Na tentativa de reduzir o número de ocorrência de acidentes de trânsito, o Brasil adotou leis para restringir o consumo de álcool por motoristas e para garantir que as mesmas sejam cumpridas, o contingente policial conta com teste de etilômetro. Ao realizar o teste, se o resultado for positivo para o uso de etanol, o motorista pode ser encaminhado para uma unidade de saúde para que a coleta de sangue seja realizada, para confirmar a presença de etanol ou de outras drogas caso necessário. Porém, pode haver um longo tempo entre a abordagem do motorista e a realização da coleta de sangue, fazendo com que a concentração de etanol no organismo do motorista se altere, além disso, a coleta de sangue é um método invasivo e é necessária a presença de um profissional especializado para que seja realizada. O presente estudo propõe a utilização da saliva como matriz biológica alternativa para dosagem de etanol em motoristas, uma vez que essa matriz permite a dosagem de etanol e de outras drogas, além de permitir que a análise seja repetida, diferentemente do teste do etilômetro, desde que a cadeia de custódia for preservada. Além disso, a coleta dessa amostra não é invasiva, podendo ser realizada no local da abordagem e sob supervisão (coleta vigiada), sem necessitar de profissional especializado. Para verificar se a variação de etanol ao longo do tempo na saliva é semelhante à do ar exalado e da urina, matrizes já utilizadas na dosagem de etanol em motoristas, foi realizado um experimento de ingestão controlada de bebidas alcoólicas por voluntários sadios de maneira controlada, coletando-se amostras de saliva, urina e ar exalado nos tempos de 10, 30, 60 e 90 min após a ingestão. Na segunda etapa do estudo, foi verificado um possível interferente no teste de Etilômetro e na análise de saliva, uma vez que o limite de etanol permitido por lei atual é muito baixo, fazendo-nos questionar se o uso de produtos comuns ao dia a dia e que contém álcool em sua composição, como o enxaguatório bucal, seria capaz de gerar um resultado falso positivo para a ingestão de bebidas alcoólicas. No experimento de interferência, foram testados os seguintes enxaguatórios bucais: Anapyon®, Listerine Cool Mint®, Listerine Cuidado Total®, Cepacol®, Oral B®, Oral B complete®, e ar exalado e saliva foram coletados nos tempos de 5, 10, 15 e 20 minutos. O etanol em amostras de saliva e urina foi determinado por cromatografia em fase gasosa acoplada a detector de ionização por chama (GC-FID) e as amostras de ar exalado foram analisadas no Etilômetro Alcotest 7410 da Dräger. / In an attempt to reduce the number of traffic accidents, Brazil has adopted laws to restrict ethanol consumption among drivers, and to guarantee the effectiveness of this law, police officers make use of breathalyzers. When the breathalyzer test is performed, the results can indicate alcohol intake, in this case the driver can be routed to a health unit to collect blood, and then ethanol dosage can be made as well as other drugs if necessary. Therefore, a long time can occur between drivers approach and the blood collection, and the concentration of ethanol in blood can be altered. In addition this sample collection is invasive and needs an specialized personnel to be done. The present study proposes the use of saliva as an alternative biological matrix to ethanol dosage in drivers, once this matrix permits not only the dosage of alcohol but as well as other drugs, and this analysis can be repeated, if the chain of custody has been preserved. Besides, saliva has a non invasive way of collection and can be done under supervision and does require specialized personnel. To verify if the range of ethanol concentration in saliva is the same found in urine and breath, matrixes already used to monitor drivers in traffic, an experiment of alcohol intake in a controlled manner was performed, and urine, saliva and breath were collected in 10, 30, 60 and 90 minutes after alcohol intake. In a second stage of this study, a possible interfering in the breathalyzer test and in saliva analysis was investigated, since the limit if ethanol permitted for drivers in now very low, making us wonder whether the use of products like mouthwashes, that contain ethanol in its composition is capable of generate an false positive result for alcohol intake. It was tested the following mouthwashes: Anapyon, Listerine Cool Mint, Listerine Cuidado Total, Cepacol, Oral B , Oral B complete. Breath and saliva were collected in 5, 10, 15 and 20 minutes after the mouthwashes use. The ethanol in saliva and urine was determined using Gas Chromatography with Flame Ionization Detector (GC-FID), and the ethanol in breath was analyzed using Alcotest 7410 breathalyzer by Dräger.

O processo de cloração da água pode levar à formação de compostos tóxicos como o 3-cloro-4-(diclorometil)-5-hidroxi-2[5H]-furanona (MX). Embora tenha sido detectado em baixas concentrações (ng/L), ele representa cerca de 50% da atividade mutagênica das águas potáveis, previamente tratadas com cloro. Neste estudo, foi desenvolvido um método quantitativo para a análise de traços de MX em águas cloradas. As técnicas de extração em fase sólida (SPE), microextração em fase sólida (SPME) e a extração líquido-líquido (LLE) foram avaliadas, sendo que esta última se mostrou mais eficiente para a análise de MX em água, com recuperação de 50% para concentrações ≤ 50 ng/L. A determinação do MX foi realizada por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (GC/MS). O método se baseia na derivatização online do MX usando o reagente bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), um procedimento experimental simples e rápido. A precisão elevada e a detecção em concentrações baixas possibilitou a aplicação do método em amostras reais. A confiabilidade dos resultados, se deve ao uso do espectrômetro de massas, que permitiu a identificação e quantificação precisa do MX em águas. Uma pré-concentração de 2000 vezes do extrato foi necessária, visto que o limite de detecção instrumental obtido foi 3 µg/L. O método otimizado foi aplicado em amostras de água provenientes de redes de abastecimento na cidade de São Paulo, coletadas antes e após o processo de cloração. As concentrações de MX nessas águas cloradas variaram de 3 a 22 ng/L, valores comparáveis aqueles encontrados em outros países. / A by-product of chlorination in water is the 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]-furanone (MX), a toxic compound which has been the subject of recent studies. Although MX has been found at low concentrations (ng/L), it accounts for approximately 50% of the total mutagenicity in drinking water. In this study, a method was developed to analyze MX at trace leveI in chlorinated waters. The MX extraction efficiency was evaluated using three different techniques: solid phase extraction (SPE), solid phase microextraction (SPME) and liquid-liquid extraction (LLE). The LLE technique provided higher recovery with value of 50% at concentrations ≤ 50 ng/L. A simple and fast procedure involving on-line based trimethylsilyl derivatization for the quantitative analysis of MX by gas chromatography with mass spectrometry (GCIMS) is proposed. Good precision and low limit of detection of the method allowed its application in real water samples. The reliable MX identification and quantification were obtained due to the use of the mass spectrometry. Since the instrumental limit of detection was equal to 3.0 µg/L, the samples had to be concentrated to 2000 times the original concentration. The optimized method was applied to water samples collected before and after chlorination process in water suppliers located in São Paulo City, Brazil. Concentrations of MX in those samples ranged from 3 to 22 ng/L which are similar to those detected in other countries.

O Canabidiol (CBD), que representa aproximadamente 40% dos canabinóides encontrados na planta Cannabis sativa, é desprovido dos efeitos psicológicos e cognitivos típicos do 9-Tetraidrocanabinol (9THC). Estudos sugerem que o CBD apresenta propriedades ansiolíticas, porém esta substância nunca foi testada na ansiedade clínica. Do mesmo modo, não se sabe como estes possíveis efeitos seriam mediados centralmente em pacientes com transtorno de ansiedade social (TAS). Diante das evidências da existência de um sistema canabinóide em humanos e do crescente interesse terapêutico no uso do CBD, justifica-se um estudo para desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica para a determinação e quantificação de CBD e 9THC empregando a técnica de cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massas. O método desenvolvido e validado se mostrou rápido, simples, de baixo custo com boa sensibilidade e apropriado para aplicação na área da toxicologia clínica. O método demonstrou ser linear no intervalo de concentração de 5 a 500 ng/0,5 mL de plasma para o CBD (r2 = 0,99) e de 5 a 300 ng/0,5 mL (r2 = 0,98) para o 9THC. Os limites de detecção e quantificação foram respectivamente 0,1 ng/0,5 mL e 0,5 ng/0,5 mL para o CBD e, 5 ng/0,5 mL e 10 ng/0,5 mL para o 9THC. Valores de precisão inter e intra ensaio estão respectivamente, na faixa de 5,5% a 12,7%, e de 2,1% a 8,1%. Valores de exatidão inter e intra ensaio estão respectivamente, na faixa de 1,2% a 12,0, e de 1,2 a 14,5 para CBD e 9THC. A eficiência da extração foi obtida na faixa de 54,6 a 93,2% de recuperação para os analitos. A metodologia validada foi empregada em um estudo clínico para correlacionar a dose após a administração controlada de CBD em pacientes com transtorno de ansiedade social. / Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. The Cannabidiol (CBD), that represents about 40% of the cannabinoids found in Cannabis sativa plant, is devoided of the typical psychological and cognitive effects of 9-Tetrahydrocannabinol (9THC). Researches suggest that CBD shows ansiolitic properties, but this substance was never tested on clinical anxiety. It is unknown how possible CBD effects could be centrally mediated in social anxiety disorder (SAD) patients. There are evidences about the existence of a cannabinoid system in humans and there is also increasing interest on therapeutic CBD application. The present study was conducted to develop and validate an analytical methodology for determination and quantification of CBD and 9THC, employing gas phase chromatography/mass spectrometry technique. The validated method was fast, easy, low cost, with a good sensibility and appropriate for clinical toxicology applications. The method was linear on the range of 5 to 500 ng/0,5 mL of plasma for CBD (r2=0,99) and 5 to 300 ng/0,5 mL (r2=0,98) for 9THC. The detection and quantification limits were 0,1 ng/0,5 mL and 0,5 ng/0,5 mL for CBD and 5ng/0,5 mL and 10 ng/0,5 mL for 9THC respectively. Inter and intraday reproducibility were between 5,5% to 12,7% and 2,1% to 8,1%, respectively. Inter and intraday accuracy was between 1,2% to 12% and 1,2% to 14,5% for CBD and 9THC respectively. The recovery of extraction was between 54, 6% to 93,2% of recovery for the analytes The validated methodology was applied in a clinical trial to correlate the doses after the controlled cannabidiol administration to patients with social anxiety disorders.

Foi desenvolvido um método para determinar canabinóides (canabidiol, canabinol e delta-9-tetraidrocanabinol) no cabelo. Uma amostra de 10mg foi descontaminada com diclorometano, seguida de digestão alcalina, microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) e analisada por espectrometria de massa associada à cromatografia em fase gasosa (GC/MS). Os limites de detecção e de quantificação foram de 0,07 e 0,12 ng/mg, respectivamente, para todos canabinóides estudados. O método demonstrou ser simples, rápido, preciso e linear no intervalo de 0,12 a 12 ng/mg (r2 > 0,98). Amostras de cabelo de 8 usuários de Cannabis foram coletadas de pacientes provenientes de uma clínica dependentes pela equipe médica. O método mostrou-se eficiente em amostras de cabelos de usuários que faziam uso da droga pelo menos 10 vezes por semana. / A method was to develop to detect cannabinoids (cannabidiol, cannabinol and delta-9-tetrahydrocannabinol) in hair. A 10 mg of hair sample was descontaminated by dichloromethane followed by alkalin digestion, headspace solid-phase microextraction technique (HS-SPME) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (CG/MS). The detection and quantitation limits were 0,07 and 0,12ng/mg respectively for all studied cannabinoids. The method proved to be simple, fast, precise and linear at the range of 0,12 to 12ng/mg (r2 > 0,98). Eight hair samples of Cannabis user were collected from patients at admittance from a dependence clinic by clinical staff. The method showed efficient in samples of users who use the drug at least 10 fold a week.

O consumo de cocaína e crack no Brasil é um problema de saúde pública, ainda mais grave quando realizado por gestantes, que colocam em risco a sua vida e a do feto. A identificação dessas substâncias através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e utilizando como matriz biológica o mecônio, é uma técnica eficiente para detecção da exposição fetal à cocaína. O mecônio apresenta algumas vantagens em relação às outras matrizes biológicas como uma ampla janela de detecção dos analitos e de fácil coleta por ser não-invasiva. Diante disso, o objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar uma metodologia de preparo do mecônio para identificação de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno e o éster metilanidroecgonina em seus extratos, usando a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Os analitos foram inicialmente extraídos com metanol, sendo posteriormente, purificados usando cartuchos de extração em fase sólida do tipo Bond Elut Certify I. A determinação desses analitos foi realizada usando um CG-EM do tipo íon trap, no modo full scan de detecção. O método foi validado, segundo critérios estabelecidos pela ANVISA, na faixa de linearidade de 20 a 1000 ng/g para a cocaína e o cocaetileno; 40 a 1500 ng/g para a benzoilecgonina e 60 a 1500 ng/g para o éster metilanidroecgonina, usando 0,5 g de mecônio por análise. A resposta do detector apresentou-se linear na faixa estudada e o limite de detecção encontrado foi de 10ng/g para a cocaína; 20ng/g para o cocaetileno; 30ng/g para a benzoilecgonina e 40 ng/g para o éster metilanidroecgonina. O coeficiente de variação intra-ensaio variou de 3,01% a 10,15% e o inter-ensaio variou entre 5,31% a 11,12%; a exatidão variou entre 91,47% e 105,31%. A recuperação encontrada foi superior a 56,30%. A especificidade foi determinada para os seguintes interferentes: AAS (ácido acetilsalicílico), alprazolam, anfetamina, cafeína, dipirona, efedrina, fenilefrina, fluoxetina, metoclopramida, nicotina, sulfato ferroso e THC (tetraidrocanabinol). Após o término da validação, o método foi aplicado em amostras de mecônio coletadas de recém-nascidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP USP). A coleta destas amostras foi realizada após a autorização das mães em participarem da pesquisa, através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, e após preencherem um questionário sobre consumo de drogas. O método desenvolvido e validado mostrou ser eficiente na identificação de cocaína, metabólitos e derivados em mecônio. / Cocaine and crack use is an important public health problem in Brazil, even though when this is made by pregnants, risking the babies lives besides their own. The identification of such substances through gas chromatograph-mass spectrometry using meconium as biological matrix is highly efficient on detecting fetal exposure to cocaine. The meconium presents some advantages in comparison with other matrices such as analite wide window detection and collection facilities by non-invasive methods. The purpose of this study was to develop and validate a method for meconium sample preparation for a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) confirmation of meconium extracts for cocaine, benzoylecgonine, cocaethylene and anhydroecgonine methyl ester. The analytes were initially extracted from the matrix by methanol. Then, a solid-phase extraction with Bond Elut Certify I cartridges was applied. Analytes were determined in a GC-MS ion trap, full scan mode. The method was validated in the range of 20 -1000 ng/g for cocaine and cocaethylene; 40 -1500 ng/g for benzoylecgonine and 60 -1500 ng/g for anhydroecgonine methyl ester, using 0.5 g of meconium per assay. The detector response was linear in the studied range and limit of detection were found to be 10ng/g to cocaine; 20ng/g to cocaethylene; 30ng/g to benzoylecgonine and 40 ng/g to anhydroecgonine methyl ester. Intra-batch coefficients of variation oscillated between 3.01% and 10.15% and inter-batch oscillated between 5.31% and 11.12%; accuracy were in range 91.47% - 105.31%. The recoveries were higher than 56.30%. Selectiviy was determined for these interferents: AAS (acetylsalicylic acid), alprazolam, amphetamine, caffeine, dipyrone, ephedrine, phenylephrine, fluoxetine, metoclopramide, nicotine, iron sulfate and THC (tetrahydrocanabynol). Finally, the method was applied to analysis of meconium collected from newborns in the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP USP). The sample collections were made after mothers´s authorization, and after they signed a term and answered a self-report about use of drugs. The developed and validated method was efficient on identification of cocaine, metabolites and derivatives in meconium.

A cetamina é uma droga amplamente utilizada e o seu uso inadequado tem sido associado à graves consequências para a saúde humana. Embora as propriedades farmacológicas deste agente em doses terapêuticas sejam bem conhecidas, existem poucos estudos sobre os efeitos secundários induzidos por doses não-terapêuticas, incluindo os efeitos nos estados de ansiedade e agressividade. Neste contexto, os modelos animais são uma etapa importante na investigação e elucidação do mecanismo de ação a nível comportamental. O zebrafish (Danio rerio) é um novo organismo-modelo, interessante e promissor, uma vez que apresenta alta similaridade fisiológica, genética e neuroquímica com seres humanos, respostas comportamentais bem definidas e rápida absorção de compostos de interesse em meio aquoso além de apresentar uma série de vantagens em relação aos modelos mamíferos tais como manutenção de baixo custo, prática e executável em espaços reduzidos. Nesse sentido, faz-se necessário a execução de ensaios comportamentais em conjunto com análises estatísticas robustas e rápidas tais como ANOVA e Métodos Multivariados; e também o desenvolvimento de métodos analíticos sensíveis, precisos e rápidos para determinação de compostos de interesse em matrizes biológicas provenientes do animal. Os objetivos do presente trabalho foram a investigação dos efeitos da cetamina sobre a ansiedade e a agressividade em zebrafish adulto empregando Testes de Claro-Escuro e Testes do Espelho e métodos estatísticos univariados (ANOVA) e multivariados (PCA, HCA e SIMCA) assim como o desenvolvimento de método analítico para determinação da cetamina em matriz biológica proveniente do animal, empregando Extração Líquido-Líquido e Cromatografia em Fase Gasosa acoplada ao Detector de Nitrogênio-Fósforo (GC-NPD). Os resultados comportamentais indicaram que a cetamina produziu um efeito significativo dose-dependente em zebrafish adulto na latência à área clara, no número de cruzamentos entre as áreas e no tempo de exploração da área clara. Os resultados das análises SIMCA e PCA mostraram uma maior similaridade entre o grupo controle e os grupos de tratamento expostos às doses mais baixas (5 e 20 mg L-1) e entre os grupos expostos às doses de 40 e 60 mg L-1. Na análise por PCA, dois componentes principais responderam por 88,74% de toda a informação do sistema, sendo que 62,59% da informação cumulativa do sistema foi descrito pela primeira componente principal. As classificações HCA e SIMCA seguiram uma evolução lógica na distribuição das amostras por classes. As doses mais altas de cetamina induziram uma distribuição mais homogênea das amostras enquanto as doses mais baixas e o controle resultaram em distribuições mais dispersas. No Teste do Espelho, a cetamina não induziu efeitos significativos no comportamento dos animais. Estes resultados sugerem que a cetamina é modulador de comportamentos ansiosos, sem efeitos indutores de agressividade. Os resultados da validação do método cromatográfico indicaram uma extração com valores de recuperação entre 33,65% e 70,89%. A curva de calibração foi linear com valor de R2 superior a 0,99. O limite de detecção (LOD) foi de 1 ng e o limite de quantificação (LOQ) foi de 5 ng. A exatidão do método cromatográfico manteve-se entre - 24,83% e - 1,258%, a precisão intra-ensaio entre 2,67 e 14,5% e a precisão inter-ensaio entre 1,93 e 13,9%. / Ketamine is a widely used drug and its inappropriate use has been associated with serious consequences for human health. Although the pharmacological properties of this agent in therapeutic doses are well known, there are few studies about the side effects induced at non-therapeutic doses, including the effects on states of anxiety and aggression. In this context, animal models are an important step in the investigation and elucidation of the mechanism of action at the behavioral level. The zebrafish (Danio rerio) is a new organism model, interesting and promising, since it presents high physiological, genetics and neurochemistry similarity in relation to humans, well-defined behavioral responses and rapid absorption of interesting compounds in an aqueous medium, apart from presents several advantages over mammalian models such as practical, low cost maintenance and executable in reduced spaces. In this sense, it is necessary to perform behavioral tests in conjunction with robust and rapid statistical analysis such as ANOVA and multivariate methods; and also the development of sensitive, accurate and rapid analytical methods to determination of compounds of interest in biological matrices from the animal. The objectives of this study were to investigate the effects of ketamine on anxiety and aggression in adult zebrafish using Light-Dark and Mirror Biting tests and univariate (ANOVA) and multivariate (PCA, HCA and SIMCA) statistical methods and to develop an analytical method for determination of ketamine in biological animal matrices using Liquid-Liquid Extraction and Gas Chromatography coupled with Nitrogen-Phosphorus Detector (GC-NPD). The behavioral results of Light-Dark Test indicated that ketamine produced a significant dose-dependent response in the latency to light area, in the number of midline crossings and in the time spent in light area. Results of SIMCA and PCA analysis showed a greater similarity between the control group and treatment groups exposed to lower doses (5 and 20 mg L-1) and between the treatment groups at doses of 40 and 60 mg L-1. In the analysis PCA, two principal components accounted for 88,74% of all the system information and 62,59% of the cumulative information of the system were described for the first principal component. The HCA and SIMCA results showed a logical evolution in the distribution of samples per class. The higher dose of ketamine induced a more homogeneous distribution of the samples while the lower doses and control resulted in more dispersed distribution. In the Mirror Test, ketamine induced no significant effect on the behavior of animals. These results suggest that ketamine is a modulator of anxious behavior without inducing aggressive effects. The results of the validation of chromatographic method indicated an extraction with recovery ranged between 33,65% to 70,89%. Calibration curve was linear with R2 value higher than 0,99. The limit of detection (LOD) was 1 ng and the limit of quantification (LOQ) was 5 ng. The accuracy of gas chromatographic method ranged between - 24,83% and - 1,258%, intra-assay precision between 2,67 and 14,5% and inter-assay precision between 1,93 and 13,9%.

Foi desenvolvido um método para determinar canabinóides (canabidiol, canabinol e delta-9-tetraidrocanabinol) no cabelo. Uma amostra de 10mg foi descontaminada com diclorometano, seguida de digestão alcalina, microextração em fase sólida por headspace (HS-SPME) e analisada por espectrometria de massa associada à cromatografia em fase gasosa (GC/MS). Os limites de detecção e de quantificação foram de 0,07 e 0,12 ng/mg, respectivamente, para todos canabinóides estudados. O método demonstrou ser simples, rápido, preciso e linear no intervalo de 0,12 a 12 ng/mg (r2 > 0,98). Amostras de cabelo de 8 usuários de Cannabis foram coletadas de pacientes provenientes de uma clínica dependentes pela equipe médica. O método mostrou-se eficiente em amostras de cabelos de usuários que faziam uso da droga pelo menos 10 vezes por semana. / A method was to develop to detect cannabinoids (cannabidiol, cannabinol and delta-9-tetrahydrocannabinol) in hair. A 10 mg of hair sample was descontaminated by dichloromethane followed by alkalin digestion, headspace solid-phase microextraction technique (HS-SPME) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (CG/MS). The detection and quantitation limits were 0,07 and 0,12ng/mg respectively for all studied cannabinoids. The method proved to be simple, fast, precise and linear at the range of 0,12 to 12ng/mg (r2 > 0,98). Eight hair samples of Cannabis user were collected from patients at admittance from a dependence clinic by clinical staff. The method showed efficient in samples of users who use the drug at least 10 fold a week.

A cetamina é uma droga amplamente utilizada e o seu uso inadequado tem sido associado à graves consequências para a saúde humana. Embora as propriedades farmacológicas deste agente em doses terapêuticas sejam bem conhecidas, existem poucos estudos sobre os efeitos secundários induzidos por doses não-terapêuticas, incluindo os efeitos nos estados de ansiedade e agressividade. Neste contexto, os modelos animais são uma etapa importante na investigação e elucidação do mecanismo de ação a nível comportamental. O zebrafish (Danio rerio) é um novo organismo-modelo, interessante e promissor, uma vez que apresenta alta similaridade fisiológica, genética e neuroquímica com seres humanos, respostas comportamentais bem definidas e rápida absorção de compostos de interesse em meio aquoso além de apresentar uma série de vantagens em relação aos modelos mamíferos tais como manutenção de baixo custo, prática e executável em espaços reduzidos. Nesse sentido, faz-se necessário a execução de ensaios comportamentais em conjunto com análises estatísticas robustas e rápidas tais como ANOVA e Métodos Multivariados; e também o desenvolvimento de métodos analíticos sensíveis, precisos e rápidos para determinação de compostos de interesse em matrizes biológicas provenientes do animal. Os objetivos do presente trabalho foram a investigação dos efeitos da cetamina sobre a ansiedade e a agressividade em zebrafish adulto empregando Testes de Claro-Escuro e Testes do Espelho e métodos estatísticos univariados (ANOVA) e multivariados (PCA, HCA e SIMCA) assim como o desenvolvimento de método analítico para determinação da cetamina em matriz biológica proveniente do animal, empregando Extração Líquido-Líquido e Cromatografia em Fase Gasosa acoplada ao Detector de Nitrogênio-Fósforo (GC-NPD). Os resultados comportamentais indicaram que a cetamina produziu um efeito significativo dose-dependente em zebrafish adulto na latência à área clara, no número de cruzamentos entre as áreas e no tempo de exploração da área clara. Os resultados das análises SIMCA e PCA mostraram uma maior similaridade entre o grupo controle e os grupos de tratamento expostos às doses mais baixas (5 e 20 mg L-1) e entre os grupos expostos às doses de 40 e 60 mg L-1. Na análise por PCA, dois componentes principais responderam por 88,74% de toda a informação do sistema, sendo que 62,59% da informação cumulativa do sistema foi descrito pela primeira componente principal. As classificações HCA e SIMCA seguiram uma evolução lógica na distribuição das amostras por classes. As doses mais altas de cetamina induziram uma distribuição mais homogênea das amostras enquanto as doses mais baixas e o controle resultaram em distribuições mais dispersas. No Teste do Espelho, a cetamina não induziu efeitos significativos no comportamento dos animais. Estes resultados sugerem que a cetamina é modulador de comportamentos ansiosos, sem efeitos indutores de agressividade. Os resultados da validação do método cromatográfico indicaram uma extração com valores de recuperação entre 33,65% e 70,89%. A curva de calibração foi linear com valor de R2 superior a 0,99. O limite de detecção (LOD) foi de 1 ng e o limite de quantificação (LOQ) foi de 5 ng. A exatidão do método cromatográfico manteve-se entre - 24,83% e - 1,258%, a precisão intra-ensaio entre 2,67 e 14,5% e a precisão inter-ensaio entre 1,93 e 13,9%. / Ketamine is a widely used drug and its inappropriate use has been associated with serious consequences for human health. Although the pharmacological properties of this agent in therapeutic doses are well known, there are few studies about the side effects induced at non-therapeutic doses, including the effects on states of anxiety and aggression. In this context, animal models are an important step in the investigation and elucidation of the mechanism of action at the behavioral level. The zebrafish (Danio rerio) is a new organism model, interesting and promising, since it presents high physiological, genetics and neurochemistry similarity in relation to humans, well-defined behavioral responses and rapid absorption of interesting compounds in an aqueous medium, apart from presents several advantages over mammalian models such as practical, low cost maintenance and executable in reduced spaces. In this sense, it is necessary to perform behavioral tests in conjunction with robust and rapid statistical analysis such as ANOVA and multivariate methods; and also the development of sensitive, accurate and rapid analytical methods to determination of compounds of interest in biological matrices from the animal. The objectives of this study were to investigate the effects of ketamine on anxiety and aggression in adult zebrafish using Light-Dark and Mirror Biting tests and univariate (ANOVA) and multivariate (PCA, HCA and SIMCA) statistical methods and to develop an analytical method for determination of ketamine in biological animal matrices using Liquid-Liquid Extraction and Gas Chromatography coupled with Nitrogen-Phosphorus Detector (GC-NPD). The behavioral results of Light-Dark Test indicated that ketamine produced a significant dose-dependent response in the latency to light area, in the number of midline crossings and in the time spent in light area. Results of SIMCA and PCA analysis showed a greater similarity between the control group and treatment groups exposed to lower doses (5 and 20 mg L-1) and between the treatment groups at doses of 40 and 60 mg L-1. In the analysis PCA, two principal components accounted for 88,74% of all the system information and 62,59% of the cumulative information of the system were described for the first principal component. The HCA and SIMCA results showed a logical evolution in the distribution of samples per class. The higher dose of ketamine induced a more homogeneous distribution of the samples while the lower doses and control resulted in more dispersed distribution. In the Mirror Test, ketamine induced no significant effect on the behavior of animals. These results suggest that ketamine is a modulator of anxious behavior without inducing aggressive effects. The results of the validation of chromatographic method indicated an extraction with recovery ranged between 33,65% to 70,89%. Calibration curve was linear with R2 value higher than 0,99. The limit of detection (LOD) was 1 ng and the limit of quantification (LOQ) was 5 ng. The accuracy of gas chromatographic method ranged between - 24,83% and - 1,258%, intra-assay precision between 2,67 and 14,5% and inter-assay precision between 1,93 and 13,9%.

O consumo de cocaína e crack no Brasil é um problema de saúde pública, ainda mais grave quando realizado por gestantes, que colocam em risco a sua vida e a do feto. A identificação dessas substâncias através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e utilizando como matriz biológica o mecônio, é uma técnica eficiente para detecção da exposição fetal à cocaína. O mecônio apresenta algumas vantagens em relação às outras matrizes biológicas como uma ampla janela de detecção dos analitos e de fácil coleta por ser não-invasiva. Diante disso, o objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar uma metodologia de preparo do mecônio para identificação de cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno e o éster metilanidroecgonina em seus extratos, usando a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Os analitos foram inicialmente extraídos com metanol, sendo posteriormente, purificados usando cartuchos de extração em fase sólida do tipo Bond Elut Certify I. A determinação desses analitos foi realizada usando um CG-EM do tipo íon trap, no modo full scan de detecção. O método foi validado, segundo critérios estabelecidos pela ANVISA, na faixa de linearidade de 20 a 1000 ng/g para a cocaína e o cocaetileno; 40 a 1500 ng/g para a benzoilecgonina e 60 a 1500 ng/g para o éster metilanidroecgonina, usando 0,5 g de mecônio por análise. A resposta do detector apresentou-se linear na faixa estudada e o limite de detecção encontrado foi de 10ng/g para a cocaína; 20ng/g para o cocaetileno; 30ng/g para a benzoilecgonina e 40 ng/g para o éster metilanidroecgonina. O coeficiente de variação intra-ensaio variou de 3,01% a 10,15% e o inter-ensaio variou entre 5,31% a 11,12%; a exatidão variou entre 91,47% e 105,31%. A recuperação encontrada foi superior a 56,30%. A especificidade foi determinada para os seguintes interferentes: AAS (ácido acetilsalicílico), alprazolam, anfetamina, cafeína, dipirona, efedrina, fenilefrina, fluoxetina, metoclopramida, nicotina, sulfato ferroso e THC (tetraidrocanabinol). Após o término da validação, o método foi aplicado em amostras de mecônio coletadas de recém-nascidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP USP). A coleta destas amostras foi realizada após a autorização das mães em participarem da pesquisa, através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, e após preencherem um questionário sobre consumo de drogas. O método desenvolvido e validado mostrou ser eficiente na identificação de cocaína, metabólitos e derivados em mecônio. / Cocaine and crack use is an important public health problem in Brazil, even though when this is made by pregnants, risking the babies lives besides their own. The identification of such substances through gas chromatograph-mass spectrometry using meconium as biological matrix is highly efficient on detecting fetal exposure to cocaine. The meconium presents some advantages in comparison with other matrices such as analite wide window detection and collection facilities by non-invasive methods. The purpose of this study was to develop and validate a method for meconium sample preparation for a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) confirmation of meconium extracts for cocaine, benzoylecgonine, cocaethylene and anhydroecgonine methyl ester. The analytes were initially extracted from the matrix by methanol. Then, a solid-phase extraction with Bond Elut Certify I cartridges was applied. Analytes were determined in a GC-MS ion trap, full scan mode. The method was validated in the range of 20 -1000 ng/g for cocaine and cocaethylene; 40 -1500 ng/g for benzoylecgonine and 60 -1500 ng/g for anhydroecgonine methyl ester, using 0.5 g of meconium per assay. The detector response was linear in the studied range and limit of detection were found to be 10ng/g to cocaine; 20ng/g to cocaethylene; 30ng/g to benzoylecgonine and 40 ng/g to anhydroecgonine methyl ester. Intra-batch coefficients of variation oscillated between 3.01% and 10.15% and inter-batch oscillated between 5.31% and 11.12%; accuracy were in range 91.47% - 105.31%. The recoveries were higher than 56.30%. Selectiviy was determined for these interferents: AAS (acetylsalicylic acid), alprazolam, amphetamine, caffeine, dipyrone, ephedrine, phenylephrine, fluoxetine, metoclopramide, nicotine, iron sulfate and THC (tetrahydrocanabynol). Finally, the method was applied to analysis of meconium collected from newborns in the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP USP). The sample collections were made after mothers´s authorization, and after they signed a term and answered a self-report about use of drugs. The developed and validated method was efficient on identification of cocaine, metabolites and derivatives in meconium.

A grande prevalência do consumo de álcool por mulheres em idade reprodutiva aliada à gravidez não planejada expõe a gestante a um elevado risco de se alcoolizar em algum momento da gestação, principalmente no início do período gestacional em que a maioria delas ainda não tomou ciência do fato. Assim, torna-se extremamente relevante o desenvolvimento de métodos de detecção precoce de recém-nascidos em risco de desenvolvimento de problemas do espectro dos transtornos relacionados à exposição fetal ao álcool. O objetivo desse estudo foi desenvolver, validar e avaliar a eficácia de um método de quantificação de ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEEs) no mecônio de recém-nascidos para avaliação da exposição fetal ao álcool. Os FAEEs avaliados foram: palmitato de etila, estearato de etila, oleato de etila e linoleato de etila.O método consistiu no preparo das amostras pela extração líquido-líquido utilizando água, acetona e hexano, seguida de extração em fase sólida empregando cartuchos de aminopropilsilica. A separação e quantificação dos analitos foi realizada por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas. Os limites de quantificação (LQ) variaram entre 50-100ng/g. A curva de calibração foi linear de LQ até 2000ng/g para todos os analitos. A recuperação variou de 69,79% a 106,57%. Os analitos demonstraram estabilidade no ensaio de pós-processamento e em solução. O método foi aplicado em amostras de mecônio de 160 recém-nascidos recrutados em uma maternidade pública de Ribeirão Preto-SP. O consumo de álcool materno foi reportado utilizando questionários de rastreamento validados T-ACE e AUDIT e relatos retrospectivos da quantidade e frequência de álcool consumida ao longo da gestação. A eficácia do método analítico em identificar os casos positivos foi determinada pela curva Receiver Operating Characteristic (ROC). O consumo alcoólico de risco foi identificado pelo T-ACE em 31,3% das participantes e 50% reportaram o uso de álcool durante a gestação. 51,3% dos recém-nascidos apresentaram FAEEs em seu mecônio, sendo que 33,1% apresentaram altas concentrações para a somatória dos FAEEs (maior que 500ng/g), compatível com um consumo abusivo de álcool. O oleato de etila foi o biomarcador mais prevalente e o linoleato de etila foi o biomarcador que apresentou as maiores concentrações. Houve uma variabilidade no perfil de distribuição dos FAEEs entre os indivíduos, e discordâncias entre a presença de FAEEs e o consumo reportado pela mãe. A concentração total dos FAEEs nos mecônio mostrou-se como melhor indicador da exposição fetal ao álcool quando comparado com o uso de um único biomarcador. O ponto de corte para esta população foi de aproximadamente 600ng/g para uso tipo binge (três ou mais doses por ocasião) com sensibilidade de 71,43% e especificidade de 84,37%. Este estudo reforça a importância da utilização de métodos laboratoriais na identificação da exposição fetal ao álcool. / The high prevalence of alcohol consumption by women of reproductive age combined with unplanned pregnancy exposes the mother to a high risk to intoxicate at some time during pregnancy, especially in the early gestational period in which most of them have not yet became aware of the fact. Therefore, the development of methods for early detection it is extremely relevant for the prevention of fetal alcohol exposure as well for the early assessment of neonates at risk for development of problems of the fetal alcohol spectrum. The aim of this study was to develop, validate and evaluate the effectiveness of a method for quantifying fatty acid ethyl esters (FAEEs) in meconium from newborns for evaluation of fetal alcohol exposure. The evaluated FAEEs were: ethyl palmitate, ethyl stearate, ethyl oleate and linoleate etila. The method consists in preparing the samples by liquid-liquid extraction using water, acetone and hexane, followed by solid phase extraction employing aminopropyl silica cartridges. The separation and quantitation of analytes was performed by gas chromatography coupled with mass spectrometer. Limits of quantification (LOQ) ranged between 50 and 100 ng/g. The curves calibration were linear from LQ- 2000ng / g for all analytes. The recovery ranged from 69.79% to 106.57%. The analytes demonstrated stability in post-processing assay and in stability assay for standard solutions. The method was applied in meconium samples from 160 newborns recruited in a public maternity hospital of Ribeirão Preto. The maternal alcohol consumption was assessed by validated screening questionnaires (T-ACE and AUDIT) and by retrospective self-reports about the amount and frequency of alcohol consumption during pregnancy. The effectiveness of the analytical method in identifying positive cases was determined by receiver operating characteristic curve (ROC). The risk drinking was identified by the T-ACE in 31.3% of participants and 50% of them reported alcohol use during pregnancy. 51.3% of newborns tested positive for FAEEs, and 33.1% had high concentrations for sum of FAEEs (greater than 500 ng/g), compatible with alcohol abuse. The ethyl oleate was the most prevalent biomarker and ethyl linoleate was the biomarker that showed the highest concentrations. There was a variability in the distribution profile of FAEEs between individuals, and there were disagreements between the results of FAEEs and consumption reported by the mother. The cumulative sum of FAEEs was better than individual FAEEs for interpretation of positive cases. A positive cutoff of cumulative FAEE at 600 ng/g for binge drinking was stablished with 71,43% sensitivity and 84,37% specificity. This study reinforces the importance of using laboratory methods for identifying fetal alcohol exposure.