Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs en anglais) représentent la famille de récepteurs intégrales de membrane plus vaste dans la majorité des cellules eucaryotes. Ils jouent un rôle clé dans la transduction de signal, ainsi que la compréhension de leur mécanisme de signalisation représente une des questions principales dans la biologie d'aujourd'hui. Dans la caractérisation du paysage énergétique de ces récepteurs à l'échelle atomique, les structures cristallographiques publiées pendant la décennie dernière par cristallographie aux rayons X représentent la percée scientifique majeure et donnent une contribution fondamentale dans la biologie structurelle de GPCRS. Ces structures représentent un point de départ précieux dans la compréhension du mécanisme de transduction de signal, en plaçant des structures dans l'ensemble conformationnel de ces récepteurs le long du processus d'activation. Pour compléter ce cadre de structures statiques qui correspondent aux états à basse l'énergie et fortement peuplés, une caractérisation de l'ensemble conformationnel et des barrières cinétiques qui sont associées est un point nécessaire et fondamentale. À ce but nous proposons une approche innovant avec la finalité d'observer le paysage conformationnel dynamique des GPCR et étudier la modulation de ces récepteurs par des ligands et des lipides, qui sont connus pour jouer un rôle clé dans la structure et les fonctions des protéines de membrane (e.g.). Un des outilles le plus approprié pour explorer les barrières cinétiques de GPCR c'est la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. Pour tirer profit au mieux de cette technique, nous avons utilisé des sondes marqués 13CH3 immergées dans un environnement perdeuteré, qui constitue le marquage isotopique le plus approprié en RMN pour examiner les paysages conformationnels des protéines de grosses dimensionnes ou des complexes de protéines. Nous avons choisi Escherichia coli comme système d'expression pour sa capacité de pousser dans des conditions très hostiles comme des solutions 100%-D2O. Pour surmonter les difficultés habituellement rencontrées lors de l'expression des GPCRs, nous avons appliqué un protocole innovant qui cible l'expression de GPCRs directement aux corps d'inclusion. Ceci permet la production des bonnes quantités de protéines (jusqu’à 6 mg/litres de culture de pur 13CH3-u-2H-GPCRs). Une fois purifié, le récepteur est foldé en amphipols et transféré ensuite à une double couche lipidique appelée nanometric lipid bilayer ou nanodisc (NLB). De façon très important, les mesures pharmacologiques quantitatives indiquent que les récepteurs incorporés dans des NLBs après ce protocole sont stables et entièrement actifs dans les conditions des expériences de NMR.Les investigations par RMN conduites sur le GPCR en NLB ont donné lieu à une résolution jamais obtenue dans le domaine, grâce à la biochimie finement accordée et à la perdeuteration du récepteur. Selon les données obtenues, notre récepteur modèle, le récepteur 2 pour le leukotriene B4 (BLT2), est capable d'explorer plusieurs conformations différentes, même dans l'état pas lié aux ligands, y compris l'état actif. Ce paysage conformationnel est également modulé par des ligands et des lipides. Dans le cas spécifiques, nous avons observé que un incrément dans le contenu de stérol dans la membrane modifie la distribution des différents états conformationnels du récepteur, en favorisant l'état actif, qui indique une régulation allosteric positif du stérol sur l'activation de ce récepteur, comme confirmé aussi par les mesures de liaison du GTP à la protéine G. Cette propriété du stérol est probablement importante pour le contrôle de mécanisme de signalisation de GPCRs. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of integral membrane protein receptors present in most eukaryotic cells. They play a key role in signal transduction and understanding their signalling mechanism represents one of the main issues in biology today. In the characterization of the energy landscape of these receptors, at the atomic scale, X-ray crystal atomic structures published during the last decade represent the major breakthrough and contribution in the structural biology of GPCRs. They represent a precious starting point in the understanding of the mechanism of signal transduction by placing structures in the conformational ensemble of these receptors along the activation pathway. To complete these static snapshots that correspond to low energy and highly populated states, a characterization of the whole conformational ensemble and associated kinetic barriers is fundamental to complete the picture. To this aim we proposed an innovative approach to observe GPCRs dynamic conformational landscape and how it is modulated by ligands and lipids, that are known to play a key role in membrane protein structures and functions (e.g.). One of the most appropriate tool to explore GPCR kinetic barriers is solution state NMR. To do so, we used 13CH3 probes immersed in a perdeuterated environment, the most appropriate isotope-labelling scheme to investigate conformational landscapes of large proteins or protein complexes with this spectroscopy. We chose Escherichia coli as expression system for its ability to grow in very hostile conditions like 100%-D2O solutions. In order to overcome the usual expression issues concerning GPCRs, we applied an innovative protocol which targets the expression directly to inclusion bodies. This allows the production of high amounts of proteins (up to 6 mg/litre of culture of pure 13CH3-u-2H-GPCRs). Once purified, receptors are folded in amphipols and then transferred to nanometric lipid bilayers or nanodiscs. Importantly quantitative pharmacological measurements indicate that receptors embedded in NLBs following this protocol are stable and fully active in the conditions of the NMR experiments. NMR investigation of a GPCR in a NLB gave rise to a resolution never achieved in the field thanks to a fine tuned biochemistry and a perdeuteration of the receptor. According to our data, the prototypical receptor, the leukotriene B4 receptor (BLT2), is able to explore multiple different conformations, even in the unliganded state, including the active state. This conformational landscape is further modulated by ligands and lipids. In particular, we observed that an increment in the sterol content of the membrane modifies the distribution of the different conformational states of the receptor in favour of the active one, indicating a positive allosteric regulation of the sterol on the activation of this receptor, as confirmed by GTP-to-G protein binding measurements. This property of the sterol is likely important for the control of the signalling properties of GPCRs.

La résonance magnétique nucléaire est une technique de choix pour étudier la dynamique de l'échange dans des composés à portée thérapeutique. Cependant, les spectres acquis avec les méthodes 1D et 2D classiques présentent souvent des recouvrements importants, ce qui rend l'attribution de chaque espèce en échange difficile. Le développement méthodologique d'une approche pure shift permettrait donc d'améliorer la résolution de ces données. Au cours de cette thèse, nous avons effectué une série de développements méthodologiques des expériences de type EXSY dans lesquelles nous avons mis en œuvre différentes méthodes de découplage homonucléaire. En particulier, deux approches ont été testées: la méthode PSYCHE appliqué aux dimensions F1 et F2 des cartes EXSY, et la méthode Zangger-Sterk en F2. Ces approches ont toutes mené à une amélioration significative de la résolution qui nous a permis de caractériser les deux conformères s-cis/s-trans du Trandolapril. Nous avons également étudié l’intérêt de la technique d'échantillonnage non-uniforme (NUS) du signal pour réduire le temps d'analyse. Cette approche nous a permis de gagner en temps d'analyse, mais la présence d'artefacts à certaines températures suggère que d'autres développements seront encore nécessaires. Ces résultats ouvrent la voie vers une analyse plus fine du processus d’échange dans des composés présentant un spectre RMN complexe. / Nuclear magnetic resonance is a technique of choice for studying chemical exchange in therapeutic compounds. However, spectra acquired with standard 1D and 2D methods often show spectra with overlapping signals, which makes the assignment of each species difficult. Methodological development of a pure shift approach would therefore make it possible to improve the resolution of these data. During this thesis, we carried out a series of developments of the EXSY type experiments in which we implemented different homonuclear decoupling methods. Two approaches were tested: the PSYCHE method applied to the F1 and F2 dimensions of EXSY maps, and the Zangger-Sterk method in F2. These approaches all led to a significant resolution improvements allowing us to characterize the s-cis/ s-trans conformers in Trandolapril. We have also studied the interest of the non-uniform sampling (NUS) technique to reduce the analysis time. This approach allowed us to accelerate the experiment, but the presence of artifacts at various temperatures suggests that further developments will still be needed. These results pave the way for more analysis of the exchange process in compounds with complex NMR spectrum.

L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel.

Les macromolécules biologiques sont, par essence, des systèmes dynamiques. Si l'importance de cette flexibilité est maintenant clairement établie, la caractérisation précise du désordre conformationnel de ces systèmes reste encore une question ouverte. La résonance magnétique nucléaire constitue un outil unique pour sonder ces mouvements au niveau atomique que ce soit par les études de relaxation de spin ou par l'analyse des couplages dipolaires résiduels. Ces derniers permettent d'étudier l'ensemble des mouvements ayant lieu à des échelles de temps plus rapide que la milliseconde, englobant ainsi les temps caractéristiques de nombreux mouvements physiologiquement importants. L'information contenue dans ces couplages résiduels est ici interprétée principalement grâce à des approches analytiques pour quantifier la dynamique présente dans des protéines repliées, déterminer l'orientation de ces mouvements et obtenir de l'information structurale au sein de ce désordre conformationnel. Ces approches analytiques sont complémentées par des méthodes numériques, permettant ainsi soit d'observer les phénomènes sous un autre angle, soit d'examiner d'autres systèmes tels que les protéines intrinsèquement désordonnées. L'ensemble de ces études laisse transparaître une importante complémentarité entre ordre structural et désordre conformationnel.

Les appariements d’ions sontomniprésents dans la nature, des océans auxaérosols, et passant par les organismes vivants.Les paires d’ions présentes dans les solutionsriches en ions y jouent un rôle crucial, notammentdans le déroulement des mécanismes réactionnelschimiques et biochimiques. En dépit de leurimportance, la caractérisation expérimentale despaires en solution reste problématique en raison dela coexistence de plusieurs types. Ainsi, le premierobjectif de ce travail est de développer uneapproche originale en phase gazeuse, pour l’étudedes paires d’ions modèles entre un groupementcarboxylate et un cation alcalin, illustrant le typed’appariement observé dans le milieu biologique.Ces premières études sont menées à l’aide d’uneapproche de spectroscopie IR et UV sélective enconformation, combinée à des calculs au niveauchimie quantique sur des modèles de formulegénérale (C6H5-(CH2)n-COO-, M+; M = Li, Na, K,Rb, Cs et n ≤ 4). L’appariement entre les ions a étéainsi caractérisé sur l’ensemble de ces systèmes, etune compétition entre les interactions cation-anionet cation-π a été observée pour les systèmes de plusgrande taille.Dans un second temps, une étude théorique estdéveloppée dans l’objectif de proposer un spectrethéorique pour chaque type de paires, et de leconfronter aux spectres expérimentaux en solutionde la littérature. L’approche repose sur le calcul dela signature vibrationnelle de paires (CH3-COO-,M+; M = Li, Na) et de l’anion libre, entouréssuccessivement de molécules d’eau explicitesdécrites au niveau chimie quantique, puis auniveau champ de force et enfin par un modèle desolvant continu.Cet apport original pour l’étude des paires d’ionsneutres ouvre la voie vers une meilleurecaractérisation de ces paires dans les solutions électrolytiques. / Ion pairs are ubiquitous in nature andwere documented in sea waters, aerosols andliving organisms, thus they play a crucial role inmany chemical and biochemical mechanisms.Although many experimental approaches aimedat identifying these ion pairs in solutions, theyfailed in characterizing their microscopicproperties, mainly due to the coexistence of manytypes of pairs in solution. This original study aimsto identify the structural properties of ion pairmodels in the gas phase that depicts theinteraction between carboxylate group and alkalication, largely present in biological media.Model systems (M+, C6H5(CH2)nCOO-, M = Li,Na, K, Rb, Cs and n ≤ 4) were the subject of thefirst studies conducted using gas phaseconformational selective IR and UV spectroscopycombined to quantum chemistry calculations.Among the identified structures, we found asecondary interaction between the cation andphenyl ring (cation-π interaction) for systems witha flexible carbon chain, which led us to study thecompetition between cation-anion and cation-πinteractions.The second study developed focused mainly oncharacterizing ion pairs (M+, CH3COO-; M = Li,Na) and free anion in solution, where the firstsolvation layer were described at the quantumlevel, followed by a solvent continuum. Thus thevibrationnal signatures proposed for theseaggregates were compared to solution spectra inlitterature, thus offering a reliable structuralassignement.This study on neutral ion pairs paves way to a betterunderstanding of ion pairing and offers a uniqueapproach to adress the structural characterization ofthese systems in solution.

Cette thèse présente une étude expérimentale et théorique de petites chaines peptidiques modèles en phase gazeuse. Le premier objectif de ce travail consistait à déterminer les conformations préférentiellement adoptées par ces molécules isolées, en vue d'obtenir des informations sur les interactions intra- et inter-moléculaires intervenant dans ces systèmes flexibles. La stratégie expérimentale utilisée associait la vaporisation laser à une détente supersonique et reposait sur la spectroscopie laser de double résonance IR-UV. L'attribution finale des structures a ensuite été réalisée par comparaison des spectres expérimentaux à des spectres issus de calculs de chimie quantique au niveau DFT-D. Dans un deuxième temps, il s'agissait d'étudier la dynamique de relaxation électronique de ces systèmes par spectroscopie pompe-sonde et mesures de fluorescence, et en particulier la dépendance de celle-ci avec la structure secondaire des peptides modèles. La question de la population conformationnelle de molécules flexibles en phase gazeuse est un sujet délicat et bien souvent éludée car les distributions observées expérimentalement résultent d'un passage hors équilibre lors de la détente supersonique, définissant ainsi une température conformationnelle effective. Un modèle statistique a été développé, décrivant le refroidissement et les isomérisations subis durant la détente par une molécule. Les résultats de ces modélisations reproduisent les tendances d'évolution des rapports d'abondances entre conformations observés expérimentalement et permettent de fournir des ordres de grandeurs relatifs aux processus mis en jeu (nombre de collisions efficaces, trajectoire dans la détente après désorption, températures finales) ainsi qu'une meilleure compréhension des processus de refroidissement et de relaxation conformationnelle. Les études conformationnelles ont été appliquées à deux systèmes modèles choisis pour étudier des interactions structurantes intervenant dans les protéines : les interactions protéines-solvant et les interactions hydrophobes. L'étude des complexes (Ac­Phe­NH₂ : H₂O) et (Ac­Phe­NHMe : H₂O) ont permis d'identifier les sites de solvatation préférentiellement occupés par une molécule d'eau et ainsi de proposer des mécanismes de formation des complexes dans la détente supersonique. Le rôle structurant très fort des interactions hydrophobes entre chaînes latérales aromatiques a pu être mis en évidence en étudiant deux peptides modèles contenant un enchainement de plusieurs acides aminés phénylalanine : Ac­Phe­Phe­NH₂ et Ac­Phe­Phe­Phe­NH₂. L'étude des dynamiques de relaxation du premier état excité ππ*, réalisée sur divers peptides modèles, a permis de démontrer la présence d'effets conformationnels importants. Des calculs de chimie quantique (TDDFT et CC2) réalisés sur les systèmes Ac-Phe NH₂ et Ac-Phe NHMe ont montré que cet effet pouvait être expliqué par un transfert d'excitation depuis le cycle aromatique présent sur la chaîne latérale vers les liaisons peptidiques de la chaine principale. Enfin, l'ajout d'une molécule d'eau sur le peptide Ac-Phe NH₂ semble ouvrir de nouvelles voies ultrarapides de relaxation non-radiative.

Ces dernières décennies, la spectroscopie moléculaire a bénéficié du progrès des spectromètres, notamment en terme de sélectivité et sensibilité, et de méthodes d'analyse et de calculs de chimie quantique toujours plus avancés. Désormais, la spectroscopie rotationnelle s'oriente vers l'analyse de systèmes moléculaires plus complexes caractérisés spectralement par une forte densité de raies. La congestion spectrale des espèces étudiées dans ma thèse s'explique non seulement par de faibles constantes rotationnelles mais aussi par la présence d'états vibrationnels excités à température ambiante, une forte richesse isotopique, un haut degré de splittings dus aux mouvements de grande amplitude ou encore par un paysage conformationnel complexe. Cette thèse illustre ainsi divers scénarii à travers les études du chlorure de thionyle, des nitrotoluènes et des méthoxyphénols. Les spectres rovibrationnels des bandes v2 et v5 des isotopologues du chlorure de thionyle ont été mesurés dans l'infrarouge lointain au synchroton SOLEIL et analysés en utilisant une approche semi-automatique basée sur des algorithmes évolutionnaires. Les isomères du nitrotoluène ont été ciblés pour leur intérêt défense comme traceurs d'explosif (TNT), les spectres de rotation pure ont été mesurés dans les régions micro-ondes en jet moléculaire et millimétrique à température ambiante. Le spectre millimétrique du 3-nitrotoluène était particulièrement faible et congestionné avec des splittings dus à la rotation interne très importants (jusqu'à plusieurs GHz) en raison d'une barrière de rotation très faible ( Vз=6.7659(24)cmˉ ¹). La limite de détection a été estimée et une liste de raies établie. Les spectres millimétriques des 2-nitrotoluène et 4-nitrotoluène ont également été partiellement analysés. Enfin, les méthoxyphénols émis lors de feux de biomasse ont également étudiés comme précurseurs d'aérosols organiques secondaires pour leur détection atmosphérique future. Associée à des calculs de chimie quantique, l'analyse du spectre millimétrique du 3-méthoxyphénol mesuré à température ambiante dans la région millimétrique a permis de déterminer la stabilité relative de quatre conformères. / In recent decades, molecular spectroscopy has benefited from the progress of spectrometers, particularly in terms of selectivity and sensitivity, and from the continuous advancement of the analysis methods and quantum chemistry calculations. Today, rational spectroscopy is moving towards the analysis of more complex molecular systems spectrally characterized by a high density of lines. The spectral congestion of the species studied in this thesis is not only explained by low rotational constants, but also by the presence of vibrational states excited at room temperature, a high isotopic richness, a high degree of line splitting due to large amplitude motions or by a complex conformational landscape. This thesis thus illustrates various scenarios through the studies of thionyl chloride, nitrotoluenes and methoxyphenols. The rovibrational spectra of the v2 and v5 bands of the isotopologues of thionyl chloride were measured in far-infrared at the SOLEIL synchroton and analyzed using a semi-automatic approach based on evolutionary algorithms. The isomers of nitrotoluene have been targeted for military application as explosive taggants (TNT), the pure rotation spectra were measured in the microwave region in molecular jet and in the millimeter-wave region at room temperature. The millimeter-wave spectrum of 3-nitrotoluene was especially weak and congested with very large internal rotation splittings (up to several GHz) due to a very weak rotational barrier (V3=6.7659(24)cmˉ ¹). The detection limit was estimated and a linelist established. The 2-nitrotoluene and 4-nitrotoluene millimeter-wave spectra have been also partially analyzed. Finally, methoxyphenols emitted during biomass fires have also been studied as they are secondary organic aerosol precursors for their future atmospheric detection. Combined with quantum chemistry calculations, the analysis of the millimeter-wave spectrum of the 3-methoxyphenol measured at room temperature permitted the relative stability of four conformers to be determined.

La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91phox et p22phox), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). Lors de son activation, p47phox subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changements conformationnels ont été identifiés sur p47phox par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à la spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22phox, a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22phoxCter et des liposomes ont été testées par BiacoreTM et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47phox, et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmepsine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.

Près de 40% des protéines présentes dans les cellules sont prédites partiellement ou complètement désordonnées. Ces protéines dépourvues de structure tridimensionnelle à l'état natif sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques, la flexibilité jouant un rôle moteur dans les mécanismes de reconnaissance moléculaire. La prise en considération de l'existence de flexibilité au sein des protéines et des interactions protéines-protéines a nécessité le renouvellement de nos connaissances, de notre appréhension des fonctions biologiques ainsi que des approches pour étudier et interpréter ces phénomènes. La méthode retenue pour étudier ces transitions conformationnelles est la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Elle dispose d'une sensibilité unique, d'une résolution à l'échelle atomique et permet par diverses expériences d'accéder à l'ensemble des échelles de temps définissant les mouvements de ces protéines. Nous combinons ces mesures expérimentales à un modèle statistique représentant l'ensemble du paysage énergétique des protéines désordonnées : la description par ensemble explicite de structures. Ce modèle est une représentation discrète des différents états échantillonnés par ces protéines. Il permet, combinant les déplacements chimiques, les couplages dipolaires et la relaxation paramagnétique, de développer une description moléculaire de l'état déplié en caractérisant à la fois l'information locale et l'information à longue portée présente dans les protéines intrinsèquement désordonnées.

Cette thèse a pour but de développer le pendant in silico des étapes clés du Fragment-Based Drug Design (FBDD), et ce dans le cadre plus général du développement de l'outil S4MPLE. Le FBDD génère des ligands drug-like à partir de petites molécules (fragments). Après une étape de validation de S4MPLE et de sa fonction d’énergie, un recentrage autour du FBDD est réalisé, à travers le docking puis l'optimisation virtuelle de fragments par growing ou linking (G/L). Cette stratégie reposesur 1) la création d’une chimiothèque focalisée en connectant un ou deux fragment(s) avec des linkers pré-générés, et 2) l’échantillonnage avec S4MPLE des composés chimères dans le site avec des contraintes. Des simulations de G/L plus ou moins ambitieuses (site flexible, ajout de H2O libres) permettent de valider cette approche avec des études rétrospectives basées sur des données expérimentales. La dernière phase de la thèse a consisté à appliquer ce protocole in silico à un projet de l’entreprise. / This work aims to develop in silico methods targeting the key stages of Fragment-Based Drug Design (FBDD), participating to the development of the molecular modeling tool S4MPLE. Briefly, FBDD generates ıdrug-likeı ligands from small organic molecules called fragments. After a validation step of S4MPLE and its energy function, the work focused on FBDD: molecular docking of fragments and their subsequent virtual optimization. The latter mimics standard evolution strategies in FBDD(growing and linking). This in silico approach involves among other two key stages 1) building of a focused library by plugging in pre-generated linkers into reference fragments using rules and 2) sampling of these new compounds under atomic and binding site constraints. Validation simulations, relying on known experimental data, included ıclassicalı growing / linking and more challenging ones (site flexibility, free waters). Finally, this strategy is applied to one project of the company.