Despite the fact that Glycosyl Hydrolase Family 32 present 4 467 enzyme entries, only 14 of them have been characterized structurally. From the ten protein crystal structures deposited for Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 at PDB just one enzyme is related to the processing of non-digestible sugars and there is no structure of a β-fructofuranosidase. In this research we studied the biochemical properties and the structural features of a recombinant β-fructofuranosidase (BaFFse) from the healthy gut bacteria B. adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta. The enzyme was purified by nickel ion affinity chromatography and molecular exclusion chromatography; the purification process was judged by denaturing SDS-PAGE gel. Sucrose was used as a substrate for the enzyme activity assays and the amount of reducing sugars, detected by Dinitrosalycilic acid, was taken as indicator of the optimum conditions of hydrolysis for the enzyme. BaFFase crystal, grown in PEG 8K 25% (w/v) and buffer MES 0.1M pH 6.5, was diffracted at 2.44 Å and processed using the CCP4 program package. The enzyme presented a classical four-stranded five-bladed β-propeller and a C-terminal β-sandwich characteristic from the GH 32 family; however, connected to the β-propeller through a loop of 38 residues, BaFFase also presented an N-terminal β-sandwich domain, which sequence (residues 3-100 from BaFFase) did not match with any protein sequence when aligned against PDB database. Assays with Gel filtration calibration, DLS and SAXS showed that the enzyme was a stable homodimer in solution. Based on the superposition of structures using the a β-fructofuranosidase from B. longum KN29.1 we could deduced the three key aminoacids involved in the transferring of fructosyl moieties by BaFFase. A nucleophile attack is performed by the carboxylate of Asp 131, forming the fructose BaFFase intermediate; Glu 375 donates a proton, acting as an acid base catalyst and Asp 269 stabilizes the transitions state in the fructosyl transferring activity. This is the first GH32 oligomeric enzyme belonging to the bacteria kingdom. We have described a novel additional β-sandwich domain for a GH32 enzyme that increases the region of contact to form a dimer. This is the first β-fructofuranosidase crystal structure from the microorganism B. adolescentis ATCC 15703. / O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma β-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 Å e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas β cada e um domínio C-terminal sanduíche-β característico da família GH32; no entanto, ligado ao β-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-β (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição estrutural, utilizando uma β-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-β adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da β-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

O trabalho realizado como parte do programa de mestrado em física aplicada sub-área biomolecular, teve como objeto de estudo a enzima glicose-6-fosfato isomerase de humanas (PGI-hum). Este trabalho envolveu principalmente três áreas de estudos: biologia molecular, bioquímica e cristalografia. A parte de biologia molecular refere-se a sub-clonagem do gene da PGI-hum a partir de uma biblioteca de cDNA de cérebro de feto humano - capítulo 2 - e a expressão deste gene em bactérias Escherichia coli - capítulo 3. A parte de bioquímica envolve a purificação e caracterização de parâmetros cinéticos da enzima PGI-hum recombinante. Além dos parâmetros cinéticos, foram realizados ensaios de eficiência inibitória para quatro compostos similares ao substrato, cedidos em colaboração com o pesquisador Dr. Laurent Salmon (Lab. De Química Biorgânica e Bioinorgânica de Universidade de Paris-XI). Esta etapa encontra-se descrita nos capítulos 3 e 4. Uma vez definido o protocolo de purificação e confirmada a atividade enzimática para a PGI-hum recombinante, iniciou-se a terceira etapa do projeto: cristalização e determinação da estrutura por difração de raios-X. O primeiro passo, nesta Ultima fase do trabalho, foi determinar as condições de cristalização da PGI-hum - capítulo 5. Depois de obtidos os cristais, foram coletados dois conjuntos de dados de difração de raios-X, sendo o primeiro coletado em uma fonte convencional de raios-X e o segundo com um feixe proveniente de luz sincrotron - capítulo 6. A análise da qualidade e comparação dos conjuntos de dados - capítulo 7 - indicou qual conjunto seria utilizado nas etapas seguintes da determinação da estrutura da PGI-hum. Para resolução da estrutura cristalográfica da PGI-hum foi utilizado o método de substituição molecular com base na estrutura homóloga da PGI de coelho - capítulo 8. O refinamento estrutural da PGI resultou em uma estrutura com 2.1Å de resolução e fatores R e R free satisfatórios - capítulo 9. Uma análise estrutural preliminar é apresentada indicando uma geometria adequada para a proteína e descrevendo as principais características estruturais desta enzima em comparação com a PGI de coelho. / This work is presented as part of the Master degree requirements of the Applied Physics program, Biomolecular Physics area. The purpose of this work is the structural study by of the human glucose-6-phosphate isomerase (PGI-hum). This work has involved mainly three areas: Molecular Biology, Biochemistry and Crystallography. The Molecular Biology work was intended for the cloning of the human open reading frame of PGI-hum from a fetal human brain cDNA library - Chapter 2 - and its expression in Escherichia coli - Chapter 3. The biochemistry work has involved the PGI-hum purification and the determination of its kinetic parameters of the recombinant protein. Inhibitory efficiency measurements where made with four compounds kindly provided by Dr. Laurent Salmon (Laboratoire de Chimie Bioorganique et Bioinorganique - Universite Paris-XI - France). This work is described in Chapters 3 and 4. Once defined the expression and purification protocols and confirmed its enzymatic activity for the recombinant PGI-hum, a third phase was initiated in the project: The crystallization and structure determination by X-ray diffraction. The first step in this last phase of the project was determining the conditions for crystallization of the PGI-hum - Chapter 5. Once obtained the crystals, two data set were collected. One data set was collected \"in house\" X-ray source and a second data set was collected at the Synchrotron beam line (Laboratório Nacional de Luz Sincrotron - LNLS - Campinas) - Chapter 6. The analysis of the quality and the comparison of the two data sets, presented in Chapter 7, indicated that second data set was the best to be used at the following steps. For the resolution of the atomic structure oh the PGL-hum the method of molecular substitution based on the structure of the rabbit homologue enzyme was employed - Chapter 8. The refinement of the PGI-hum structure at 2.1Å resolution and satisfactory R and R free factors is presented in Chapter 9 of this dissertation. A preliminary structural analysis is presented indicating an adequate geometry of the protein and describing the most important structural features of the PGI-hum compared to its homologue, the rabbit PGI.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliográfica sobre a leishmaniose no Brasil e no mundo, com dados atuais de documentos do Ministério da Saúde e da Organização Mundial da Saúde. Discute também, com base em revisões bibliográficas recentes, os mecanismos que o parasita (Leishmania) possui para escapar da resposta imunológica e obter abrigo no interior das células de defesa dos humanos; os tratamentos atualmente empregados para a leishmaniose; a importância de uma abordagem racional para o desenvolvimento de novas drogas e a falta de interesse das industrias farmacêuticas em direcionar a pesquisa & desenvolvimento para doenças tropicais. Ainda na introdução ressalta-se a importância da identificação e validação de potenciais alvos metabólicos antes de se investir na busca por compostos com potencial quimioterápico. Como exemplo discute-se o papel das enzimas do metabolismo energético, entre elas a fosfoglicose isomerase (PGI), na sobrevivência e homeostase do parasita Leismanin. Os experimentos descritos nesta tese visam a determinação da estrutura cristalográfica da PGI de L. mexicana e a comparação cinética e estrutural com a PGI humana. O mapeamento das diferenças estruturais entres as duas enzimas é fundamental para a validação da PGI como potencial alvo metabólico e serve de guia para a idealização de inibidores seletivos da enzima dos parasitas. / This thesis presents a review about the occurrence of leishmaniasis in Brazil and all over the world. The main data sources were documents from Brazilian Health Ministry and the World Health Organization. The introduction presents actual information about strategies adopt by the parasite to evade the human immune response, the common drugs used in actual treatment, the need for new drugs based on a rational approach and the lack of interest from pharmaceutic industry to invest in research & development for tropical diseases. It also highlights the importance to identify, and validate possible metabolic targets before spending time and money in searching potential compounds that blocks a non validated parasite target. The enzymes that participate in the energy metabolism are considered good target. An example is the glicosomal enzyme phosphoglucose isomerase (PGI), which was recently validated by RNA interference experiments in T. brucei as a good target. The experiments described here intend to elucidate the crystallographic structure from L. mexicana PGI and compare its kinetic and structural proprieties to the human PGI. The mapping of the differences between both enzymes is crucial for the validation of PGI as a metabolic target and will assist in the design of inhibitors with high selectivity against the parasite enzyme.

2-Cys Prx compõem um grupo de enzimas antioxidantes homodiméricas que atuam na decomposição de hidroperóxidos utilizando uma cisteína reativa (cisteína peroxidásica - CysP). A alta reatividade da CysP é alcançada com o envolvimento de dois aminoácidos vicinais à CysP: uma treonina e uma arginina, que constituem a tríade catalítica. Após a decomposição do hidroperóxido, a CysP forma um dissulfeto intermolecular com um segundo resíduo de cisteína (cisteína de resolução - CysR), o qual é reduzido pela tiorredoxina (Trx). Durante o ciclo redox, estas enzimas sofrem alterações estruturais, mas os mecanismos envolvidos neste processo eram pouco compreendidos. Neste trabalho foi obtida a estrutura cristalográfica de Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, uma 2-Cys Prx. Através de abordagens envolvendo bioquímica e biologia molecular, foi verificada a importância de aminoácidos envolvidos na reatividade e em transições da estrutura terciária e quaternária. Por fim, foram realizados esforços para a determinação da estrutura cristalográfica de mutantes obtidos neste trabalho. / 2-Cys Prx constitute a group of homodimeric antioxidant enzymes that act in the decomposition of hydroperoxides using a reactive cysteine (peroxidase cysteine - CysP). The high reactivity of the CysP is achieved by the participation of two vicinal amino acids: a threonine and an arginine, which constitute the catalytic triad. After the decomposition of hydroperoxide, the CysP forms an intermolecular disulfide with a second cysteine residue (resolving cysteine - CysR), which is reduced by the thioredoxin (Trx). During the redox cycle, these enzymes undergo to changes in the structure, but the molecular mechanisms involved in this process were poorly understood. In this study we have obtained the crystallographic structure of the 2-Cys Prx enzyme Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae. By means of biochemical and molecular biology approaches, the importance of amino acids involved in reactivity and structural transitions were determined. Finally, efforts have been performed to the determination of the crystallographic structures of mutant proteins obtained in this study.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. Schistosomiasis mansoni also known as water belly or snail´s disease is a chronic parasitic illness that affects approximately 207 million people worldwide with approximately 6 million in Brazil. Schistosomiasis is treated by the use of drugs that are not-in fact effective for the eradication of the disease, and although their efficiency cause serious side effects. In addition, there are reports of S. mansoni´s resistant strains to these drugs, thus justifying the search for new drugs. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the de novo pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathways for its purine requirement. Thus this study aimed to determine the catalytic constants and three-dimensional structure of MTAP (EC 2.4.2.28), an enzyme that is involved in purine salvation pathway, and is thus essential to the reproduction of the parasite. The MTAP was heterologously expressed, purified and crystallized. The protein was submitted to kinetic assays in coupled system, to determine the catalytic constants. The protein was crystallized in 100mM Bis-tris or MES pH 6.1-6.5 and 14-18% PEG 3350. The crystals were submitted to diffraction of rays-X in the LNLS and DLS. Data sets were obtained, processed, refined and analyzed. Structures were obtained in apoenzyme form complexed with fosfate, complexed with adenine and sulfate, complexed with tubercidin and sulfate, and with adenine and glycerol in a space group different of the others. Through the secondary structure, it was possible to analyze the active site and obtained preliminary information of the catalytic mechanism of the target enzyme. This study contributes to the complete elucidation of the purine salvation pathway in S. mansoni, and provides basic information for the research of the new drugs.

A enzima glicossomal gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Tripanosoma cruzi e os mutantes D210L e D210L-G213D foram expressos em E. coli, purificados e submetidos a ensaios de cinética enzimática e de cristalização. A enzima GAPDH tipo selvagem e o mutante D210L-G213D cristalizaram-se no grupo espacial P21 e os cristais apresentaram padrões de difração de raios-X de boa qualidade. A estrutura cristalográfica da enzima tipo selvagem foi determinada a 2.5 e 2.15 A de resolução, a partir de coletas de dados realizadas a 277 e 100 K respectivamente. Os fatores R cristalográficos finais dos refinamentos foram de 16.0% para a estrutura a 277 K e 18.8% para a estrutura a 100 K. A estrutura do mutante GAPDH D210L-G213D foi determinada a 2.15 A de resolução e refinada até um fator R cristalográfico de 18.9%. A comparação entre as estruturas da enzima tipo selvagem determinadas nas duas temperaturas levou a resultados interessantes no que diz respeito ao empacotamento cristalino. O resfriamento dos cristais provocou uma redução no volume da cela unitária de 10.5%, tendo a maior variação ocorrido no parâmetro de rede a (14.5%). A sobreposição das celas unitárias mostrou uma rotação do conteúdo da unidade assimétrica de cerca de 5 graus em torno de um eixo aproximadamente paralelo a b. Por outro lado, a análise das estruturas da enzima tipo selvagem e mutante, juntamente com os parâmetros cinéticos, permitiram a discussão a respeito de alguns detalhes do mecanismo catalítico da enzima, principalmente no que se refere ao papel do resíduo Arg249. Tal resíduo, que apresenta grande mobilidade conformacional de sua cadeia lateral, parece estar envolvido na etapa de reorientação de um dos intermediários durante o processo catalítico. / The glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Typanosoma cruzi and its mutants D210L and D210L-G213D were expressed in E. coli and purified, followed by kinetic and crystallization assays. Both wild type enzyme and D210L-G213D mutant were crystallized in P21 space group and the crystals presented good X-ray diffraction patterns. The three-dimensional structure of the wild type enzyme was determined at 2.5 and 2.15 A resolution from data collected at 277 and 100 K respectively. The structures were refined to a crystallographic R-factor of 16.0% for data collected at 277 K and 18.8% for those collected at 100 K. Also, the structure of the D210L-G213D mutant was solved at 2.15 A resolution and refined to a crystallographic R-factor of 18.9% with good geometry indicators. Comparison between the wild type enzyme structures solved at both temperatures led to interesting results concerning the crystal packing. Flash-cooled crystals presented a 10.5% shrink in the unit cell volume being the major reduction observed in the parameter a (14.5%). Superposition of the unit cells showed a global rotation of the asyrnmetric unit content of about 5 degrees around an axis approximately parallel to b. On the other hand, the analysis of the wild type and mutant enzyme structures, together with the kinetic parameters, allowed a discussion about some catalytic mecanism details, mainly the role of the Arg249 residue. The results showed that this residue might be involved in the reorientation of one of the intermediates during the catalytic process.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-24Bitstream added on 2014-06-13T19:29:24Z : No. of bitstreams: 1 silva_ca_me_bauru.pdf: 3461984 bytes, checksum: 726a1953418403989a2dac8b2bceb4e3 (MD5) / As manganitas óxidas apresentam um complexo diagrama de fases magnéticas e muitos dos seus mecanismos fundamentais de interação magnética ainda precisam ser explorados. A nível cristalográfico, as manganitas óxidas de terras-raras têm suas propriedades magnéticas fortemente afetadas pela variação do íon de terra na estrutura cristalina do composto, pela natureza do elemento de transição presente na composição e pela possibilidade deste metal sofrer flutuações de valência. Além disso, a natural ocorrência de vacâncias de oxigênio também presentes nesses materiais cerâmicos são responsáveis por respostas magnéticas distintas. Este trabalho teve como objetivo a síntese, a caracterização estrutural e a caracterização magnética de dois conjuntos de amostras policristalinas da família Er'Co IND. x''Mn IND. 1-x''O IND> 3+ou - δ' preparados pelo Método dos Precursores Poliméricos. O primeiro conjunto apresenta diferentes valores das composições relativas de manganês e cobalto e um segundo conjunto apresenta variações na estequiometria de oxigênio, além dos compostos base ErMn'O POT. 3' e ErCo'O POT. 3'. Para a caracterização cristalográfica, as amostras foram estudadas por difração de Raios X e analisadas através do método de refinamento Rietveld, e a caracterização magnética foi feita por medidas de magnetização em função da temperatura e em função do campo magnético aplicado. Da análise estrutural, tem-se que as amostras produzidas possuíam frações muito pequenas de fases secundárias, sendo que as fases foram quantificadas através do método Rietveld. As medidas magnéticas mostraram a extensa coexistência de diferentes respostas magnéticas para as amostras com composição relativa Co/Mn. / Manganese based oxides present a very complex magnetic phase diagram and still have many of their basic physical properties and magnetic interaction to be better explored. At crystallographic level, rare-earth oxide manganites have their magnetic properties strongly effected by tchanges in the rare-earth ion present in the structure, the nature of the transition element in the structure and also by the possibility of electronic valence fluctuations. Furthermore, the occurrence of oxygen vacancies are also responsible for a sort of different magnetic responses. In this work it was studied the synthesis procedure, structural and magnetic characterization of polycrystalline samples of the ErMn'O POT. 3' e ErCo'O POT. 3' family prepared by a polymeric precursors method. A first group of samples presents different manganese and cobalt contents ratio and a second group of the analized samples presents variations in the oxygen stoichiometric. The structural and crystalographic characterization were performed by X ray powder diffraction and further analyzed by the Rietveld refinement method, and the magnetic characteristic were studied by measurements of magnetization as a function of temperature at different values of applied magnetic field. From structural analysis, the produced sample have a small piece of secondary phase, that were quantifity using the Rietveld method. The magnetic measures showed a larger coexistence of differents magnetics interactions to sample with relative composition Co/Mn.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. Schistosomiasis mansoni also known as water belly or snail´s disease is a chronic parasitic illness that affects approximately 207 million people worldwide with approximately 6 million in Brazil. Schistosomiasis is treated by the use of drugs that are not-in fact effective for the eradication of the disease, and although their efficiency cause serious side effects. In addition, there are reports of S. mansoni´s resistant strains to these drugs, thus justifying the search for new drugs. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the de novo pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathways for its purine requirement. Thus this study aimed to determine the catalytic constants and three-dimensional structure of MTAP (EC 2.4.2.28), an enzyme that is involved in purine salvation pathway, and is thus essential to the reproduction of the parasite. The MTAP was heterologously expressed, purified and crystallized. The protein was submitted to kinetic assays in coupled system, to determine the catalytic constants. The protein was crystallized in 100mM Bis-tris or MES pH 6.1-6.5 and 14-18% PEG 3350. The crystals were submitted to diffraction of rays-X in the LNLS and DLS. Data sets were obtained, processed, refined and analyzed. Structures were obtained in apoenzyme form complexed with fosfate, complexed with adenine and sulfate, complexed with tubercidin and sulfate, and with adenine and glycerol in a space group different of the others. Through the secondary structure, it was possible to analyze the active site and obtained preliminary information of the catalytic mechanism of the target enzyme. This study contributes to the complete elucidation of the purine salvation pathway in S. mansoni, and provides basic information for the research of the new drugs.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliográfica sobre a leishmaniose no Brasil e no mundo, com dados atuais de documentos do Ministério da Saúde e da Organização Mundial da Saúde. Discute também, com base em revisões bibliográficas recentes, os mecanismos que o parasita (Leishmania) possui para escapar da resposta imunológica e obter abrigo no interior das células de defesa dos humanos; os tratamentos atualmente empregados para a leishmaniose; a importância de uma abordagem racional para o desenvolvimento de novas drogas e a falta de interesse das industrias farmacêuticas em direcionar a pesquisa & desenvolvimento para doenças tropicais. Ainda na introdução ressalta-se a importância da identificação e validação de potenciais alvos metabólicos antes de se investir na busca por compostos com potencial quimioterápico. Como exemplo discute-se o papel das enzimas do metabolismo energético, entre elas a fosfoglicose isomerase (PGI), na sobrevivência e homeostase do parasita Leismanin. Os experimentos descritos nesta tese visam a determinação da estrutura cristalográfica da PGI de L. mexicana e a comparação cinética e estrutural com a PGI humana. O mapeamento das diferenças estruturais entres as duas enzimas é fundamental para a validação da PGI como potencial alvo metabólico e serve de guia para a idealização de inibidores seletivos da enzima dos parasitas. / This thesis presents a review about the occurrence of leishmaniasis in Brazil and all over the world. The main data sources were documents from Brazilian Health Ministry and the World Health Organization. The introduction presents actual information about strategies adopt by the parasite to evade the human immune response, the common drugs used in actual treatment, the need for new drugs based on a rational approach and the lack of interest from pharmaceutic industry to invest in research & development for tropical diseases. It also highlights the importance to identify, and validate possible metabolic targets before spending time and money in searching potential compounds that blocks a non validated parasite target. The enzymes that participate in the energy metabolism are considered good target. An example is the glicosomal enzyme phosphoglucose isomerase (PGI), which was recently validated by RNA interference experiments in T. brucei as a good target. The experiments described here intend to elucidate the crystallographic structure from L. mexicana PGI and compare its kinetic and structural proprieties to the human PGI. The mapping of the differences between both enzymes is crucial for the validation of PGI as a metabolic target and will assist in the design of inhibitors with high selectivity against the parasite enzyme.