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N-Acylethanolamines (NAEs) are enriched in seed-derived tissues and are believed to be formed from the membrane phospholipid, N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) via the action of phospholipase D (PLD). In an effort to identify a functional NAPE-PLD in cotton seeds and seedlings, we have screened a cotton seedling cDNA (cotyledon mRNA from 48 h dark grown seedlings) library with a 1.2 kb tobacco partial cDNA fragment encoding the middle third of a putative PLDβ/γ (genbank accession, AF195614) isoform. Six plaques were isolated from the Uni-ZAP lambda library, excised as pBluescript SK(-) phagemids and subjected to nucleotide sequence analysis. Alignment of derived sequences with Arabidopsis PLD family members indicated that the cDNAs represent six different PLD gene products -three putative PLD β isoforms and three putative PLD δ isoforms. The PLD β isoforms, designated Ghpldβ1a, GHpldβ1b and a truncated Ghpldβ1b isoform. Both the full-length PLD β proteins contained characteristic HKxxxxD catalytic domains, a PC-binding domain, a PIP2-binding domain and a C2 domain. In addition both cotton PLD β isoforms had a N-terminal "SPQY" rich domain which appeared to be unique to these PLDs. The three PLD δ isoforms, designated Ghpldδ1a, Ghpldδ1b and Ghpldδ1b-2 encode full-length PLDδ proteins, and like the above PLDs, contained the characteristic catalytic and regulatory domains. The expression of Ghpldδ1b showed hydrolytic and transphosphatidylation activity toward radiolabelled phosphatidylcholine (PC) but it appears Ghpldδ1b does not utilize NAPE as a substrate to produce NAEs nor does it seem to be suppressed by NAEs.

N-acylation of phosphatidylethanolamine (PE) with free fatty acids catalyzed by N-acyl phosphatidylethanolamine (NAPE) synthase was reported in cotyledons of 24-h-old cotton seedlings. Here I report subcellular localization of this enzyme. Differential centrifugation, sucrose density gradient fractionation,aqueous two-phase partitioning and electron microscopy techniques were utilized to elucidate subcellular site(s) of NAPE synthase. Marker enzymes were used to locate organelles in subcellular fractions. Differential centrifugation indicated that NAPE synthase is present in more than one organelle and it is a membrane bound enzyme. Sucrose density gradient fractionations indicated that NAPE synthase is present in membranes derived from endoplasmic reticulum (ER),Golgi and possibly plasma membrane (PM) but not mitochondria, glyoxysomes or plastids. Aqueous two-phase partitioning experiments with cotton and spinach tissues supported these results but Goigi appeared to be the major site of NAPE synthesis. Electron microscopy of subcellular fractions was used to examine isolated fractions to provide visual confirmation of our biochemical results. Collectively, these results indicate that NAPE is synthesized in plant ER, Golgi and possibly PM.

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Submitted by Deyse Queiroz (deysequeirozz@hotmail.com) on 2018-06-13T12:15:00Z No. of bitstreams: 1 MARIA DO SOCORRO ROCHA - DISSERTAÇÃO PPGEA 2004..pdf: 12014866 bytes, checksum: e5b21eb998760e2ed7cd6bdeddf94a3e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-13T12:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARIA DO SOCORRO ROCHA - DISSERTAÇÃO PPGEA 2004..pdf: 12014866 bytes, checksum: e5b21eb998760e2ed7cd6bdeddf94a3e (MD5) Previous issue date: 2004-11 / A conservação e manipulação dos recursos genéticos vegetais de espécies de valor económico são de fundamental importância para a conservação em banco de germoplasma. Este trabalho teve como objetivo; a) avaliar a crioconservação de sementes de algodão das cultivares BRS-Verde, BRS-200, BRS-187-8H e 6MMocó e b) estudar a indução ao superbrotamento dos nós cotiledonares de plântulas do algodoeiro cultivados in vitro, para as mesmas cultivares supracitadas. Neste trabalho propôs-se inicialmente determinar do teor de água limite para crioconservação (TALC). Para esta determinação as sementes foram imersas ao nitrogénio líquido (-196°C) por cinco dias e após esse período elas forma descongelados e submetidas ao teste de germinação e vigor. Utilizou as armazenagem das sementes a 23°C por 5 dias como testemunha. O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado com arranjo fatorial representado por (quatro cultivares x duas temperaturas x seis teor de água). Na crioconservação utilizou-se um lote de sementes com teor de água limite previamente determinado para as diferentes cultivares, a partir do qual se procedeu ao seu armazenamento em nitrogénio líquido (-196°C) e no vapor do nitrogénio (-170°C), durante 5, 30, 60 e 90 dias. O delineamento experimental utilizado nesta etapa foi o inteiramente casualizado em parcela sub-dividida no tempo, sendo a parcela representas pela interação (quatro cultivares x duas temperaturas de armazenamento) e a sub-parcela pelos quatro períodos de armazenamento. Em cada período de armazenamento, as sementes foram submetidas a testes de germinação e vigor. De acordo com os resultados obtidos póde-se concluir que: a) estudar a determinação do teor de água limite para crioconservação-TALC, durante 5 dias, o teor de água limite para a crioconservação das cultivares BRS-Verde, BRS-200, 6M-Mocó e BRS-187-8H considerando-se a germinação dessas cultivares está entre 6 e 8% (b.u.) e considerando-se o vigor das sementes o TALC é de 6% (b.u.); b) sementes de algodoeiro, das diferentes cultivares podem ser crioconservados em banco de germoplasma nas duas temperaturas, ou seja no vapor a -170°C ou imersa ao nitrogénio líquido a -196°C; c) a crioconservação aumenta o percentual de germinação e vigor das sementes de algodão, devido a essa temperatura a promover uma quebra de dormência pela ação do frio. No Capítulo II propôs-se a indução de superbrotamento, empregando como explante dos nós cotiledonares, plântulas cultivadas in vitro durante 25 dias. Os explantes foram cultivados em tubos de ensaio contendo o meio básico MS, suplementado com citocininas BAP, KIN e TDZ, isolados ou associados em diferentes concentrações. Os tubos de ensaio contendo os explantes foram mantidos em sala de crescimento regulada à temperatura de 28°C, fotoperíodo de 16/8h (claro/escuro) e intensidade luminosa de 50umol.m2.s1 , durante 40 dias os quais foram avaliados por meio do delineamento inteiramente casualizado, com arranjo fatorial de 4x17 (quatro cultivares x dezessete meios), sendo então avaliadas quanto ao número de brotos emitidos e altura de brotos. De acordo com os resultados obtidos póde-se concluir que: O meio MS suplementados com BAP (2,0 mg.L"1) isolado ou associado com KIN (1,0mg.L"1), promoveu uma maior capacidade de regeneração e altura de brotos; b) o meio MS suplementados com BAP (2,5 mg.L"1) estimulou maior altura de brotos;c)o meio MS suplementados com TDZ (1,0 mg.L"1 , 0,50 mg.L"1e 0,25 mg.L"1) afetou a capacidade de regeneração de brotos, obteve formação de calos. / A conservação e manipulação dos recursos genéticos vegetais de espécies de valor económico, são de fundamental importância para a conservação em banco de germoplasma. Este trabalho teve como objetivo: a) avaliar a crioconservação de sementes de algodão das cultivares BRS-Verde, BRS-200- Marrom, BRS-187-8H-Branco e 6 M-Mocó-Branco e b) estudar a indução ao superbrotamento dos nós cotiledonares de plântulas do algodoeiro cultivados in vitro, para as mesmas cultivares supracitadas. Inicialmente, determina-se do teor de água limite para crioconservação (TALC). Para esta determinação, as sementes foram imersas no nitrogénio líquido (-196°C) durante cinco dias e após este período elas foram descongelados e submetidas ao teste de germinação e vigor. Utilizou-se a armazenagem das sementes a 23°C por 5 dias, como testemunha. O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado com arranjo fatorial representado por (quatro cultivares x duas temperaturas x seis teores de água). Na crioconservação utilizou-se um lote de sementes com teor de água limite previamente determinado para as diferentes cultivares, a partir do qual se procedeu ao seu armazenamento em nitrogénio líquido (-196°C) e no vapor do nitrogénio (-170°C), durante 5, 30, 60 e 90 dias. O delineamento experimental usado nesta etapa foi o inteiramente casualizado, em parcela subdividida no tempo, sendo a parcela representada pela interação (quatro cultivares x duas temperaturas de armazenamento) e a subparcela pelos quatro períodos de armazenamento. Em cada período de armazenamento as sementes foram submetidas a testes de germinação e vigor. De acordo com os resultados obtidos concluiu-se que: a) O teor de água limite para crioconservação-TALC, durante 5 dias, para a crioconservação das cultivares BRS-Verde, BRS-200-Marrom, 6MMocó- Branco e BRS-187-8H-Branco, considerando-se a germinação dessas cultivares está entre 6 e 8% (b.u.) e, quanto os vigor das sementes, o TALC foi de 6% (b.u.); b) sementes de algodoeiro das diferentes cultivares podem ser crioconservadas em banco de germoplasma, nas duas temperaturas, ou seja, no vapor a -170°C ou imersa ao nitrogénio líquido a -196°C; c) a crioconservação aumenta o percentual de germinação e vigor das sementes de algodão, em virtude dessa temperatura promover quebra de dormência, pela ação do frio. No Capítulo II propôs-se a indução de superbrotamento, empregando-se como explante nós cotiledonares de plântulas cultivadas in vitro durante 25 dias. Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo o meio básico MS, suplementado com citocininas BAP, KIN e TDZ, isolados ou associados a diferentes concentrações. Os tubos de ensaio contendo os explantes foram mantidos em sala de crescimento regulada à temperatura de 28°C, fotoperíodo de 16/8h (claro/escuro) e intensidade luminosa de 50umol.m2.s1 , durante 40 dias, os quais foram avaliados por meio do delineamento inteiramente casualizado, com arranjo fatorial de 4x17 (quatro cultivares x dezessete meios), sendo então avaliadas quanto ao número de brotos emitidos e altura do comprimento de brotos. De acordo com os resultados obtidos pôde-se concluir que: a) o meio MS suplementado com BAP (2,0mg.L~1) isolado ou associado a KIN (1,0mg.L~1), promoveu maior capacidade de regeneração e altura de brotos; b) o meio MS suplementado com BAP(2,5mg.L"1 ) estimulou altura superior de brotos; c) o meio MS suplementado com TDZ (1,0mg.L~1, 0,50mg.L"1 e 0,25mg.L"1) afetou a capacidade de regeneração de brotos e a formação de calos.