Le facteur de transcription E4F1 fût initialement identifié comme une cible cellulaire de l'oncoprotéine virale E1A au cours de l'infection par l'adénovirus sérotype V. E4F1 est une protéine multifonctionelle essentielle au cours du développement embryonnaire précoce et joue des rôles importants dans l'équilibre entre prolifération/survie de différents types cellulaires, notamment des cellules souches. Au niveau moléculaire, E4F1 possède des activités transcriptionelles intrinsèques mais possède également une activité ubiquitine E3 ligase atypique dirigée contre d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeur p53. Récemment, il a été démontré qu'E4F1 régule les voies oncogéniques impliquant p53 et Rb qui jouent un rôle essentiel au cours de la sénescence cellulaire. La sénescence, qui est définie par un arrêt irréversible du cycle cellulaire, est considéré comme un mécanisme suppresseur de tumeurs essentiel au cours des phases précoces du développement tumoral. L'objectif de ma thèse a été d'évaluer le rôle d'E4F1 au cours de la sénescence cellulaire. Au travers d'études menées sur des fibroblastes humains primaires et des fibroblastes embryonnaires murins dérivés de souris génétiquement modifiées pour le gène E4F1, j'ai examiné comment la perturbation des activités d'E4F1 module l'initiation ou le maintien de la sénescence prématurée induit par l'oncogène RAS, la déplétion du membre de la famille polycomb Bmi1, ou par les dommages à l'ADN. Mes résultats suggèrent que la déplétion d'E4F1 protège partiellement contre l'induction de la sénescence alors que l'expression ectopique d'E4F1 accélère la sénescence par son implication dans la voie INK4A/ARF-p53. L'ensemble de mes résultats supportent la notion qu'E4F1 est un régulateur important de la sénescence cellulaire. / E4F1 was originally identified as a cellular target of the viral oncoprotein E1A during adenoviral infection. E4F1 is a multifunctional protein that is essential during early embryogenesis and plays important roles in the proliferation/survival balance of different cell types including stem cells. At the molecular level, E4F1 exhibits intrinsic transcriptional activities but also an ubiquitin E3 ligase function that targets other transcription factors, including the p53 tumor suppressor. Recent studies indicate that E4F1 impinge on several pathways, including the Rb and p53 pathways, that are known to influence cellular senescence, an irreversible state of cell cycle arrest that is considered to be an essential tumor suppressor mechanism during early steps of tumorigenesis. The objective of my thesis was to evaluate the roles of E4F1 during cellular senescence. Using human primary fibroblasts and mouse embryonic fibroblasts derived from genetic ally engineered mouse models, I investigated how perturbations of E4F1 activities modulated the initiation or the maintenance of premature senescence induced by oncogenic Ras, depletion of the polycomb member Bmi1 or DNA damage. My results suggest that E4F1 depletion partly protects from the induction of cellular senescence whereas ectopic expression of E4F1 accelerates premature senescence through its implication in the Ink4a/ARF-p53 pathway. Altogether, my results support the notion that E4F1 is an important regulator of cellular senescence.

La protéine E4F1 a été identifiée comme une cible cellulaire de l'onco-protéine virale E1A au cours de l'infection par l'adénovirus de type V. Bien que très peu étudiée jusqu'à présent, les travaux du laboratoire d'accueil indiquent cependant qu'E4F1 est une protéine multifonctionnelle ayant à la fois un rôle de facteur de transcription mais fonctionnant également comme une E3 ligase vis-à-vis d'autres régulateurs transcriptionnels tels que les membres de la famille p53. E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation fréquemment altérées au cours de la progression tumorale, notamment les voies impliquant les suppresseurs de tumeurs Rb et p53. In vivo, E4F1 est impliqué dans l'homéostasie des cellules souches à travers différents mécanismes encore non élucidés. L'objectif de mon projet de thèse est d'identifier et de caractériser les voies de signalisation impliquant E4F1 dans l'homéostasie des cellules souches. Pour répondre à cette question, j'utilise diverses techniques : Histologie, IHC,FACS, QPCR et des tests clonogénique sur des cellules issues des épidermes de souris E4F1 WT et KO. / E4F1 protein has been first identified in the 80's as a cellular target of the adenoviral oncoprotein E1A. E4F1 is an atypical multifunctional protein with two different activities. In fact, it can acts as a transcriptional factor thanks to its DNA binding domain and exhibits either positive or negative transcriptional activities depending on the promoter context. In addition to its transcriptional activities, E4F1 is also an atypical E3-ligase for other transcription factors, including the p53 tumor suppressor. A growing body of evidence suggests that the multifunctional protein E4F1 is involved in signaling pathways that play essential roles during normal development and tumorigenesis. Moreover, we have shown that skin defect is one of the most striking phenotype of E4F1 conditional knockout mice. E4F1 inactivation in the entire skin or in the basal compartment of the epidermis (K5 specific knockout mice) induces skin homeostasis defects, as evidenced by transient hyperplasia in the interfollicular epithelium and alteration of keratinocyte differentiation, followed by loss of cellularity in the epidermis and severe skin ulcerations. E4F1 depletion alters clonogenic activity of epidermal stem cells (ESCs) ex vivo and ends in exhaustion of the ESC pool in vivo, indicating that the lesions observed in the E4F1 mutant skin result, at least in part, from cell-autonomous alterations in ESC maintenance. The clonogenic potential of E4F1 KO ESCs is partially rescued by Bmi1 overexpression, or by Ink4a/Arf overexpression or p53 depletion. In additions, in vivo, skin phenotype of E4F1 KO mice is also delayed in animals with Ink4a/Arf and E4F1 compound gene deficiencies. Taking together, our data show the essential role of E4F1 protein into Bmi1-Arf-p53 pathway to regulate ESC-dependent skin homeostasis.

E4F1 est un facteur de transcription liant l'ADN, exprimé de façon ubiquitaire par tous les tissus, et qui possède une activité E3 ubiquitine ligase atypique dirigée contre le suppresseur de tumeur p53. La protéine E4F1 interagit directement avec plusieurs suppresseurs de tumeurs cellulaires et des oncogènes viraux (p53, pRb, DRAL, RASSF1A, p19ARF, BMI1, HBX et GAM1...), suggérant qu’elle est elle-même impliquée dans la tumorigenèse. La perte d’E4F1 dans des fibroblastes embryonnaires (Mefs) transformés ou dans des cellules de sarcomes histiocytaires déficientes pour la voie p53, entraine la mort de ces cellules. La même inactivation d'E4F1 dans les cellules normales n'affecte pas leur survie mais entraine un arrêt de prolifération. Des analyses transcriptomiques et de liaison à l'ADN à l'échelle du génome entier (ChIP-seq et analyses différentielles des transcriptomes de cellules E4F1 WT et KO) nous ont permis d’identifier une centaine de gènes liés et régulés directement par E4F1. Ces gènes codent notamment pour des protéines mitochondriales impliquées dans le métabolisme et l'homéostasie de cette organelle, dont plusieurs composants et régulateurs de l'enzyme multimérique, pyruvate déshydrogénase. Un second groupe de gênes cibles d’E4F1 est impliqué dans la réponse aux dommages à l'ADN, dont le gène codant pour la kinase CHK1 qui joue un rôle essentiel dans le contrôle de la stabilité du génome. En accord avec la fonction de ces gènes cibles, la perte d’E4F1 entraine des perturbations du métabolisme cellulaire et des checkpoints de réponse aux stress génotoxiques. Dans les cellules déficientes pour la voie p53, ces perturbations conduisent à des stress oxydatifs (surproduction de ROS mitochondriaux) et énergétiques, suivis de dommages aux protéines et à l'ADN, et in fine, à une mort cellulaire massive. Dans les cellules compétentes pour la voie p53 ces altérations sont fortement atténuées et conduisent à un arrêt de la prolifération. Une partie des effets protecteurs de p53 est due à sa capacité à stimuler l'expression du gène ALDH4a1 qui code pour une aldehyde dehydrogenase impliquée dans le catabolisme de la proline et dont l'activité possède des propriétés anti-oxydantes.Mes travaux mettent également en évidence que le niveau d'expression de la protéine E4F1 et son activité augmentent lors de la transformation cellulaire ainsi qu'en réponse à des stress énergétiques, génotoxiques ou oxydatifs. Dans ces trois dernières conditions, la phosphorylation d'E4F1 est également augmentée au niveau de plusieurs sérines qui ont été identifiées par spectrométrie de masse. En résumé, tous ces éléments indiquent qu'E4F1 est un acteur important du contrôle de l'homéostasie métabolique et de la réponse aux stress, particulièrement essentiel pour la survie des cellules cancéreuses déficientes pour la voie p53. Mes observations suggèrent également qu'E4F1 est activé en réponse à différents stress et qu'il pourrait jouer un rôle essentiel dans la capacité des cellules cancéreuses à s'adapter aux multiples stress environnementaux auxquels elles sont exposées au cours de la tumorigenèse. / The ubiquitously expressed E4F1 protein acts as a transcription factor that binds a consensus DNA sequence at promoters, and as an atypical E3-ligase for the tumor suppressor p53. E4F1 physically interacts with several bona fide cellular tumor suppressors and viral oncoproteins (including p53, pRb, DRAL, RASSF1A, p19ARF, BMI1, HBX and GAM1...), suggesting that it might itself be involved in tumorigenesis. E4F1 genetic inactivation in transformed mouse embryo fibroblasts (Mefs) and in hematopoietic tumors deficient for the p53 pathway, results in massive cell death. Importantly, inactivation of E4F1 in normal cells does not affect cell survival. Genome wide approaches (ChIP-seq profiling and comparative transcriptomics performed on E4F1 WT and KO cells) identified a limited list (100) of genes that are bound and directly regulated by E4F1. Several E4F1 target genes code for mitochondrial proteins involved in mitochondria metabolism and homeostasis, including several components of the pyruvate dehydrogenase complex. Another set of E4F1 target genes codes for factors involved in DNA repair and damage checkpoints, including the checkpoint kinase CHK1. Accordingly, both mitochondrial and checkpoint functions are altered in E4F1 KO cells. In proliferating cells deficient for the p53 pathway, these defects lead to energetic and oxidative stresses, protein and DNA damages, and in fine, massive cell death. In p53-proficient cells, these alterations are attenuated and lead to growth arrest. Part of this protective effect of p53 is mediated by ALDH4a1, a p53 target gene encoding an aldehyde dehydrogenase involved in proline catabolism and that exhibits antioxidant properties.In this thesis, I also demonstrate that E4F1 protein level and activity is increased during cell transformation and upon exposure to genotoxic, energetic or oxidative stresses. These stresses also lead to E4F1 phosphorylation at specific serine residues that were identified by mass spectrometry. All together this work shows that E4F1 controls cellular functions that are important for mammalian cells metabolic homeostasis and stress responses, and that are essential for the survival of p53-deficient cancer cells. This work also suggests that E4F1 is activated in response to various stresses and therefore, that it could play an essential role in allowing cancer cells to adapt to environmental stresses.

L’étude des réseaux protéiques perturbés au cours de l’infection par les petits virus oncogéniques amena, vers la fin des années 80, à la découverte de nombreux régulateurs clés de la division et de la survie cellulaire. Parmi ceux-ci, la protéine E4F1 fût initialement identifiée comme une cible de l’oncoprotéine virale E1A. Originellement identifié comme un facteur de transcription, E4F1 est également une ubiquitine-E3 ligase atypique pour d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeurs p53. Au travers de ses multiples activités, E4F1 est nécessaire à la prolifération des cellules somatiques et souches, et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, les travaux de différents laboratoires dont le mien suggèrent qu’E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation qui sont fréquemment altérées au cours de l’oncogenèse, et notamment la voie impliquant le suppresseur de tumeurs p53. Afin d’étudier les fonctions physiologiques in vivo d’E4f1, mon laboratoire d’accueil a développé plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées. La caractérisation de ces modèles a permis de mettre en évidence un rôle majeur d'E4F1 dans l'homéostasie de la peau. Plus précisément, E4F1 régule le pool de cellules souches de l'épiderme au travers de son rôle dans une voie de signalisation qui implique la protéine p53 et deux de ces régulateurs en amont: Arf et Bmi1. Cependant, il semble que les effets d'E4F1 dans le contrôle du maintien des cellules souches s'étendent au delà de son rôle sur cette voie de signalisation. En effet, j'ai récemment pu démontrer qu'E4F1, au travers de ces fonctions transcriptionnelles, régule directement l'expression d'un sous-groupe de gènes impliqués dans la régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH). La PDH est un complexe multimérique situé dans la mitochondrie qui catalyse la décarboxylation du pyruvate (le produit final de la glycolyse) en acétyl coenzyme A (AcCoA), liant ainsi le métabolisme du pyruvate au cycle de Krebs. J’ai pu montrer que l’inactivation d’E4f1 spécifiquement dans l'épiderme conduisait à une diminution importante de l’activité de PDH et à une reprogrammation métabolique de ces cellules. Cette reprogrammation a pour conséquence d'altérer le micro-environnement des cellules souches qui conduit à leur détachement de leur niche et aboutit in fine à une absence du renouvellement de l'épiderme. Cette partie de mes travaux a donc permis d'illustrer pour la première fois l'importance du métabolisme du pyruvate dans l'homéostasie des cellules souches de la peau. Sur la base de ces résultats, je poursuis l'analyse des fonctions d’E4f1 dans l'homéostasie de la peau en étudiant son rôle dans d'autres types cellulaires tels que les mélanocytes. / The multifunctional protein E4F1 is an essential regulator of normal skin homeostasis. During my Phd, I demonstrated that E4f1 inactivation in adult skin results in stem cell autonomous defects causing exhaustion of the epidermal stem cell (ESC) pool. At the molecular level, I identified E4F1 as a new regulator of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in keratinocytes, an essential mitochondrial complex that converts pyruvate into Acetyl-CoEnzyme A. Using genetically engineered mouse models, I showed that E4F1-mediated control of PDH activity is required to maintain normal skin homeostasis. Consistently, E4F1 deficiency in basal keratinocytes resulted in deregulated expression of dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), a gene encoding the E2 subunit of the PDC, and impaired PDH activity. The metabolic reprogramming of E4f1 KO keratinocytes associated with the redirection of the glycolytic flux towards lactate production and increased lactate secretion in their microenvironment, leading to enhanced activity of extra-cellular-matrix remodelling proteases Finally, these defects ended in alterations of the basement membrane, ESC mislocalization and the exhaustion of the ESC pool. In the second part of my thesis, I have evaluated the role of E4F1-mediated control of the PDC in melanocytes and showed that the metabolic activities of E4F1 are important for melanocyte function. Consistently, mice with E4f1-deficient melanocytes exhibited hair graying and skin pigmentation defects. Altogether, my data demonstrate the importance of E4f1-mediated control of pyruvate metabolism for normal skin homeostasis.

La protéine multifonctionnelle E4F1 fut initialement identifiée comme une cible de l'oncoprotéine virale E1A au cours de l'infection par l'adénovirus. Nos données, ainsi que celles d'autres laboratoires, montrent qu'E4F1 intervient à de multiples niveaux de régulation de la voie p53, une voie de signalisation très fréquemment inactivée au cours de la tumorigenèse. Au cours de ma thèse, j'ai mis en évidence et caractérisé un nouveau niveau de régulation impliquant la protéine E4F1 et un autre régulateur important de la voie p53 : l'oncoprotéine Mdm2. Mes travaux ont permis de montrer, pour la première fois, qu'E4F1 et Mdm2 sont présents dans un même complexe multiprotéique associé à la chromatine et dont le recrutement est indépendant de p53. La formation du complexe E4F1-Mdm2 est sous la dépendance de certains stress cellulaires, telle que la réponse aux stress oxydatifs. De plus, Mdm2 et E4F1 sont capables de s'ubiquitinyler mutuellement sans promouvoir leur protéolyse. Nos résultats préliminaires suggèrent que ce complexe chromatinien Mdm2-E4F1 est impliqué dans le contrôle d'un programme transcriptionnel apparenté à une réponse au stress oxydatif. L'ensemble de ces données suggère des fonctions de Mdm2 au niveau de la chromatine, indépendantes de sa fonction bien décrite de régulateur du suppresseur de tumeur p53. / E4F1 is a multifunctional protein that was first identified as a cellular target of the viral oncoprotein E1A during adenoviral infection. We, and others, have shown that E4F1 impinges at different level of the p53 pathway, which is frequently inactivated during tumorigenesis. During my PhD, I have highlighted and characterized a novel level of regulation implicating E4F1 and an other key regulator of the p53 pathway: the Mdm2 oncoprotein.My work have shown for the first time that Mdm2 and E4F1 directly interact in a same multiprotein complex associated with chromatin, and this recruitment occurs independently of p53. The Mdm2-E4F1 complex formation is dependant of some cellular stresses, such as oxidative stresses reponses. Our preliminary data also indicate that E4F1 and Mdm2 ubiquitylate each other without promoting their proteolysis, and influence their stability on chromatin. Our preliminary results indicate that this Mdm2-E4F1 chromatinian complex is involved in the regulation of a transcriptional program dependant of oxidative stresses. These data support the notion that Mdm2 presents unexpected functions on chromatin, independently of its very well described p53 regulation.

La protéine E4F1 découverte comme cible cellulaire de l'oncoprotéine adénovirale E1A est une protéine ubiquitaire agissant comme facteur de transcription et comme E3-ligase atypique. La protéine E4F1 interagit également directement avec plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs et des oncoprotéines, suggérant son implication dans la tumorigénèse. Des travaux antérieurs du laboratoire, sur les fonctions cellulaires d’E4F1 dans les cellules cancéreuses ont montré que sa déplétion entraîne une mort cellulaire massive dans les Mefs transformés déficients en p53. De plus, E4F1 contrôle directement l'expression de 38 gènes, notamment impliqués dans le métabolisme cellulaire et les checkpoints du cycle cellulaire/Réponse aux dommages de l'ADN (DDR), tel que Chek1 qui code un composant majeur du checkpoint ATR/ATM. Conformément à ce rôle d’E4F1 dans la survie des cellules cancéreuses chez la souris, des patientes atteintes d'un cancer du sein triple négatif (TNBC) exprimant fortement E4F1 présentent une survie sans rechute (RFS) plus faible.Nous avons donc décidé d’étudier pour la première fois le programme transcriptionnel d’E4F1 dans les cellules humaines et d’explorer son rôle dans la survie des cellules de TNBC, avec une attention particulière pour son rôle dans la réponse aux agents de chimiothérapie.Les transcriptomes (RNAseq) de cellules SUM159 de TNBC montrent, lors de la déplétion d’E4F1, une diminution de l’expression de 147 des 276 gènes associés à la DDR. La combinaison de RNAseq et de ChIPseq révèle qu’E4F1 régule directement 57 gènes dans les cellules de TNBC humaines. Parmi ces gènes, E4F1 lui-même, CHEK1, mais aussi TTI2 et PPP5C codant pour des régulateurs post-transcriptionnels de l'axe ATM/ATR-CHK1, et définissant ainsi un "régulon" ATM/ATR-CHK1, encore inconnu et dépendant d’E4F1. TTI2 forme avec TELO2 et TTI1, le complexe TTT nécessaire au repliement correct et à la stabilité des protéines de la famille PIKK, telles qu’ATR et ATM. La phosphatase PPP5C est impliquée dans l'activation de la signalisation ATR-CHK1. Fait important, nous montrons qu’E4F1 se fixe sur et régule probablement ces trois gènes in vivo dans des tumeurs TNBC dérivées de patientes (PDTX). Dans la lignée SUM159 et les PDTX, le recrutement d’E4F1 sur ces gènes est augmenté lors du traitement avec la Gemcitabine, un agent de chimiothérapie bloquant la réplication de l’ADN. Étonnamment, nous avons révélé qu’E4F1 contrôle aussi indirectement l'expression de TELO2, un second membre du complexe TTT. Par conséquent, dans les cellules TNBC déplétées en E4F1, les taux de protéines des CHK1, TTI2, TELO2 mais aussi des kinases ATM/ATR, sont fortement diminués, entraînant une déficience de la DDR. Ainsi, les cellules SUM159 déplétées en E4F1 ne parviennent pas à s'arrêter en phase S lors du traitement à la Gemcitabine et sont hautement sensibilisées à cet agent de chimiothérapie, ainsi qu'à d'autres agents endommageant l'ADN comme le Cisplatine. Dans leur ensemble, mes travaux de thèse révèlent que la voie de signalisation ATM/ATR-CHK1, et la réponse au stress / dommages de l'ADN sont étroitement contrôlées aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel par E4F1. E4F1 apparait donc comme un acteur central dans la survie cellulaire des cellules TNBC, en particulier lorsqu'elles sont exposées à des agents endommageant l'ADN ou à des agents de chimiothérapie. Ainsi E4F1 pourrait représenter un marqueur pronostique de réponse à la chimiothérapie et une cible thérapeutique potentielle. / The E4F1 protein discovered as the cellular target of the adenoviral oncoprotein E1A is a ubiquitous protein acting both as a transcription factor and as an atypical E3-ligase. E4F1 protein also interacts directly with several cellular tumor suppressors and oncoproteins, suggesting its involvement in tumorigenesis. Previous laboratory work on the cellular functions of E4F1 in cancer cells has shown that its depletion leads to massive cell death in transformed Mefs deficient in p53. In addition, E4F1 directly controls the expression of 38 genes, including genes involved in cell metabolism and cell cycle checkpoints/DNA Damage Response (DDR), such as Chek1 that encodes a major component of the ATR/ATM checkpoint. Consistent with this role of E4F1 in cancer cell survival in mice, patients with triple-negative breast cancer (TNBC) with high E4F1 expression exhibit a poorer relapse free survival (RFS).We therefore aimed to study for the first time the transcriptional program of E4F1 in human cells and explore its role in the survival of TNBC cells, with particular focus on its role in the response to chemotherapy agents.Transcriptomes (RNAseq) of SUM159 TNBC cells show, when E4F1 is depleted, a decrease in expression of 147 out of 276 DDR-associated genes. The combination of RNAseq and ChIPseq shows that E4F1 directly regulates 57 genes in human TNBC cells. Among these genes, E4F1 itself, CHEK1, but also TTI2 and PPP5C coding for post-transcriptional regulators of the ATM/ATR-CHK1 axis, and thus defining an ATM/ATR-CHK1 "regulon", undescribed and E4F1-dependent. TTI2 composes with TELO2 and TTI1, the TTT complex required for the correct folding and stability of PIKK family proteins, such as ATR and ATM. PPP5C phosphatase is involved in the activation of ATR-CHK1 signaling. Importantly, we show that E4F1 binds to and probably regulates these three genes in vivo in Patient Derived TNBC Xenografts (PDTX). In both SUM159 cells and PDTX, the recruitment of E4F1 on these genes is increased upon Gemcitabine treatment, a chemotherapy agent that impairs DNA replication. Surprisingly, we found that E4F1 also indirectly controls the expression of TELO2, a second member of the TTT complex. Consequently, in TNBC cells depleted of E4F1, the protein levels of CHK1, TTI2, TELO2 but also ATM/ATR kinases, are significantly decreased, leading to DDR deficiency. Thus, SUM159 cells depleted of E4F1 fail to stop in phase S during Gemcitabine treatment and are highly sensitized to this chemotherapy agent, as well as other DNA damaging agents such as Cisplatin. Altogether, my thesis results demonstrate that the ATM/ATR-CHK1 signaling pathway, and the response to stress / DNA damage are tightly controlled at the transcription and post-transcription levels by E4F1. E4F1 therefore appears to be a central actor in the cellular survival of TNBC cells, particularly when exposed to DNA-damaging agents or chemotherapy agents. Thus, E4F1 could represent a prognostic marker for chemotherapy response and a potential therapeutic target.