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Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. / Crystal structure of Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) with bound GMP.

Monzani, Paulo Sérgio 20 March 2003 (has links)
O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.
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Relação entre nanomorfologia e reatividade de eletrodos não-enzimaticos modificados para a determinação de analitos de interesse biológico / Relationship between nanomorphology and reactivity of electrodes modified non-enzymatic for the determination of analytes of biological interest

Pastrián, Fabián Andree Cerda 17 August 2018 (has links)
Na constante busca de novas estratégias para melhorar a atividade catalítica, foi que a começos do século passado, a síntese de nanopartículas de formato controlado, tornou-se em um dos acontecimentos que revolucionaram a abordagem catalítica da Química, criando assim a linha da nanociência, onde com a síntese de nanopartículas de formato ao nível nano, é possível controlar as propriedades catalíticas dos materiais a nível macroscópico. O presente trabalho apresenta, a síntese de nanopartículas de óxido cuproso (NPs-Cu2O) com faces cristalográficas controladas. Foi possível sintetizar estruturas cúbicas, esféricas, e octaédricas, sendo os cubos e octaedros os que possuem faces cristalográficas de tipo (100) e (111), respectivamente. Entretanto, as esferas possuem uma mistura entre ambas das faces. As propriedades catalíticas das NPs-Cu2O foram testadas eletroquimicamente mediante uma reação modelo de detecção de glicose. As NPs-Cu2O, foram sintetizadas em médio básico com cloreto de cobre (CuC12) como percursor, posteriormente com concentrações diferentes de cloridrato de hidroxilamina (NH2OHoHCI) foram obtidas NPs-Cu2O com estrutura cúbica, octaédrica e esférica. Posteriormente, foram imobilizadas numa superfície de eletrodo de carbono vítreo, mediante a técnica de casting. A oxidação catalítica da glicose, permitiu observar que o desempenho da estrutura cúbica fossesuperior, com uma sensibilidade de 442 ± 7 µA mM-1 cm-2, enquanto as estruturas esféricas e octaédricas foram de 165 ± 3 µA mM-1 cm-2 e 38 ± 1 µA mM-1 cm-2, respectivamente. Seguido as NPs-Cu2O, foram testadas na presença de Ácido Ascórbico (AA) e Ácido Úrico (UA), foi observado que os cubos possuem uma seletividade única, comparada com as outras estruturas. Dito comportamento foi estudado com Analise computacional (DFT), onde foi possível de observar que a distribuição entre átomos de Cobre e Oxigênio, determina a seletividade do material. Numa segunda etapa, para entender a importância da conservação estrutural e integridade morfológica, foram testadas as NPs-Cu2O, aos diferentes dias após de ser sintetizadas, observando claramente uma relação entre estrutura e atividade catalítico. Foi observado que nas estruturas cúbicas o deterioro foi maior em comparação com as outras estruturas, isto acompanhado mediante DFT, foi determinado que estrutura cúbica apresenta uma maior interação com o oxigênio, provocando assim, que a rápida transformação de Cu(I) para Cu(II), como CuO. Por último as NPs-Cu2O, foram testadas por espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS), este analise ajudou a compreender que o desempenho catalítico, não estava relacionado com a formação de Cu (III). Estes resultados foram apoiados pelos resultados obtidos pela espectroscopia de infravermelho in situ (FTIR), já que nessa análise foi possível de observar como o estabilizante (SDS), foi determinante em cada estrutura. / In the constant search for new strategies by advance of catalytic activities, was that at the beginning of the last century the synthesis of nanoparticles in a controlled format, became one of the events that revolutionized the catalytic approach of Chemistry, thus creating a line of nanoscience, where with the synthesis of nanoparticles of format at the nano level, it is possible to control catalytic properties of materiais at the macroscopic level. Consequently, the present work the synthesis of cuprous oxide nanoparticles (Cu2O-NPs), with crystallography faces welldefined. It was possible synthesize cubic, spherical and octahedral structure, the cubes and octahedrons being those having crystallographic faces of type (100) and (111), respectively. Meanwhile, the spheres have a mixture between both faces. The catalytic properties of Cu2O-NPs were electrochemically tested by a model glucose detection reaction. The Cu2O-NPs were synthetized in basic solution with cooper chlorate (CuCl2) like precursor, after with different concentration of hydroxylamine hydrochloride (NH2OH· HCl) were obtain cubic, spheres and octahedral structure. Posteriorly, were immobilized in a glassy carbon surface, through the technique of casting. The catalyst oxidation of glucose allowed observe that the performance of cubic structure was superior, with a sensibility of 442 ± 7 µA mM-1 cm-2, while the spheres and octahedral structure were 165 ± 3 µA mM-1 cm-2 e 38 ± 1 µA mM-1 cm-2, respectively. Following the Cu2O-NPs, they were tested in the presence of Ascorbic Acid (AA) and Uric Acid (UA), it was observed that the cubes have a unique selectivity compared to the other Cu2O-NPs structure. This behavior was studies with com putational analysis (DFT), where it was possible to observed that the distribution between copper and oxygen atoms determines the selectivity of material. In a second step, to understand the importance of structure conservation and morphological integrity, Cu2O-NPs were tested at different days after being synthesized, noting clearly a relation between structure and catalytic activity. It was observed that cubic structure the deterioration was greater in comparation with the other structures, this being accompanied by DFT, it was determinate that cubic structure show a greater interaction with the oxygen, thus provoking that rapid transformation of Cu (I) to Cu(II), like CuO. Finally, the Cu2O-NPs were tested by x-ray excited photoelectron spectroscopy (XPS), this analysis helped to understand the catalytic activity was not related to Cu (III) formation. These results were supported by those obtained by in situ (FTIR), since in this analysis it was possible to observe how the stabilizer (SDS) was determinant in each structure.
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Caracterização estrutural e funcional das isoformas da enzima fumarato hidratase de Trypanosoma cruzi / Structural and functional characterization of Trypanosoma cruzi fumarate hydratase isoforms.

Pádua, Ricardo Augusto Pereira de 14 March 2014 (has links)
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 ?M e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamento / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 ?M and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.
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Estudos da correlação entre estrutura e função da enzima fumarato hidratase em Leishmania major / tructure-function relationship studies of fumarate hydratase from Leishmania major

Feliciano, Patrícia Rosa 07 October 2013 (has links)
Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pelas Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas, que causam um risco a 350 milhões de pessoas em todo o mundo. As fumarato hidratases (FHs) são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, apontam essas enzimas como potenciais alvos para o planejamento de compostos com ação tripanossomicida e leishmanicida. O presente trabalho visou à caracterização funcional e estrutural das enzimas fumarato hidratase de Leishmania major através da determinação da estrutura por técnicas de difração de raios-X em monocristais, aliadas a técnicas espectroscópicas, de mutagênese sítio dirigida e simulação de dinâmica molecular. A susceptibilidade dessa classe de enzimas ao oxigênio devido a presença de um complexo do tipo [4Fe-4S] exigiu a utilização de técnicas modernas para a realização dos experimentos em condição de anaerobiose. A estrutura da isoforma citosólica da FH em L. major (LmFH-2) foi determinada por técnicas de difração de raios-X em monocristais e consiste na primeira estrutura de uma proteína da classe I das FHs a ser determinada. O enovelamento de LmFH-2 foi descrito como novo e consiste em uma proteína dimérica na qual cada monômero apresenta dois domínios denominados domínios N- e C- terminais, que possuem grande mobilidade entre si. A análise das estruturas cristalográficas de LmFH-2 em complexo com o substrato malato e os inibidores malonato e succinato, associada aos estudos de dinâmica molecular, nos permitiu propor que a mobilidade entre os domínios está associada à entrada do substrato no sítio ativo. Os dados estruturais corroborados pelos dados espectroscópicos e bioquímicos foram utilizados para mapear o sítio ativo e construirmos um modelo para descrever o mecanismo de ação enzimática adotado por essa classe de enzimas. Na tentativa de dar ínicio à validação do nosso modelo, o resíduo conservado Thr467, pertencente ao sítio ativo da LmFH-2 e identificado como importante na interação com o substrato, teve seu papel catalítico avaliado através da combinação de técnicas de mutação sítio-dirigida associada a estudos cinéticos e estruturais. A perda significativa na atividade da proteína mutante LmFH-2-T467A fortaleceu nossas hipóteses de que a Thr467 poderia atuar como ácido ou base no mecanismo RESUMO | II de ação das FHs da classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho nos fornecerão as bases estruturais para o mapeamento acerca do mecanismo catalítico adotado pelas enzimas fumarato hidratase da classe I, assim como, para o planejamento de ligantes específicos como uma importante ferramenta na avaliação do potencial desta classe de enzimas como alvo para o desenvolvimento de novas terapias contra a Leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, classified as neglected tropical diseases, with 350 million people at risk of infection. Fumarate hydratases (FH) are enzymes that catalyze the stereospecific reversible hydratation of fumarate to S-malate and recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes are essential for the parasite survival and should be exploited as potential targets for the development of new therapies against trypanosomatid related diseases. The present work focused the functional and structural characterization of both fumarate hydratase enzymes from Leishmania major by a combination of crystallographic, spectroscopic, site-direct mutagenesis and molecular dynamics techniques. The susceptibility to oxygen observed for this class of proteins due to the presence of a [4Fe-4S] cluster required the use of state-of-art infrastructure to perform the experiments under anaerobic environment. The structure of LmFH-2 has been determined by X-ray diffraction techniques and consists of the first class I FH structure to be reported. LmFH-2 folding has been found to be unique and consists of a dimer with each monomer composed of two major domains named N- and C-terminal domains. The analysis of the crystallographic structure of LmFH-2 in complex with the substrate malate and with both inhibitors malonate and succinate has allowed us to propose that the movement observed between both N- and C-domains is associated to the entrance of the substrate into the active site. The structural data corroborated with biochemical and spectroscopic studies have been used to map the active site and to build a model to describe the mechanism of action adopted by this class of enzymes. As our first attempt to validate our model, the residue Thr467 that belongs to the active site and has been identified as important in the interaction with the substrate, had its catalytic role evaluated by site-direct mutagenesis in combination with kinetic and structural studies. The significant loss in activity observed for the mutant LmFH-2-T467A supports our hypothesis that Thr467 can act as either acid or base during catalysis. Our results have provided the structural basis for the complete mapping of the catalytic mechanism adopted by fumarate hydratase enzymes, as well as for the design of specific ligands as an important tool for evaluating FHs as drug targets in development of new therapies against Leishmaniasis.
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Estrutura cristalográfica da lectina de sementes da Canavalia maritima Aub, em complexo com o ácido gamaaminobutírico (GABA) e a adenina revela novas características estruturais e prediz mecanismo anti-herbivoria

Silva Filho, José Caetano da 16 August 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5234352 bytes, checksum: 404f7b4f1ab797fa6090d6cd85ee8163 (MD5) Previous issue date: 2013-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plants are sessile organisms susceptible to biotic and abiotic stresses. Insect herbivore attacks are factors that affect their survival and development. To defend themselves, plants produce and release chemical compounds, such as non protein amino acids, that negatively affect the development processes of their attackers, as well as use phytohormones that regulate defense responses against herbivory. In the present work, we seek to understand in depth the insecticidal activity related to ConM, a lectin isolated from beach bean seeds (Canavalia maritima Aub.), through their crystal structure analysis in complex with the non protein amino acid GABA (gamma-aminobutyric acid) and adenine, a nitrogen base-precursor of cytokinins, phytohormones involved in defense responses against insect herbivores. In this way, we co-crystallized ConM with GABA and soaked the derived crystals into an adenine 5mM solution. It was viewed through ConM monomeric model that GABA stabilization occurs through interactions displayed with amino acid residues that participate in the coordination of its isomer alpha-aminobutyric acid (Abu). In the other hand, adenine molecule displays interactions with amino acid residues from ConM Carbohydrate Recognition Domain due ahydrophobic pocket adjacently localized to this ligand-binding site and formed from a secondary non repetitive structure of β-bulge. A dimeric model of ConM reveals that lectin insecticidal activity is related to conformational changes of Gln132, resulting in GABA release without quaternary structure change. Hence, the presented results might contribute to greater understanding of lectins interactions with different chemical ligands, helping their application as biotechnological tools. / Plantas são organismos sésseis que encontram-se susceptíveis a estresses bióticos e abióticos. O ataque de insetos herbívoros é um fator que afeta sua sobrevivência e seu desenvolvimento. Como defesa, estes organismos são capazes de produzir e liberar compostos químicos, como aminoácidos não proteicos, que interferem no desenvolvimento dos insetos agressores, e utilizam fitohormônios para regular suas respostas de defesa. No presente trabalho, buscamos entender o papel inseticida da ConM, uma lectina isolada de sementes do feijão-de-praia (Canavalia maritima Aub.), a partir da análise de sua estrutura tridimensional em complexo com o aminoácido não proteico GABA (ácidogama-aminobutírico) e com a base nitrogenada adenina, precursora das citocininas, fitohormônios envolvidos com processos de defesa contra insetos herbívoros. Para tanto, resolvemos a estrutura cristalográfica da ConM co-cristalizada com o GABA e soaked com a adenina 5mM. O modelo monomérico da lectina mostrou que o GABA encontra-se coordenado por interações com resíduos de aminoácidos previamente reportados como sendo participantes da estabilização do ácido alfaaminobutírico (Abu). A adenina, por outro lado, é estabilizada por interações com resíduos constituintes do domínio de reconhecimento a carboidrato da ConM, o que pode ser explicado pela presença de uma região hidrofóbica adjacente a este sítio, formada por uma estrutura secundária não repetitiva do tipo β-bulge. Um modelo dimérico da ConM revela que a atividade inseticida de lectinas está relacionada com mudanças conformacionais da Gln132, permitindo que o GABA seja liberado sem alteração da estrutura quaternária. Assim, os resultados aqui apresentados podem contribuir para um maior entendimento acerca da capacidade de interação de lectinas vegetais com diferentes tipos de ligantes, facilitando sua utilização como ferramenta biotecnológica.
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Estrutura cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP. / Crystal structure of Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) with bound GMP.

Paulo Sérgio Monzani 20 March 2003 (has links)
O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.
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Estudos da correlação entre estrutura e função da enzima fumarato hidratase em Leishmania major / tructure-function relationship studies of fumarate hydratase from Leishmania major

Patrícia Rosa Feliciano 07 October 2013 (has links)
Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pelas Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas, que causam um risco a 350 milhões de pessoas em todo o mundo. As fumarato hidratases (FHs) são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, apontam essas enzimas como potenciais alvos para o planejamento de compostos com ação tripanossomicida e leishmanicida. O presente trabalho visou à caracterização funcional e estrutural das enzimas fumarato hidratase de Leishmania major através da determinação da estrutura por técnicas de difração de raios-X em monocristais, aliadas a técnicas espectroscópicas, de mutagênese sítio dirigida e simulação de dinâmica molecular. A susceptibilidade dessa classe de enzimas ao oxigênio devido a presença de um complexo do tipo [4Fe-4S] exigiu a utilização de técnicas modernas para a realização dos experimentos em condição de anaerobiose. A estrutura da isoforma citosólica da FH em L. major (LmFH-2) foi determinada por técnicas de difração de raios-X em monocristais e consiste na primeira estrutura de uma proteína da classe I das FHs a ser determinada. O enovelamento de LmFH-2 foi descrito como novo e consiste em uma proteína dimérica na qual cada monômero apresenta dois domínios denominados domínios N- e C- terminais, que possuem grande mobilidade entre si. A análise das estruturas cristalográficas de LmFH-2 em complexo com o substrato malato e os inibidores malonato e succinato, associada aos estudos de dinâmica molecular, nos permitiu propor que a mobilidade entre os domínios está associada à entrada do substrato no sítio ativo. Os dados estruturais corroborados pelos dados espectroscópicos e bioquímicos foram utilizados para mapear o sítio ativo e construirmos um modelo para descrever o mecanismo de ação enzimática adotado por essa classe de enzimas. Na tentativa de dar ínicio à validação do nosso modelo, o resíduo conservado Thr467, pertencente ao sítio ativo da LmFH-2 e identificado como importante na interação com o substrato, teve seu papel catalítico avaliado através da combinação de técnicas de mutação sítio-dirigida associada a estudos cinéticos e estruturais. A perda significativa na atividade da proteína mutante LmFH-2-T467A fortaleceu nossas hipóteses de que a Thr467 poderia atuar como ácido ou base no mecanismo RESUMO | II de ação das FHs da classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho nos fornecerão as bases estruturais para o mapeamento acerca do mecanismo catalítico adotado pelas enzimas fumarato hidratase da classe I, assim como, para o planejamento de ligantes específicos como uma importante ferramenta na avaliação do potencial desta classe de enzimas como alvo para o desenvolvimento de novas terapias contra a Leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, classified as neglected tropical diseases, with 350 million people at risk of infection. Fumarate hydratases (FH) are enzymes that catalyze the stereospecific reversible hydratation of fumarate to S-malate and recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes are essential for the parasite survival and should be exploited as potential targets for the development of new therapies against trypanosomatid related diseases. The present work focused the functional and structural characterization of both fumarate hydratase enzymes from Leishmania major by a combination of crystallographic, spectroscopic, site-direct mutagenesis and molecular dynamics techniques. The susceptibility to oxygen observed for this class of proteins due to the presence of a [4Fe-4S] cluster required the use of state-of-art infrastructure to perform the experiments under anaerobic environment. The structure of LmFH-2 has been determined by X-ray diffraction techniques and consists of the first class I FH structure to be reported. LmFH-2 folding has been found to be unique and consists of a dimer with each monomer composed of two major domains named N- and C-terminal domains. The analysis of the crystallographic structure of LmFH-2 in complex with the substrate malate and with both inhibitors malonate and succinate has allowed us to propose that the movement observed between both N- and C-domains is associated to the entrance of the substrate into the active site. The structural data corroborated with biochemical and spectroscopic studies have been used to map the active site and to build a model to describe the mechanism of action adopted by this class of enzymes. As our first attempt to validate our model, the residue Thr467 that belongs to the active site and has been identified as important in the interaction with the substrate, had its catalytic role evaluated by site-direct mutagenesis in combination with kinetic and structural studies. The significant loss in activity observed for the mutant LmFH-2-T467A supports our hypothesis that Thr467 can act as either acid or base during catalysis. Our results have provided the structural basis for the complete mapping of the catalytic mechanism adopted by fumarate hydratase enzymes, as well as for the design of specific ligands as an important tool for evaluating FHs as drug targets in development of new therapies against Leishmaniasis.
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Caracterização estrutural e funcional das isoformas da enzima fumarato hidratase de Trypanosoma cruzi / Structural and functional characterization of Trypanosoma cruzi fumarate hydratase isoforms.

Ricardo Augusto Pereira de Pádua 14 March 2014 (has links)
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado que ao infectar seres humanos causa a doença de Chagas, uma doença tropical negligenciada que afeta milhões de pessoas no mundo todo. As fumarato hidratases (FH), ou fumarases, são enzimas que catalisam a reação estéreo-específica reversível de hidratação do fumarato em S-malato, e foram recentemente consideradas essenciais para a viabilidade do parasito Trypanosoma brucei, sugerindo seu potencial como alvo macromolecular para o desenvolvimento de novos fármacos tripanocidas. O presente trabalho visou à caracterização funcional, bioquímica, biofísica e estrutural das fumarases de T. cruzi (TcFHs) e humana (HsFH) de forma a avaliar o papel das TcFHs para o parasito Trypanosoma cruzi, mapear o mecanismo de ação e identificar as diferenças entre TcFHs e a enzima humana de forma a serem exploradas no planejamento de inibidores seletivos às fumarases do parasito. Análise das sequências mostrou que TcFHs pertencem à classe I das fumarases (enzimas diméricas dependentes de ferro) e não são homólogas à HsFH que pertence a classe II (tetraméricas independentes de ferro). Estudos de localização celular confirmaram a existência de duas fumarases em T. cruzi, uma citosólica (TcFHc) e uma mitocondrial (TcFHm), e experimentos de nocaute gênico sugeriram que essas enzimas são essências para o parasito. A caracterização cinética das enzimas TcFHc, TcFHm e HsFH mostrou que as fumarases de T. cruzi são sensíveis ao oxigênio enquanto a enzima humana se mantém ativa em condições aeróbicas. Estudos de ressonância eletrônica paramagnética mostraram a presença de um cluster de ferro-enxofre, sensível a oxidação por oxigênio, envolvido no mecanismo enzimático das enzimas TcFHs. Modelos estruturais das TcFHs, construídos por homologia à estrutura cristalográfica da fumarase de Leishmania major, foram comparados à estrutura cristalográfica obtida para a fumarase humana e as diferenças entre as duas estruturas foram utilizadas no planejamento de ligantes seletivos às fumarases do parasito. O ligante planejado inibiu a fumarase citosólica de T. cruzi na faixa de 1 ?M e não apresentou efeito na atividade da enzima humana. Testes in vivo demonstraram o efeito tripanocida do inibidor provavelmente por interferir na produção de ATP pela mitocôndria do T. cruzi. Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto apresentam uma proposta inovadora no desenvolvimento de novas terapias contra a doença de Chagas, o uso da enzima fumarase como alvo macromolecular, assim como apresenta um inibidor potente e seletivo para a enzima do parasito a ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de fármacos contra Trypanosoma cruzi. A síntese de moléculas análogas ao inibidor de forma a melhorar suas propriedades farmacológicas encontra-se em andamento / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan parasite that infects humans and causes Chagas disease, a tropical neglected disease that affects millions of people worldwide. Fumarate hydratases (FH), or fumarases, are enzymes responsible for the reversible stereo-specific hydration of fumarate into S-malate, and were recently considered to be essential to Trypanosoma brucei viability, suggesting, therefore, a potential role for FHs as macromolecular targets to the drug development against trypanosomatids. The present work focused on the functional, biochemical, biophysical and structural characterization of T. cruzi fumarases (TcFHs) and human fumarase (HsFH) to evaluate TcFHs role for T. cruzi, map the reaction mechanism and identify and exploit differences between the parasite and host enzymes in order to design selective inhibitors to the parasite enzyme. Sequence analysis revealed that TcFHs belong to class I fumarases (dimeric and iron-sulfur containing enzymes) and are not homologous to HsFH which belongs to class II fumarases (tetrameric iron independent enzymes). Cellular sub-localization studies confirmed the presence of a cytosolic and a mitochondrial fumarases in T. cruzi and gene knockout experiments suggested TcFHs are essential to the parasite. The kinetic characterization showed that TcFHs activity is highly sensitive to oxygen whereas HsFH activity remained stable in aerobic conditions. Electron paramagnetic experiments further revealed the presence of an iron-sulfur cluster highly sensitive to oxidation and involved in the catalytic mechanism in both TcFHm and TcFHc. TcFHs structural models, built by homology modeling using the Leishmania major fumarase crystal structure as template, were compared to the HsFH crystal structure and the differences were used to design a selective ligand to the parasite fumarases. The designed ligand showed to inhibit TcFHc with an IC50 of 1 ?M and showed no effect on the human fumarase activity. In vivo assays using T. cruzi epimastigotes demonstrated the trypanocidal effect of the designed inhibitor probably caused by stalling ATP production. The results obtained with the development of this project represent an innovative proposal on the development of new therapies against Chagas disease, the use of fumarase enzyme as a macromolecular target, as well as present a potent and selective inhibitor to the parasite enzyme to be further used as a prototype in the development of drugs against Chagas disease. The synthesis of inhibitor analogues with optimized pharmacological properties are currently in progress.
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Relação entre nanomorfologia e reatividade de eletrodos não-enzimaticos modificados para a determinação de analitos de interesse biológico / Relationship between nanomorphology and reactivity of electrodes modified non-enzymatic for the determination of analytes of biological interest

Fabián Andree Cerda Pastrián 17 August 2018 (has links)
Na constante busca de novas estratégias para melhorar a atividade catalítica, foi que a começos do século passado, a síntese de nanopartículas de formato controlado, tornou-se em um dos acontecimentos que revolucionaram a abordagem catalítica da Química, criando assim a linha da nanociência, onde com a síntese de nanopartículas de formato ao nível nano, é possível controlar as propriedades catalíticas dos materiais a nível macroscópico. O presente trabalho apresenta, a síntese de nanopartículas de óxido cuproso (NPs-Cu2O) com faces cristalográficas controladas. Foi possível sintetizar estruturas cúbicas, esféricas, e octaédricas, sendo os cubos e octaedros os que possuem faces cristalográficas de tipo (100) e (111), respectivamente. Entretanto, as esferas possuem uma mistura entre ambas das faces. As propriedades catalíticas das NPs-Cu2O foram testadas eletroquimicamente mediante uma reação modelo de detecção de glicose. As NPs-Cu2O, foram sintetizadas em médio básico com cloreto de cobre (CuC12) como percursor, posteriormente com concentrações diferentes de cloridrato de hidroxilamina (NH2OHoHCI) foram obtidas NPs-Cu2O com estrutura cúbica, octaédrica e esférica. Posteriormente, foram imobilizadas numa superfície de eletrodo de carbono vítreo, mediante a técnica de casting. A oxidação catalítica da glicose, permitiu observar que o desempenho da estrutura cúbica fossesuperior, com uma sensibilidade de 442 ± 7 µA mM-1 cm-2, enquanto as estruturas esféricas e octaédricas foram de 165 ± 3 µA mM-1 cm-2 e 38 ± 1 µA mM-1 cm-2, respectivamente. Seguido as NPs-Cu2O, foram testadas na presença de Ácido Ascórbico (AA) e Ácido Úrico (UA), foi observado que os cubos possuem uma seletividade única, comparada com as outras estruturas. Dito comportamento foi estudado com Analise computacional (DFT), onde foi possível de observar que a distribuição entre átomos de Cobre e Oxigênio, determina a seletividade do material. Numa segunda etapa, para entender a importância da conservação estrutural e integridade morfológica, foram testadas as NPs-Cu2O, aos diferentes dias após de ser sintetizadas, observando claramente uma relação entre estrutura e atividade catalítico. Foi observado que nas estruturas cúbicas o deterioro foi maior em comparação com as outras estruturas, isto acompanhado mediante DFT, foi determinado que estrutura cúbica apresenta uma maior interação com o oxigênio, provocando assim, que a rápida transformação de Cu(I) para Cu(II), como CuO. Por último as NPs-Cu2O, foram testadas por espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS), este analise ajudou a compreender que o desempenho catalítico, não estava relacionado com a formação de Cu (III). Estes resultados foram apoiados pelos resultados obtidos pela espectroscopia de infravermelho in situ (FTIR), já que nessa análise foi possível de observar como o estabilizante (SDS), foi determinante em cada estrutura. / In the constant search for new strategies by advance of catalytic activities, was that at the beginning of the last century the synthesis of nanoparticles in a controlled format, became one of the events that revolutionized the catalytic approach of Chemistry, thus creating a line of nanoscience, where with the synthesis of nanoparticles of format at the nano level, it is possible to control catalytic properties of materiais at the macroscopic level. Consequently, the present work the synthesis of cuprous oxide nanoparticles (Cu2O-NPs), with crystallography faces welldefined. It was possible synthesize cubic, spherical and octahedral structure, the cubes and octahedrons being those having crystallographic faces of type (100) and (111), respectively. Meanwhile, the spheres have a mixture between both faces. The catalytic properties of Cu2O-NPs were electrochemically tested by a model glucose detection reaction. The Cu2O-NPs were synthetized in basic solution with cooper chlorate (CuCl2) like precursor, after with different concentration of hydroxylamine hydrochloride (NH2OH· HCl) were obtain cubic, spheres and octahedral structure. Posteriorly, were immobilized in a glassy carbon surface, through the technique of casting. The catalyst oxidation of glucose allowed observe that the performance of cubic structure was superior, with a sensibility of 442 ± 7 µA mM-1 cm-2, while the spheres and octahedral structure were 165 ± 3 µA mM-1 cm-2 e 38 ± 1 µA mM-1 cm-2, respectively. Following the Cu2O-NPs, they were tested in the presence of Ascorbic Acid (AA) and Uric Acid (UA), it was observed that the cubes have a unique selectivity compared to the other Cu2O-NPs structure. This behavior was studies with com putational analysis (DFT), where it was possible to observed that the distribution between copper and oxygen atoms determines the selectivity of material. In a second step, to understand the importance of structure conservation and morphological integrity, Cu2O-NPs were tested at different days after being synthesized, noting clearly a relation between structure and catalytic activity. It was observed that cubic structure the deterioration was greater in comparation with the other structures, this being accompanied by DFT, it was determinate that cubic structure show a greater interaction with the oxygen, thus provoking that rapid transformation of Cu (I) to Cu(II), like CuO. Finally, the Cu2O-NPs were tested by x-ray excited photoelectron spectroscopy (XPS), this analysis helped to understand the catalytic activity was not related to Cu (III) formation. These results were supported by those obtained by in situ (FTIR), since in this analysis it was possible to observe how the stabilizer (SDS) was determinant in each structure.
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Influência da laminação assimétrica nas propriedades mecânicas do alumínio AA 1050 / Assymetric rolling influence on the AA1050 Aluminum mechanical properties

Zanchetta, Bianca Delazari 27 April 2017 (has links)
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However when submitted to deep drawing earing appears, caused by the plastic anisotropy resulting from the production process. After annealing the main texture is cube {001} , that is recognized as being the cause of this heterogeneity during deep drawing. The literature shows that when shear stress is applied in the deformation process, it leads to texture changes. In this study asymmetric rolling (AR) was used as a technique to produce shear. The shear stress is introduced by the different velocities between the upper and bottom rolls and in this study this was achieved by using roll radius relations (r1/r2) of 1,5 and 2. Rolling reductions of 50% in thickness were applied to aluminum AA1050 sheets. The conventional rolling (CR) was compared to the asymmetric rolling (AR), at two different reduction rates: 5% and 10%. The crystallographic textures were obtained by xray diffraction. Finite element analysis, using the DEFORM software, was used to analyze the effective strain distribution throughout the thickness as well as its components: normal strain, shear strain and rigid body rotation. The samples were annealed in a furnace with 350°C for 05, 10, 15, 20 and 60 minutes. The microstructure was characterized by optical microscopy, electron back scatter diffraction and x-ray diffraction. The plastic anisotropy (Lankford Parameter) was measured by tensile experiments at three different sheet directions and by the Erichsen test. The deformed samples’ microstructure was analyzed at the surface near to the upper roll and at half of the thickness. For the CR the main components were brass (Bs) {011} , Goss (Gs) {011} and copper (Cu) {112} , with 8.8 intensity at the central layer, and 4.5 at the surface. For AR samples the was more random at the surface of the samples with 5% of reduction per pass, added to a component of rotation in the normal direction, what resulted in cube and rotated cube textures or near to these orientations, generating a type of fiber {100}//ND. The maximum intensities for the (r1/r2) of 1,5 and 2 were 3 and 4, respectively. For the samples with 10% of reduction per pass the rolled texture was still presented, with a more intense rotation in the transversal direction related to the rolling direction and shear texture components {100}//ND and . The maximum intensities were 3 and 3.5 , for the (r1/r2) of 1,5 and 2, respectively. In the center layer of the samples with 5% of reduction per pass for (r1/r2) of 1,5 and 2 showed a intensity of 5.26 and 6.56, respectively and the strongest shear texture was rotated Goss (C). (011)[0-1- 1] The samples with 10% reduction per pass showed the greatest reduction of intensity with 3.05 and 3.63, for the (r1/r2) of 1,5 and 2 respectively, and the highest intensity was related to rotate the Goss (011)[0-1-1] component. In the pole figures rotations around the transversal direction (TD) and the normal direction (ND) were observed. Using the finite element analysis the rotation around the TD and ND were quantified and its variation across the thickness were analyzed. The rigid body rotation is superposed to shear , which leads to the observed texture gradients. The rotation around TD is imposed by the velocity difference between top and bottom roll, whereas the ND rotation is imposed by the experimental configuration, which permit variation of the sample alignment at the roll mill entrance. This was stronger for the 5% reduction rate and more concentrated at the samples surface. After 05 minutes the annealed samples were already recrystallized , after 60 minutes the grain average size was 30µm, and hardness 21HV. The annealed texture for the CR sample showed the greatest concentration off Cube texture {001} and intensity of 8.08 times the random. For the AR samples with 5% reduction per pass the intensities for the (r1/r2) of 1,5 and 2 was 5.88 and 6.56, respectively, and for the 10% reduction per pass 2.96 and 2.85, respectively. The AR decreases the annealed texture. In the samples of 5% reduction per pass the most intense shear texture was rotated Goss, the 10% reduction per pass did not have a predominant component. The Lankford parameters showed less anisotropy for the annealed samples with 10% reduction per pass. Based on the values of anisotropy and hardening exponent for each sample, the Limiting Rate of Drawing was calculated. The AR got a superior values than the CR ones, indicating an improvement of the drawability. / Chapas de Alumínio são comumente produzidas por laminação seguida de recozimento. Entretanto, ao serem submetidas à estampagem profunda apresentam problemas de orelhamento, devido à anisotropia plástica. Durante o recozimento a textura predominante é a cubo {001} , esta textura é reconhecida como sendo a causadora da má estampabilidade. A literatura indica que é possível alterar a textura final aplicando cisalhamento durante o processamento do material, neste trabalho aplicamos a Laminação Assimétrica (LA) como forma de produzir cisalhamento sobre a chapa. Utilizando o alumínio AA1050 até atingir um total de 50% de redução em espessura, com relações de assimetria (LA) de (r1/r2) de 1,5 e 2 com 5% e 10% de redução por passe e Laminação Convencional (LC) com taxa de 10% de redução por passe. A deformação experimental foi comparada à simulação de elementos finitos utilizando o software DEFORM, e a distribuição de deformação equivalente foi analisada ao longo da espessura da chapa. As amostras passaram por recozimento em forno tipo MUFLA, a 350°C por 05, 10, 15, 20 e 60 minutos. As amostras deformadas foram caracterizadas por microscopia óptica e sua textura cristalográfica foi obtida por difração de raios-x. As amostras recozidas passaram por caracterização microestrutural por microscopia óptica, difração de elétrons retroespalhados (EBSD) e difração de raios-x. A caracterização mecânica foi feita por ensaios de dureza, de tração e pelo ensaio de embutimento Erichsen. A microestrutura das amostras deformadas foi analisada próxima a superfície do rolo superior e no plano central a espessura. Para a LC foram encontradas concentrações maiores de Bs {011} , Gs {011} , Cu {112} , com intensidade máxima de 8,8 para o centro da chapa e de 4,5 na superfície. Para as amostras LA houve uma maior aleatoriedade das texturas tanto na superfície quanto no plano central. As amostras com 5% de redução por passe apresentaram as melhores reduções de intensidades máximas, somada a uma componente de rotação na direção normal (DN) da chapa, as intensidades máximas para (r1/r2) 1,5 e 2 foram de 3 e 4 respectivamente. Nas amostras de 10% de redução por passe ainda estavam presentes as componentes de laminação com uma rotação mais acentuada ao redor da direção transversal (DT) a direção de laminação as intensidades máximas foram de 3 e 3,5 para (r1/r2) 1,5 e 2 respectivamente. No centro da chapa as amostras de 5% de redução por passe para (r1/r2) 1,5 e 2 apresentam intensidades de 5,26 e 6,56 respectivamente e a textura de cisalhamento mais forte foi a Goss rodado (011) [0 1 1 ] (C). Já as amostras de 10% de redução apresentam as maiores reduções de intensidade com 3,05 e 3,63, para (r1/r2) 1,5 e 2 respectivamente, e uma proporção maior de intensidade Goss rodado (C). A simulação numérica foi utilizada para quantificar as rotações de corpo rígido impostas pela deformação, indicadas nas figuras de pólo pelas rotações ao redor da DN e da DT. Quanto às rotações ao redor da DT, para as reduções de 5% o cisalhamento se concentra na superfície e a rotação de corpo rígido é relativamente mais intensa no centro da amostra; nas reduções de 10% uma contribuição mais intensa tanto da rotação quanto do cisalhamento foi obtida. Quanto à rotação ao redor de DN ela foi mais intensa na superfície da chapa e para a redução de 5%. Após 05 minutos de tratamento as amostras já se encontravam recozidas atingindo um tamanho de grão médio de cerca de 30µm, e dureza em torno de 21HV. A textura de recozimento da amostra LC apresentou maiores concentrações das texturas cubo {001} e intensidade de 8,08. Para a LA com 5% de redução por passe as intensidades são máximas para r1/r2 1,5 e 2 foram 5,88 e 6,56, respectivamente, já para as com 10% de redução por passe, 2,96 e 2,85, respectivamente, apresentando a maior redução de concentração de texturas, assim como no material deformado. A LA promoveu, portanto a redução da intensidade de textura de recozimento Nas amostras de 5% de redução por passe a textura de cisalhamento mais intensa foi a Goss rodado, já para as amostras de 10% não houve uma componente predominante. O ensaio de tração nas três direções apresentou uma menor anisotropia para as amostras recozidas com 10% de redução por passe. Baseado nos valores de anisotropia e encruamento para cada amostra foi calculado a taxa de limite de embutimento, na qual as amostras LA obtiveram um valor superior a LC, indicando possuírem um melhor comportamento ao ensaio.

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