Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-11Bitstream added on 2014-06-13T19:19:43Z : No. of bitstreams: 1 roma_gc_dr_rcla.pdf: 2022594 bytes, checksum: eece8bf27b13004335d7c54d03d168df (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O corpo gorduroso dos insetos é um tecido de preenchimento que está principalmente no abdômen e ao redor dos órgãos, onde é denominado de corpo gorduroso perivisceral, e logo abaixo do tegumento, ou corpo gorduroso parietal. No presente estudo avaliou-se a morfologia, a morfometria, a histoquímica e a citoquímica ultra-estrutural, além da química dos lipídios, das células do corpo gorduroso das operárias e gynes (fêmeas aladas) de formigas de Cyphomyrmex rimosus e de Mycetarotes parallelus e operárias médias e rainhas de Acromyrmex disciger e de Atta laevigata pertencentes à tribo Attini, com o objetivo de descrever os tipos celulares e analisar morfológica e fisiologicamente suas células, com vistas a detectar a ocorrência de possíveis variações neste tecido tanto entre as espécies quanto entre as castas, além de avaliar se existiriam diferenças entre as espécies basais e derivadas que possivelmente teriam surgido ao longo do processo evolutivo dos indivíduos pertencentes a esta tribo. Os resultados mostraram que em todas as espécies e castas o corpo gorduroso é constituído pelos trofócitos, células que se tornam poligonais devido à compressão de uma contra a outra, com núcleos irregulares e com presença de proteínas, polissacarídeos neutros e lipídios distribuídos por todo o citoplasma. Nas gynes e rainhas, em geral, esses elementos mostraram-se mais evidentes do que nas operárias. Verificou-se ainda que os trofócitos das castas reprodutivas seriam caracterizados pela presença de toda a estrutura relacionada à síntese de proteínas, elementos essenciais nos processos relacionados à vitelogênese. Os lipídios nos trofócitos das operárias e rainhas das espécies derivadas apareceram em maiores quantidades do que nas operárias e gynes basais. Os enócitos, outro tipo celular freqüentemente associado aos trofócitos, mostraram-se... / The insect fat body is a filling tissue which is distributed principally in the abdomen, around the organs (also known as perivisceral fat body) and right above the tegument (called the parietal fat body). The present study evaluated the morphology, morphometry, histochemistry and ultrastructural cytochemistry, as well the lipid chemistry, of the fat body cells of ant workers and gynes (winged females) of Cyphomyrmex rimosus and Mycetarotes parallelus and media workers and queens of Acromyrmex disciger and Atta laevigata belonging to the Attini tribe, with the objective of describing the cell types and the morphological and physiological analysis of their cells. This was done in an attempt to detect the occurrence of possible tissue variations between the species and castes, as well as evaluating if there are differences between the basal and derived species that may have surfaced during the evolution of these individuals belonging to this tribe. The results showed that in all species and castes the fat body is constituted of trophocytes, which are polygonal in shape due to the compression of one cell against another, and with irregular nuclei, proteins, neutral polysaccharides and lipids distributed all over the cytoplasm. In general, these elements were more evident in the gynes and queens than in the workers. It was also verified that the trophocytes of the reproductive castes are characterized by the presence of structures related to protein synthesis, essential elements in activities related to vitellogenesis. The lipids in the worker and queen trophocytes from the derived species are present in larger amounts when compared to the basal workers and gynes. The oenocytes, another cell type frequently associated to the trophocytes, are spherical in all species and castes, in addition to spherical nuclei, proteins, lipids and a few neutral polysaccharides distributed all over the... (Complete abstract click electronic access below)

Como em outros mosquitos, os trofócitos do corpo gorduroso de Cx. quinquefasciatus sintetizam vitelogenina (Vg), principal proteína armazenada pelo ovócito, formada por duas subunidades de 200 e 86 kDa. A ultraestrutura dos trofócitos revela o rápido desenvolvimento da maquinaria biossintética após a alimentação com sangue (aa) e a consecutiva degradação após as 48 h aa. Antes do repasto (AR), um conjunto de células indiferenciadas, limitado pelo epitélio folicular, conforma os folículos ovarianos. Após AR, o ovócito se destaca pelo acúmulo de lipídeos e Vg. O receptor de vitelogenina é encontrado somente nos ovários e análise por PCR em tempos mostrou aumento dos transcritos nos primeiros cinco dias após emersão e nas primeiras 48 h aa, durante a vitelogênese. O perfil transcricional de Vg mostrou um pico no terceiro dia de vida adulta e ao final do processo ovogênico / As in other mosquitoes, fat body trophocytes of Cx. quinquefasciatus synthesize vitellogenin (Vg), the major yolk protein stored by the oocyte, formed by two subunits of 200 and 86 kDa. The trophocytes ultrastructure reveals the rapid development of the biosynthetic machinery and the consecutive degradation around 48 h post blood meal (PBM). Before blood meal, a set of undifferentiated cells limited by follicular epithelium, conform the ovarian follicles. After blood meal, the oocyte is remarkable by accumulation of lipid inclusions and yolk granules. Vitellogenin receptors (rVitCx), are localized exclusively in the ovaries and real time PCR showed transcripts increase at the first five days after emergence (AE), and at the first 48 h PBM, during oogenesis. Vg transcripts profile showed a peak on the third day AE and at the end of the vitellogenic process

Introdução: Hexamerinas são proteínas de estocagem sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde se acumulam. A função canônica das hexamerinas consiste em servir de reserva de aminoácidos e energia para a reconstrução de tecidos e órgãos durante a metamorfose. Este trabalho teve como objetivo a busca por evidências de funções alternativas das hexamerinas durante o ciclo de vida de abelhas A. mellifera. Resultados: Os perfis temporais de expressão das quatro hexamerinas (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c e HEX 110), verificados por meio de SDS-PAGE e western blot, corroboram sua função canônica na metamorfose. Consistente com esta função, as quatro hexamerinas foram localizadas no citoplasma das células do corpo gorduroso utilizando-se anticorpos específicos e microscopia confocal. No entanto, funções adicionais puderam ser inferidas com base nos seguintes resultados: (1) Foci das quatro hexamerinas foram localizados nos núcleos de algumas células do corpo gorduroso em metamorfose, levando à hipótese de que têm função anti-apoptótica durante este período crítico do desenvolvimento; (2) Além disso, HEX 70a e HEX 110 foram localizadas no citoplasma e núcleo de células ovarianas e testiculares, indicando função no desenvolvimento e maturação das gônadas; (3) A co-localização de um análogo de timidina (EdU) e HEX 70a nos núcleos das células dos ovaríolos, sugeriu fortemente uma função na proliferação celular. O knockdown de HEX 70a in vivo por meio de injeção de anticorpo específico prejudicou o crescimento dos ovaríolos de rainhas, reforçando a hipótese de função na proliferação celular, (4) interferiu na esclerotização da cutícula de operárias, indicando função na formação do exoesqueleto e (5) provocou a antecipação da ecdise adulta, provavelmente em resposta à ausência (ou diminuição) dos aminoácidos derivados das hexamerinas. Foram investigados também aspectos da regulação dos genes de hexamerinas. A manipulação experimental da dieta alimentar e dos títulos do hormônio juvenil (HJ) interferiram claramente na expressão dos genes de hexamerinas. A potencial ação reguladora do HJ foi reforçada pelos resultados de análises por bioinformática da região 5 UTR de cada gene de hexamerina (Martins et al., 2010) que revelaram potencial motivo de ligação à proteína Ultraspiracle (Usp), um membro do complexo receptor do HJ no DNA. Procedimentos para expressar as hexamerinas in vitro em sistema de bactérias e purificá-las estão em progresso visando a caracterização da estrutura e de interações entre as subunidades. Conclusão: Estes resultados ressaltam que as hexamerinas têm outras funções no ciclo de vida de A. mellifera, além da função já bem estabelecida de reserva de aminoácidos para a metamorfose. / Background: Insect hexamerins are storage proteins synthesized by the larval fat body and secreted into the hemolymph, where they accumulate. The canonical function of hexamerins is to provide amino acids and energy for the reconstruction of tissues and organs during pupal-to-adult development. The aim of the current study was to search for evidence of alternative roles for the hexamerins in the life cycle of the honey bee, A. mellifera. Results: The canonical role of insect hexamerins received support from our data on the temporal expression profiles of the four honey bee hexamerin subunits (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c and HEX 110), as verified by SDS-PAGE and western blot using hemolymph and fat body samples. Consistent with the canonical function, the four hexamerins were localized in the cytoplasm of fat body cells, during metamorphosis, by using specific antibodies and confocal laser-scanning microscopy. However, additional functions could be inferred by the following findings: (1) The four hexamerins were also localized in the nuclei of some fat body cells, thus tentatively suggesting an anti-apoptotic role during metamorphosis; (2) Furthermore, HEX 70a and HEX 110 were localized in the cytoplasm and nucleus of ovarian and testicular cells, pointing to a role in gonad development and maturation. Co-labeling of the thymidine analog EdU and HEX 70a in the ovariole cell nuclei, strongly suggested a role in cell proliferation; HEX 70a depletion via injection of the specific antibody in queen pupae impaired ovariole growth, thus strengthening our hypothesis on a role in cell proliferation, (3) HEX 70a depletion also impaired cuticle sclerotization, indicating a function in exoskeleton formation, and (4) led to a precocious adult ecdysis, perhaps in response to the lack (or decrease) in hexamerin-derived amino acids. We also investigated aspects of the regulation of hexamerin genes. The experimental manipulation of diet consumption and juvenile hormone (JH) titer clearly interfered in the expression of hexamerin genes. Regulation by JH was also supported by a previous bioinformatics analysis of the 5 UTR region of each hexamerin gene (Martins et al., 2010), which revealed a potential binding site for Ultraspiracle (Usp), a member of the JH receptor complex in the DNA. Experiments are in progress for in vitro expression and purification of the four hexamerins aiming to further characterize their structures and interactions. Conclusion: Taken together, these results imply in novel roles for hexamerins in the life cycle of A. mellifera in addition to their well-established role as amino acids sources for metamorphosis.

A relação entre nutrição e fenótipo é uma questão especialmente desafiadora em casos de polifenismo facultativo, como no caso das castas de insetos sociais, por exemplo, a abelha melífera Apis mellifera. Após estudos de vias de sensoriamento de nutrientes, modificações inesperadas nestas vias de sinalização revelaram a resposta à hipóxia como um possível mecanismo subjacente à regulação do tamanho corporal e crescimento de órgãos. Uma vez que essa resposta está intimamente ligada a condições metabólicas das células, o presente estudo foi concebido para investigar possíveis alterações no metabolismo mitocondrial e oxidativo no processo de diferenciação de castas em A. melífera na fase larval, com foco no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Partindo da hipótese de que rainhas e operárias são criadas em células de cria abertas sob condições iguais de disponibilidade de oxigênio, nós investigamos o número e a distribuição mitocondrial, bem como as taxas de consumo de oxigênio em mitocondrias de células de corpo gorduroso durante estágios larvais críticos. Por meio de análises de imunofluorescência e microscopia eletrônica encontramos maior densidade de mitocôndrias no corpo gorduroso larval da rainha, dado corroborado pela quantificação de unidades funcionais mitocondriais por ensaio de citrato sintase. Medições de consumo de oxigênio por respirometria de alta resolução revelaram que as larvas de rainha têm capacidades máximas mais altas de produção de ATP, com menor demanda fisiológica, mas com mesma eficiência mitocondrial que operárias. A análise da expressão de fatores relacionados à mitogênese mostrou que os homólogos dos genes codificadores dos fatores de transcrição TFB1 e TFB2 e de um regulador nutricional, ERR, estão mais expressos em larvas de rainha. Apesar das diferenças encontradas na respiração mitocondrial entre as duas castas, as mesmas apresentaram níveis similares de produção de lactato e peróxido de hidrogênio, sem grandes alterações referentes à condições de estresse oxidativo e ao estado redox das célula. Encontramos altos níveis de expressão de genes codificadores das enzimas do sistema antioxidante MnSOD e catalase em células do corpo gorduroso larval de rainha, que garantem a redução de eventuais danos oxidativos. Estes resultados são fortes evidências de que a nutrição diferencial das larvas pelas operárias adultas, como estímulo externo da indução do desenvolvimento das castas, diferencialmente afeta a dinâmica e funcionalidade mitocondrial como elemento intrínseca da plasticidade fenotípica neste inseto social. / The connection between nutrition and phenotype is a particularly challenging issue in cases of facultative polyphenism, as for instance in the honeybee Apis mellifera. After studies on nutrient sensing pathways found unexpected modifications in these signaling pathways, a response to hypoxia was revealed as a possible mechanism underlying regulation of body size and organ growth. Since this response is closely linked to the metabolic conditions of the cells, the present study was designed to investigate the role of the mitochondrial and oxidative metabolism in the fat body of honeybee larvae, which is the metabolic center in insects, in the context of the caste differentiation process in A. mellifera. Based on the fact that honey bee larvae are reared in open brood cells, the queen and worker larvae should be exposed to equal oxygen diffusion conditions, and hence we investigated mitochondrial number and intracellular distribution, as well as rates of mitochondrial oxygen consumption in fat body cells during the larval stages critical for caste differentiation. By means of immunofluorescence and electron microscopy we found a higher density of mitochondria in the fat body of queen larvae. This result was corroborated by the quantification of mitochondrial functional units using a citrate synthase assay. Measurements of oxygen consumption obtained by high resolution respirometry revealed that queen larvae have higher maximum capacities of ATP production, with less physiological demand and higher mitochondrial efficiency than workers. Analysis of the expression of genes related to mitogenesis showed that Apis homologs of the transcription factors TFB1 and TFB2 and of the nutritional regulator, ERR are higher expressed in queen larvae. Despite differences in mitochondrial respiration, the two castes presented similar levels of lactate and hydrogen peroxide production, and without major chang in oxidative stress and cellular redox status. The high transcriptional levels of genes encoding enzymes of the antioxidant system, MnSOD and catalase observed in fat body cells of queen larvae guarantee that oxidative damage is reduced during larval development. These results are strong evidence that the differential nutrition of honey bee larvae by the adult worker, as the external stimulus for caste induction, differentially affects mitochondrial dynamics and functionality as an intrinsic element of phenotypic plasticity in this social insect.

Como em outros mosquitos, os trofócitos do corpo gorduroso de Cx. quinquefasciatus sintetizam vitelogenina (Vg), principal proteína armazenada pelo ovócito, formada por duas subunidades de 200 e 86 kDa. A ultraestrutura dos trofócitos revela o rápido desenvolvimento da maquinaria biossintética após a alimentação com sangue (aa) e a consecutiva degradação após as 48 h aa. Antes do repasto (AR), um conjunto de células indiferenciadas, limitado pelo epitélio folicular, conforma os folículos ovarianos. Após AR, o ovócito se destaca pelo acúmulo de lipídeos e Vg. O receptor de vitelogenina é encontrado somente nos ovários e análise por PCR em tempos mostrou aumento dos transcritos nos primeiros cinco dias após emersão e nas primeiras 48 h aa, durante a vitelogênese. O perfil transcricional de Vg mostrou um pico no terceiro dia de vida adulta e ao final do processo ovogênico / As in other mosquitoes, fat body trophocytes of Cx. quinquefasciatus synthesize vitellogenin (Vg), the major yolk protein stored by the oocyte, formed by two subunits of 200 and 86 kDa. The trophocytes ultrastructure reveals the rapid development of the biosynthetic machinery and the consecutive degradation around 48 h post blood meal (PBM). Before blood meal, a set of undifferentiated cells limited by follicular epithelium, conform the ovarian follicles. After blood meal, the oocyte is remarkable by accumulation of lipid inclusions and yolk granules. Vitellogenin receptors (rVitCx), are localized exclusively in the ovaries and real time PCR showed transcripts increase at the first five days after emergence (AE), and at the first 48 h PBM, during oogenesis. Vg transcripts profile showed a peak on the third day AE and at the end of the vitellogenic process

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-18T12:31:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4017269 bytes, checksum: 55fb108c92c0bdea870f05ca3127a9de (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T12:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4017269 bytes, checksum: 55fb108c92c0bdea870f05ca3127a9de (MD5) Previous issue date: 2005-06-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta pesquisa estudou o efeito de diferentes dietas [pupas de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) sem planta; pupas de T. molitor e plantas de Eucalyptus cloeziana; pupas de T. molitor e plantas de Eucalyptus urophylla e; pupas de T. molitor e plantas de goiabeira (Psidium guajava)], no campo, sobre aspectos morfo-fisiológicos do corpo gorduroso e do sistema reprodutor de femeas e machos de Brontocoris tabidus (Signoret) (Heteroptera: Pentatomidae) e avaliou a fecundidade e os parâmetros das tabelas de vida e de fertilidade desse predador em plantas de Eucalyptus grandis, em campo. A genitalia interna de fêmeas desse predador apresentou coloração amarelada, com ovário do tipo meroístico telotrófico e com sete ovaríolos. 0 total de proteína na hemolinfa (25,89 ug/uL) de fêmeas de B. tabidus independe da idade e da dieta, mas aquelas alimentadas com pupas de T molitor sem planta tiveram ovaríolos menores. O número de ovócitos/ovário foi maior para fêmeas desse predador com E. urophylla e pupas de T molitor e menor sem planta. Fêmeas de B. tabidus com 21 dias de idade apresentaram maior número de ovócitos/ovaríolo (5,13 ovócitos) que aos 15 dias (4,54 ovócitos) com todas as dietas. Fêmeas desse predador, com 15 dias de idade, tiveram ovócitos mais desenvolvidos com E. cloeziana (1,58 mm) 6 E. urophylla (1,62 mm) 6 menores com goiabeira (1,35 mm) 6 pupas (16 T. molitor sem plantas (1,23 mm). Com 21 dias de idade, fémeas (16 B. tabidus sem planta apresentaram ovócitos menores que aquelas com plantas. O comprimento do ovócito não foi afetado pela idade de fêmeas desse predador com plantas de eucalipto. Os ovários (16 B. tabidus tiveram características histológicas semelhantes com todas as dietas. A genitália intema de machos desse predador apresentou coloração vermelha e testículos com seis folículos. Machos (16 B. tabidus, com 15 dias de idade, foram mais pesados que com 21 dias em todos os tratamentos, exceto quando receberam, apenas, pupas (16 T. molitor. 0 total de proteína na hemolinfa (15,58 ug/uL) de machos não foi afetado pela idade desse predador e pela dieta. Machos, com 15 dias de idade, tiveram testículos maiores com E. cloeziana (0,94 mmz), E. urophylla (0,98 mmz) ou, apenas, pupas (16 T. molitor (0,99 mmz) que com goiabeira (0,76 mmz). No entanto, com 21 dias de idade, B. tabidus apresentou testículos com tamanho semelhante com todas as dietas. Os foliculos (16 B. tabidus exibiram grande quantidade de espermatozóides com todas as dietas e idades comprovando que o processo de espermatogênese foi completado. Os testículos desse predador mostraram características histológicas semelhantes com todas as dietas. Fêmeas e machos adultos (16 B. tabidus apresentaram trofócitos duas vezes maiores com E. urophylla e T. molitor que nas demais dietas. Esses trofócitos, em cada sexo, foram morfologicamente semelhantes em todas as dietas e idades. Os testes histoquímicos com mercúrio bromofenol e PAS, para evidenciar proteínas totais e carboidratos, respectivamente, no corpo gorduroso de fêmeas e machos (16 B. tabidus mostraram pouca coloração dos materiais biológicos com todas as dietas e idades. Isto indica quantidade reduzida de proteína e carboidratos no corpo gorduroso de ambos os sexos (16 B. tabidus. Fêmeas (16 B. tabidus, criadas em E. grandis no campo, apresentaram longevidade de 160, 20 dias e média de 601,10 ovos cada uma. A taxa bruta (TBR) e líquida (Ro) de reprodução foram de 216,72 6 75,81 fêmeas por fêmea, respectivamente; a duração de uma geração (DG) de 146,05 dias e o tempo para a população dobrar de tamanho (DT) de 23,39 dias; A taxa intrinseca de aumento populacional (rm) foi de 0,030 e o incremento populacional (k) de 1,030 progênies fêmeas por fêmea. A população de B. tabidus aumentou em 33,36 fêmeas por fêmea por geração. Esse predador apresenta potencial para ser utilizado em programas de manejo de pragas desfolhadoras no Brasil e deve ser criado em plantas de eucalipto no campo. / This research studied the effect of different diets [Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) pupae without plants; T. molitor pupae and plants of Eucalyptus cloeziana; T. molitor pupae and plants of Eucalyptus urophylla and; T. molitor pupae and guava plants (Psiclium guajava)], in the field on morpho-physiological aspects of the fat body and the reproductive system of females and males of Brontocoris tabidus (Signoret) (Heteroptera: Pentatomidae). The fecundity and the parameters of life and fertility tables of this predator were also studied on Eucalyptus grandis plants in the field. The internal parts of the genitalia of females of this predator present yellowish color with ovary of the meroistic telotrofic type with seven ovariolos. The total protein in the hemolymph (25.89 ug/uL) of females of B. tabidus does not depend on the age and diet. Females of this predator fed with T molitor pupae without plants presented smaller ovariolos. The number of oocytes/ovary was higher for females of this predator fed with E. urophylla and T molitor pupae and smaller without plant. Twenty-one days old females of B. tabidus showed higher number of oocytes/ovariole (5.13 oocytes) than those with 15 days (4.54 oocytes) with all diets. Females of this predator, with 15 days old, presented more developed oocytes with E. cloeziana (1.58 mm) and E. urophylla (1.62 mm) than with guava plant (1.35 mm) or T. molitor pupae without plants (1.23 mm). B. tabidus females with 21 days old had smaller oocytes without plants. The length of ovocytes was not affected by the age of females of this predator with eucalyptus plants. The ovaries of B. tabidus presented similar histological characteristics with all diets. The internal genitalia of males of this predator showed red color and testicles with six follicles. Males of B. tabidus, with 15 days old, were heavier than those with 21 days in all treatments except when they received only T. molitor pupae. The total protein in the hemolymph (15.58 ug/uL) of males of this predator was not affected by the age and diet. Fifteen days old males presented larger testicles with E. cloeziana (0.94 mm2), E. urophylla (0.98 mmz) or, only, T. molitor pupae (0.99 mm2) than with guava plants (0.76 mmz). Males of B. tabidus with 21 days old showed testicles with similar size with all diets. The follicles of B. tabidus presented large quantity of spermatozoids with all diets and ages what shows that the spermatogenesis process was completed. The testicles of this predator showed similar histological characteristics with all diets. Female and male adults of B. tabidus had trophocytes twice larger with E. urophylla and T. molitor than with the other diets. These trophocytes presented similar morphological aspects in the same sex with all diets and ages. The histochemical tests bromofenol mercury and PAS evidenced the total proteins and carbohydrates, respectively, in the fat body of females and males of B. tabidus with low coloration of the biological materials with all diets and age. This indicates a reduced quantity of protein and carbohydrates in the fat body of both sexes of B. tabidus. Females of B. tabidus reared with E. grandis in the field presented longevity of 160.20 days and 601.10 eggs each one. The gross (GRR) and net (Ro) reproductive rates were 216.72 and 75.81 females perfemale, respectively; the duration of a generation (T) was 146.05 days and the time for the population to double in size (DT) 23.39 days; the intrinsic rate of population increase (rm) was 0.030 and the population increment (X) 1030 female progenies per female. The population of B. tabidus increased in 33.36 females per female per generation. This predator presents potential to be used in programs of integrated pest management of eucalyptus defoliators in Brazil and it should be reared in these plants on field conditions.

A relação entre nutrição e fenótipo é uma questão especialmente desafiadora em casos de polifenismo facultativo, como no caso das castas de insetos sociais, por exemplo, a abelha melífera Apis mellifera. Após estudos de vias de sensoriamento de nutrientes, modificações inesperadas nestas vias de sinalização revelaram a resposta à hipóxia como um possível mecanismo subjacente à regulação do tamanho corporal e crescimento de órgãos. Uma vez que essa resposta está intimamente ligada a condições metabólicas das células, o presente estudo foi concebido para investigar possíveis alterações no metabolismo mitocondrial e oxidativo no processo de diferenciação de castas em A. melífera na fase larval, com foco no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Partindo da hipótese de que rainhas e operárias são criadas em células de cria abertas sob condições iguais de disponibilidade de oxigênio, nós investigamos o número e a distribuição mitocondrial, bem como as taxas de consumo de oxigênio em mitocondrias de células de corpo gorduroso durante estágios larvais críticos. Por meio de análises de imunofluorescência e microscopia eletrônica encontramos maior densidade de mitocôndrias no corpo gorduroso larval da rainha, dado corroborado pela quantificação de unidades funcionais mitocondriais por ensaio de citrato sintase. Medições de consumo de oxigênio por respirometria de alta resolução revelaram que as larvas de rainha têm capacidades máximas mais altas de produção de ATP, com menor demanda fisiológica, mas com mesma eficiência mitocondrial que operárias. A análise da expressão de fatores relacionados à mitogênese mostrou que os homólogos dos genes codificadores dos fatores de transcrição TFB1 e TFB2 e de um regulador nutricional, ERR, estão mais expressos em larvas de rainha. Apesar das diferenças encontradas na respiração mitocondrial entre as duas castas, as mesmas apresentaram níveis similares de produção de lactato e peróxido de hidrogênio, sem grandes alterações referentes à condições de estresse oxidativo e ao estado redox das célula. Encontramos altos níveis de expressão de genes codificadores das enzimas do sistema antioxidante MnSOD e catalase em células do corpo gorduroso larval de rainha, que garantem a redução de eventuais danos oxidativos. Estes resultados são fortes evidências de que a nutrição diferencial das larvas pelas operárias adultas, como estímulo externo da indução do desenvolvimento das castas, diferencialmente afeta a dinâmica e funcionalidade mitocondrial como elemento intrínseca da plasticidade fenotípica neste inseto social. / The connection between nutrition and phenotype is a particularly challenging issue in cases of facultative polyphenism, as for instance in the honeybee Apis mellifera. After studies on nutrient sensing pathways found unexpected modifications in these signaling pathways, a response to hypoxia was revealed as a possible mechanism underlying regulation of body size and organ growth. Since this response is closely linked to the metabolic conditions of the cells, the present study was designed to investigate the role of the mitochondrial and oxidative metabolism in the fat body of honeybee larvae, which is the metabolic center in insects, in the context of the caste differentiation process in A. mellifera. Based on the fact that honey bee larvae are reared in open brood cells, the queen and worker larvae should be exposed to equal oxygen diffusion conditions, and hence we investigated mitochondrial number and intracellular distribution, as well as rates of mitochondrial oxygen consumption in fat body cells during the larval stages critical for caste differentiation. By means of immunofluorescence and electron microscopy we found a higher density of mitochondria in the fat body of queen larvae. This result was corroborated by the quantification of mitochondrial functional units using a citrate synthase assay. Measurements of oxygen consumption obtained by high resolution respirometry revealed that queen larvae have higher maximum capacities of ATP production, with less physiological demand and higher mitochondrial efficiency than workers. Analysis of the expression of genes related to mitogenesis showed that Apis homologs of the transcription factors TFB1 and TFB2 and of the nutritional regulator, ERR are higher expressed in queen larvae. Despite differences in mitochondrial respiration, the two castes presented similar levels of lactate and hydrogen peroxide production, and without major chang in oxidative stress and cellular redox status. The high transcriptional levels of genes encoding enzymes of the antioxidant system, MnSOD and catalase observed in fat body cells of queen larvae guarantee that oxidative damage is reduced during larval development. These results are strong evidence that the differential nutrition of honey bee larvae by the adult worker, as the external stimulus for caste induction, differentially affects mitochondrial dynamics and functionality as an intrinsic element of phenotypic plasticity in this social insect.

Introdução: Hexamerinas são proteínas de estocagem sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde se acumulam. A função canônica das hexamerinas consiste em servir de reserva de aminoácidos e energia para a reconstrução de tecidos e órgãos durante a metamorfose. Este trabalho teve como objetivo a busca por evidências de funções alternativas das hexamerinas durante o ciclo de vida de abelhas A. mellifera. Resultados: Os perfis temporais de expressão das quatro hexamerinas (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c e HEX 110), verificados por meio de SDS-PAGE e western blot, corroboram sua função canônica na metamorfose. Consistente com esta função, as quatro hexamerinas foram localizadas no citoplasma das células do corpo gorduroso utilizando-se anticorpos específicos e microscopia confocal. No entanto, funções adicionais puderam ser inferidas com base nos seguintes resultados: (1) Foci das quatro hexamerinas foram localizados nos núcleos de algumas células do corpo gorduroso em metamorfose, levando à hipótese de que têm função anti-apoptótica durante este período crítico do desenvolvimento; (2) Além disso, HEX 70a e HEX 110 foram localizadas no citoplasma e núcleo de células ovarianas e testiculares, indicando função no desenvolvimento e maturação das gônadas; (3) A co-localização de um análogo de timidina (EdU) e HEX 70a nos núcleos das células dos ovaríolos, sugeriu fortemente uma função na proliferação celular. O knockdown de HEX 70a in vivo por meio de injeção de anticorpo específico prejudicou o crescimento dos ovaríolos de rainhas, reforçando a hipótese de função na proliferação celular, (4) interferiu na esclerotização da cutícula de operárias, indicando função na formação do exoesqueleto e (5) provocou a antecipação da ecdise adulta, provavelmente em resposta à ausência (ou diminuição) dos aminoácidos derivados das hexamerinas. Foram investigados também aspectos da regulação dos genes de hexamerinas. A manipulação experimental da dieta alimentar e dos títulos do hormônio juvenil (HJ) interferiram claramente na expressão dos genes de hexamerinas. A potencial ação reguladora do HJ foi reforçada pelos resultados de análises por bioinformática da região 5 UTR de cada gene de hexamerina (Martins et al., 2010) que revelaram potencial motivo de ligação à proteína Ultraspiracle (Usp), um membro do complexo receptor do HJ no DNA. Procedimentos para expressar as hexamerinas in vitro em sistema de bactérias e purificá-las estão em progresso visando a caracterização da estrutura e de interações entre as subunidades. Conclusão: Estes resultados ressaltam que as hexamerinas têm outras funções no ciclo de vida de A. mellifera, além da função já bem estabelecida de reserva de aminoácidos para a metamorfose. / Background: Insect hexamerins are storage proteins synthesized by the larval fat body and secreted into the hemolymph, where they accumulate. The canonical function of hexamerins is to provide amino acids and energy for the reconstruction of tissues and organs during pupal-to-adult development. The aim of the current study was to search for evidence of alternative roles for the hexamerins in the life cycle of the honey bee, A. mellifera. Results: The canonical role of insect hexamerins received support from our data on the temporal expression profiles of the four honey bee hexamerin subunits (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c and HEX 110), as verified by SDS-PAGE and western blot using hemolymph and fat body samples. Consistent with the canonical function, the four hexamerins were localized in the cytoplasm of fat body cells, during metamorphosis, by using specific antibodies and confocal laser-scanning microscopy. However, additional functions could be inferred by the following findings: (1) The four hexamerins were also localized in the nuclei of some fat body cells, thus tentatively suggesting an anti-apoptotic role during metamorphosis; (2) Furthermore, HEX 70a and HEX 110 were localized in the cytoplasm and nucleus of ovarian and testicular cells, pointing to a role in gonad development and maturation. Co-labeling of the thymidine analog EdU and HEX 70a in the ovariole cell nuclei, strongly suggested a role in cell proliferation; HEX 70a depletion via injection of the specific antibody in queen pupae impaired ovariole growth, thus strengthening our hypothesis on a role in cell proliferation, (3) HEX 70a depletion also impaired cuticle sclerotization, indicating a function in exoskeleton formation, and (4) led to a precocious adult ecdysis, perhaps in response to the lack (or decrease) in hexamerin-derived amino acids. We also investigated aspects of the regulation of hexamerin genes. The experimental manipulation of diet consumption and juvenile hormone (JH) titer clearly interfered in the expression of hexamerin genes. Regulation by JH was also supported by a previous bioinformatics analysis of the 5 UTR region of each hexamerin gene (Martins et al., 2010), which revealed a potential binding site for Ultraspiracle (Usp), a member of the JH receptor complex in the DNA. Experiments are in progress for in vitro expression and purification of the four hexamerins aiming to further characterize their structures and interactions. Conclusion: Taken together, these results imply in novel roles for hexamerins in the life cycle of A. mellifera in addition to their well-established role as amino acids sources for metamorphosis.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-10-03T18:43:06Z No. of bitstreams: 1 2016 - Jorge Ant?nio Casagrande Bretas.pdf: 2891351 bytes, checksum: 638557595a03b65975bc6e16746991f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-03T18:43:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Jorge Ant?nio Casagrande Bretas.pdf: 2891351 bytes, checksum: 638557595a03b65975bc6e16746991f8 (MD5) Previous issue date: 2016-08-29 / CAPES / The fat body of insects is involved in very important functions. Thus, the fat body, besides acting as a reserve site and synthesis of proteins, carbohydrates and lipids participates in the production of substances with action on the immune system, detoxification, production of eggs, sperm and pheromone. However, the main function of the fat body is the reserve of lipids. The fat body of insects is usually divided into two regions, the visceral fat body, located near the digestive tract, and the parietal fat body, located near the cuticle. The cell types found in the fat body of insects vary, being found only one type in some and more than ten kinds in others. The main cell types found in the fat body of insects are trophocytes, urocytes and oenocytes. The morphology and biochemistry of fat body Lutzomyia longipalpis, the main vector of visceral leishmaniasis in the Americas, was examined by light microscopy, electron microscopy and high-performance thin layer chromatography. Thus, cuts through the abdomen of adult males and females showed that the fatty body is divided into two main components, in accordance with the spatial distribution in the insect's body: one parietal part which is located just under the cuticle and other visceral which is distributed suspended lobes and often associated with tracheas in hemocele. The fat body of L. longipalpis contains only one cell type, trophocyte, which has a large amount of lipid droplets, protein and glycogen granules in their cytoplasm rosettes. The lipid composition varies according to the physiological and insect species. The neutral lipid stored in fat body found more insects is the triacylglycerol. In addition, small amounts of diacylglycerol, steroids, free fatty acids, carotenoids and monoglycerides are carried by lipoforina (major lipoprotein of the insects). The diacylglycerol is derived from triglycerides stored in fat body and is the main form of fatty acid which are recruited to sites of utilization such as flight muscles, for example. Biochemical analysis of the abdominal tergites L. longipalpis males, by high-performance thin layer chromatography, showed the presence of different classes of neutral lipid (mono-, di- and triacylglycerols, fatty acids, cholesterol and esterified cholesterol) and phospholipids (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine) in the fat body. Furthermore, the lipid composition of the abdominal tergites varied, with the highest amount of lipids extracted from the fourth tergite, which has pheromone producing gland. Finally, the main neutral lipid extracted from the fat body of L. longipalpis was the triacylglycerol and the main phospholipid was phosphatidylethanolamine. / O corpo gorduroso dos insetos est? envolvido em fun??es de grande import?ncia. Assim, o corpo gorduroso, al?m de atuar como s?tio de reserva e s?ntese de prote?nas, carboidratos e lip?dios participa da produ??o de subst?ncias com a??o no sistema imune, detoxifica??o, produ??o dos ?vulos, espermatozoides e de ferom?nios. Contudo, a principal fun??o do corpo gorduroso ? a reserva de lip?dios. O corpo gorduroso dos insetos normalmente ? dividido em duas regi?es, o corpo gorduroso visceral, localizado pr?ximo do tubo digestivo, e o corpo gorduroso parietal, localizado pr?ximo da cut?cula. Os tipos celulares encontrados no corpo gorduroso dos insetos variam, sendo encontrado apenas um tipo em alguns e mais de dez tipos em outros. Os principais tipos celulares encontrados no corpo gorduroso dos insetos s?o os trof?citos, ur?citos e os oen?citos. A morfologia e a bioqu?mica do corpo gorduroso de Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da leishmaniose visceral nas Am?ricas, foi analisado por microscopia de luz, microscopia eletr?nica e cromatografia em camada fina de alta performance. Assim, cortes atrav?s do abd?men de machos e f?meas adultas mostraram que o corpo gorduroso ? dividido em dois componentes principais, de acordo com a distribui??o espacial no corpo do inseto: uma parte parietal que est? localizada logo abaixo da cut?cula, e outra visceral que est? distribu?da em l?bulos suspensos e frequentemente associado a traqueias na hemocele. O corpo gorduroso de L. longipalpis cont?m somente um tipo celular, o trof?cito, o qual possui grande quantidade de got?culas de lip?dios, gr?nulos de prote?na e rosetas de glicog?nio em seu citoplasma. A composi??o lip?dica varia de acordo com a condi??o fisiol?gica e esp?cie do inseto. O lip?dio neutro estocado mais encontrado no corpo gorduroso de insetos ? o triacilglicerol. Al?m disso, pequenas quantidades de diacilglicerol, esteroides, ?cidos graxos livres, carotenoides e monoacilglicerois s?o transportadas por lipoforina (maior lipoprote?na dos insetos). O diacilglicerol ? derivado de triacilglicerois estocados no corpo gorduroso e constitui a principal forma de acido graxo que s?o mobilizadas para os s?tios de utiliza??o tal como os m?sculos de voo, por exemplo. A an?lise bioqu?mica dos tergitos abdominais de machos de L. longipalpis, atrav?s de Cromatografia em camada fina de alta performance, mostrou a presen?a de diferentes classes de lip?dios neutros (mono-, di- e triacilglicerois, ?cidos graxos, colesterol e colesterol esterificado) e fosfolip?dios (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina) no corpo gorduroso. Al?m disso, a composi??o lip?dica entre os tergitos abdominais variou, sendo a maior quantidade de lip?dios extra?dos do quarto tergito, o qual possui gl?ndulas produtoras de ferom?nio. Finalmente, o principal lip?dio neutro extra?do do corpo gorduroso de L. longipalpis foi o triacilglicerol e o principal fosfolip?dio foi a fosfatidiletanolamina.