par croisement de souris Nr5a2-flox et Amhr2-Cre (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) génère des problèmes au niveau de l’expansion du cumulus, de l’ovulation et de la lutéinisation. Ainsi, nous estimons que Nr5a2 régule les connexions intercellulaires dans le follicule ovarien via la connexine 43 (Cx43), une protéine de jonction impliquée dans l’expansion du cumulus. Le premier objectif de l’étude était de déterminer si l’absence d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO est liée à l’absence de communication intercellulaire adéquate entre les cellules de granulosa et de cumulus dans les follicules préovulatoires. À cette fin, des ovaires de souris immatures Amhr2Cre-cKO et non transgéniques ont été prélevés (n=3) après un traitement de superstimulation utilisant les gonadotropines eCG suivie de hCG afin d’induire l’ovulation. Nous avons ainsi démontré, par RT-PCR, une sous-expression de Cx43 avant et au moment du stimulus ovulatoire (0 h et 2 h) chez le groupe Amhr2Cre-cKO (P<0.01), ce qui pourrait mener à un problème dans l’acquisition de la compétence développementale de l’oocyte. D’un autre côté, au moment de l’ovulation (12 h), l’ARNm de Cx43 est surexprimé dans le groupe Amhr2Cre-cKO, ce qui pourrait prévenir les cellules du cumulus de se détacher l’une de l’autre. Nous avons ainsi conclu que Cx43 est un gène sous le contrôle de Nr5a2 et qu’une régulation erronée de ce gène est une cause possible du problème d’expansion du cumulus chez les souris Amhr2Cre-cKO. Afin d’examiner le rôle de Nr5a2 dans l’ovulation et la lutéinisation à différents stades de la maturation folliculaire, nous suggérons que Nr5a2 module la séquence temporelle des événements menant à l’ovulation. En croisant des souris Nr5a2-flox et Cyp19-Cre (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), l’expression de Nr5a2 a été interrompue dans les cellules de granulosa des follicules antraux et préovulatoires. Aucune portée n’a été obtenue de ces souris (n=4) durant un essai d’accouplement de 6 mois. Chez les souris Cyp19Cre-cKO on remarque la présence de structures s’apparentant à des cellules de type lutéales et les femelles âgées d’un an présentent des kystes folliculaires hémorragiques et une hypertrophie de l’épithélium en surface de l’ovaire. Les deux modèles transgéniques démontrent donc une absence de l’expansion du cumulus et de l’ovulation. En conclusion, Nr5a2 semble réguler différemment la folliculogenèse et l’ovulation dans les cellules de granulosa des follicules primaires et antraux. / The nuclear receptor Nr5a2 is expressed in the ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Conditional disruption of Nr5a2 in granulosa cells beginning with primary follicles by means of Nr5a2-floxed and Amhr2-Cre mice (Nr5a2f/fAmhr2Cre/+) results in failure in cumulus expansion, ovulation and luteinization. We hypothesize that Nr5a2 regulates intercellular connections in ovarian follicles through connexin 43 (Cx43), a gap-junctional protein related to cumulus expansion. The first objective of this study was to determine whether the lack of cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO mice is related to the absence of normal cell-to-cell communication in cumulus/granulosa cells of preovulatory follicles. To address this, immature ovaries of Amhr2Cre-cKO and non-transgenic littermates mice were collected (n=3) after superstimulation to induce follicle development and ovulation. Using RT-PCR, the Cx43 mRNA levels were shown to be downregulated prior to and at the time of the ovulatory stimulus (0 h and 2 h) in the Amhr2Cre-cKO group (P<0.01), which may lead to the failure in the acquisition of oocyte developmental competence. On the other hand, by the time of ovulation (12 h), mRNA levels of Cx43 are upregulated in Amhr2Cre-cKO group, which may prevent the cumulus cells to detach one from another. We conclude that Cx43 is one of the downstream genes under Nr5a2 control and its dysregulation can be one reason for the defect in cumulus expansion in Amhr2Cre-cKO females. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization in different stages of the follicle maturation, we hypothesized that Nr5a2 modulates the events leading to ovulation in a temporal sequence. By crossing Nr5a2-floxed and Cyp19-Cre mice (Nr5a2f/fCyp19Cre/+), Nr5a2 was disrupted in granulosa cells of antral and preovulatory follicles. No litters were born to Cyp19Cre-cKO females (n=4) during a 6 months breeding trial. Cyp19Cre-cKO enabled the development of a luteal-like structure, and 1-year-old females presented hemorrhagic follicular cysts and hypertrophic ovarian surface epithelium. Both knockout models display lack of cumulus expansion and ovulation. We conclude that Nr5a2 differentially regulates folliculogenesis and ovulation in granulosa cells of small and antral follicles.

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune. / The nuclear receptor Nr5a2, also known as liver receptor homolog-1 (Lrh-1), is expressed in the mouse ovary, exclusively in granulosa and luteal cells. Granulosa-specific disruption of Nr5a2 in mice from primary follicles onward in the follicle development trajectory has shown that Nr5a2 is a key regulator of ovulation and female fertility. We hypothesized that Nr5a2 modulates peri- and post-ovulatory events in a temporal sequence during folliculogenesis. To examine the role of Nr5a2 in ovulation and luteinization at different stages of the follicular development, we generated two Nr5a2 granulosa-specific knockout mice models: 1) Nr5a2Amhr2-/-, with Nr5a2 depletion from primary follicles forward; and 2) Nr5a2Cyp19-/-, with Nr5a2 depletion from the antral stage of development forward. The lack of Nr5a2 beginning in antral follicles resulted in infertility in Nr5a2Cyp19-/- females, with ovaries displaying non-functional luteal-like structures, synthesizing reduced progesterone levels and failing in supporting pseudopregnancy. Progesterone synthesis was affected by the lack of Nr5a2 through the downregulation of the cholesterol transport-related genes, Scarb1, StAR and Ldlr, as shown by qPCR. The cumulus-oocyte complexes of superstimulated Nr5a2Cyp19-/- immature females underwent expansion in vivo, but ovulation was disrupted, likely due to the downregulation of the progesterone receptor (Pgr) gene. An in vitro cumulus expansion assay showed defective cumulus expansion in Nr5a2Amhr2-/- associated with a dysregulation in the gap junction alpha-1 (Gja1; Cx43). In vitro cumulus expansion in Nr5a2Cyp19-/- was less affected than in Nr5a2Amhr2-/- cumulus-oocyte complexes. Data from qPCR showed a downregulation in the gene expression of Areg, Ereg, Btc and Tnfaip6 in both knockout ovarian cells at 2 h and 4 h post hCG. We found that 85% of the oocytes in both mutant genotypes can undergo germinal vesicle breakdown, confirming their capability to mature in vivo. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) showed the oocytes in both mutant models to be fertilizable and 70% of the resulting embryos proceeded to a blastocyst stage, independent of the genotype. In conclusion, Nr5a2 regulates female fertility along the entire process of the follicular development. Nr5a2 is shown to be essential for luteinization and its disruption in ovarian somatic cells does not compromise oocyte fertilizability. In overview, we provided a novel and comprehensive investigation, using multiple models and techniques to determine the mechanisms by which Nr5a2 regulates the important processes of cumulus expansion, ovulation and formation of the corpus luteum.