A transferência de oxigênio para o meio, durante o cultivo de Candida kefyr DSM 70106, mostrou ter grandE influência na produção de inulinase extracelular. O KLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio) de 43 h-1 foi o que proporcionou a obtenção de atividade enzimática mais elevada (37,5 U.mL-1). Este parâmetro foi utilizado como critério para ampliação de escala do cultivo em biorreator de 15 litros para 300 litros. O volume de meio obtido foi congelado para utilização nos processos seguintes de separação de células e purificação da inulinase. Para isto foram utilizados três processos diferentes, a saber, filtração (microfiltração, diafiltração e ultrafiltração), extração líquido-líquido por micela reversa e cromatografia de troca iônica em leito fluidizado. Durante a separação de células, a membrana de microfiltração tipo HVLP com 0,45 µm de diâmetro de poro foi a que possibilitou a passagem de maior fluxo de filtrado (324 L.h-1.m-2) quando comparada com outras membranas de poros e materiais diferentes. Associado a este fluxo obteve-se ainda a passagem pela membrana de 99% da enzima presente. Foram também estudados diferentes tipos de módulos de filtração. Os filtros rotativos foram os que apresentaram melhores desempenhos, com destaque para o tipo \"Biodruckfilter\". Fluxo de filtrado de 300 L.h-1.m-2 e transmissão de 99% da enzima foram obtidos neste filtro. Os filtros tipo cassete e os tubulares apresentaram desempenhos, em geral, inferior a 50% quando comparados em termos de fluxo de filtrado. O processo de filtração em escala ampliada, realizada no filtro cassete, apresentou fluxo de filtrado 45% inferior ao obtido na pequena escala. Os estudos de extração líquido-líquido por micela reversa foram feitos utilizando um agente tensoativo catiônico (BDBAC- [N-Benzyl-N-Dodecyl-N bis(2-hydroxyethyl) ammonium chloride] e um aniônico (AOT- sodium-di-2ethyl-hexyl-sulphosuccinate). O BDBAC proporcionou recuperação de 91 % da enzima presente inicialmente. Na ampliação de escala do processo foi verificado um rendimento de 77%, e o aumento da atividade enzimática específica, nos dois casos, foi de aproximadamente 2,8 vezes. Em comparação com os dois processos anteriores, o processo de purificação da inulinase com separação simultânea de células por cromatografia de trocaiônica em leito fluidizado foi o que proporcionou maior aumento da atividade enzimática específica (da ordem de 4,3 vezes). Após adsorção e eluição do leito cromatográfico, 93,1% da enzima foi recuperada. / It has been observed that the production of extracellular inulinase by Candida kefyr DSM 70106 was markedly affected by the rate of oxygen transfer to the medium. The highest inulinase activity (37,5 U.Ml-1) was attained at a KLa value (volumetric coefficient of oxygen transfer) equal to 43 h-1. As such, KLa was chosen as a criterion for scaling-up the bioreactor capacity from 15 L to 300 L. Once the fermentation ended, the whole fermented broth was frozen for further cell separation and inulinase purification. For that, three different processes were used, namely filtration (microfiltration, diafiltration and ultrafiltration), liquid-liquid extraction by reversed micelles and ion-exchange chromatography in fluidized bed. Microfiltration membranes differing in the chemical nature and on the pores diameter were used in cell separations. The highest filtrate flow (FF = 324 L.h-1.m-2) occurred when HVLP type membrane (0,45 µm pore diameter) was employed. Moreover, 99% of inulinase passed through the membrane. Several types of filtration modules were also studied. The rotatory filter, such as the \"Biodruckfilter\" (FF=300 L.h-1.m-2 and 99% of inulinase transmission), presented remarkable performance when compared with cassette and tubulartype filters, in which FF was lower than 50%. Furthermore, filtration carried out with a scaled-up cassette module presented a FF 45% lower than that observed on a smaller scale. Studies on liquid-liquid extraction by reverse micelles were made utilizing a cationic surfactant (BDBAC- [N-Benzyl-N-Dodecyl-N-bis(2-hydroxyethyl) ammonium chloride] and an anionic surfactant (AOT-sodium-di-2-ethyl-hexylsulphosuccinate). The use of BDBAC resulted in a recuperation of 91 % of the enzyme initially present, which decreased about 77% when the process was scaled-up. Neverthless, in both cases the increase in specific enzymatic activity was about 2.8 times. In comparison with the aforementioned processes, the ion-exchange chromatography in fluidized bed, in which inulinase purification and cell separation take place simultaneously, provided. an increase in specific enzymatic activity of about 4.3 times. After adsorption and elution of the chromatographic bed about 93% of the inulinase was recovered.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Tese financiada por FCT/POCTI, União Europeia-FEDER / Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Escola Superior de Tecnologia e Gestão. Instituto Politécnico de Bragança. 2010

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

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La tesi titulada Determinació de Substàncies amb Diferents Hidrofobicitats mitjançant Cromatografia Líquida Micel·lar, mostra com esta tècnica de separació pot ser aplicada per a la determinació de diversos grups de fàrmacs, que diferixen molt en el seu valor del coeficient de repartiment octanol aigua.Està estructurada de la següent forma:- El Capítol I correspon a la Introducció de la Tesi. En ell es descriuen les característiques generals de la cromatografia líquida micellar i de com aquesta tècnica pot ser útil per a separar i determinar aquells grups de substàncies que degut a la seua estructura química, difereixen en la seua hidrofobicitat. La primera part del Capítol I, ens introdueix en el coneixement dels mecanismes que actuen per aconseguir la separació de les substàncies quan s'utilitza la CLM, i en la segona part s'estudia la forma de mesurar la hidrofobicitat de les substàncies, mitjançant el càlcul del log Po/w.- En el Capítol II es detalla l'objecte i el pla de treball utilitzat per a elaborar la Tesis.- Els capítols III a VII es dediquen a la determinació de substàncies en formulacions farmacèutiques o en mostres d'aigua.- El Capítol III tracta la determinació de vitamines del grup B mitjançant derivatització, fent ús de la reacció de König. Este capítol es divideix en dos apartats: en el primer, s'optimitza un procediment d'anàlisi per injecció en flux (FI), per a la derivatització de l'àcid nicotínic en un sistema, i en la segona part, es mostra l'acoblament d'este sistema FI al cromatògraf.- El Capítol IV també tracta la determinació de vitamines del grup B, però ara la detecció es du a terme en la UV. S'ha optimitzat un mètode cromatogràfic que permet la determinació de les vitamines hidrosolubles del grup B en preparats farmacèutics multivitamínics.- El Capítol V oferix un procediment de CLM per a la determinació de carbamats en mostres d'aigua.- Si fins ara, en els anteriors Capítols, les substàncies que s'han utilitzat són relativament hidrofíliques, en el Capítol VI s'analitzen corticosteroids, caracteritzats tots ells per la seua elevada hidrofobicitat. A més, la determinació es fa en cremes, és a dir, una matriu altament hidrofòbica.- Al Capítol VII es dissenya un protocol per aconseguir la separació i determinació d'un gran nombre de substàncies, pertanyents als grups de les fenetilamines i dels antihistamínics, que habitualment es formulen conjuntament en medicaments per al constipat.- Els Capítols VIII a l'XI tracten l'anàlisi de compostos en matrius biològiques. En els tres primers, els estudis s'han fet en mostres de sèrum, i a l'últim en orina.- En el Capítol VIII es realitza la determinació de tres antiepil·lèptics en mostres de sèrum realitzant una injecció directa en CLM.- El Capítol IX està dedicat a la determinació de diversos barbitúrics en sèrum.- En el Capítol X es determinen diverses benzodiazepines en sèrum fent l'optimització en columnes C18 i C8.- I finalment, el Capítol XI es basa en realitzar la determinació de diversos estimulants mitjançant la cromatografia líquida micel·lar en mostres d'orina.- El capítol XII recull les conclusions que se'n deriven dels estudis fets en els capítols anteriors.- La tesi acaba amb un annex dedicat a les publicacions, l'estructura del qual es fa coincidir amb la dels capítols anteriors.

Les mesures analítiques i els instruments que les generen poden classificar-se en funció del numero de dades que s'obtenen al mesurar una mostra. Si s'obté una matriu de respostes, s'anomenen dades d'ordre dos.En aquesta tesi es van utilitzar els dades d'ordre dos, obtingudes mitjançant un cromatògraf líquid d'alta resolució amb un detector de diodes en fila (DAD).L'instrument HPLC-DAD és força comú. Tot i això, normalment, per determinar la concentració dels analits d'interès no s'utilitzen totes les dades enregistrades per l'instrument. El mode espectral només s'utilitza per identificar els analits o per verificar la puresa dels pics, mentre que l'àrea o l'alçada del pic s'utilitza per quantificar mitjançant calibratge univariant. Aquesta manera de treballar és molt útil sempre i quan la resposta mesurada sigui selectiva per l'analit d'interès.En analitzar contaminants ambientals en mostres complexes, com poden ser mostres d'aigua de riu, no és senzill obtenir mesures selectives. Quan les respostes no son selectives, els mètodes de calibratge de segon ordre (els que utilitzen dades de segon ordre) es poden utlitzar per a quantificar l'analit d'interès.La present tesi es basa en l'estudi de les propietats del mètode de calibratge de segon ordre Generalized Rank Annihilation Method (GRAM). Aquest mètode fou desenvolupat a mitjans de la dècada dels 80, i té unes propietats molt atractives:1) Per a determinar la concentració de l'analit d'interès en una mostra test només cal una mostra de calibratge o estàndard.2) No calen mesures selectives, amb la qual cosa el temps de la separació es pot reduir de manera considerable.Tot i això, el GRAM té una sèrie de limitacions que fan que no s'apliqui de manera rutinària. L'objectiu de la tesi és estudiar els avantatges i les limitacions del GRAM i millorar els aspectes necessaris per a què és pugui aplicar de manera rutinària.Per emprar GRAM les dades experimentals han de complir una sèrie de requisits matemàtics: (i) la resposta mesurada ha de ser suma de respostes corresponents als diferents analits i (ii) la resposta d'un analit ha de ser proporcional en les diferents mostres: l'analit ha d'eluir exactament al mateix temps de retenció tant en l'estàndard com en la mostra test. Si aquest requisit no es compleix, les prediccions del GRAM son esbiaixades.S'han desenvolupat fórmules de superar aquestes dificultats. S'ha desenvolupat un mètode per alienar pics cromatogràfics, basat en un mètode de resolució de corbes (Iterative Target Transformation Factor Analysis, ITTFA). En sistemes HPLC-DAD, és força habitual que els pics de l'analit d'interès elueixin a diferents temps de retenció.Les diferencies no son gaire grans (pocs segons) però poden ser suficients per fer que els resultats del GRAM siguin incorrectes.El GRAM és un mètode basat en factors, i cal introduir aquest paràmetre per a calcular un model. S'ha desenvolupat un mètode gràfic per a triar el nombre de factors que s'utilitzen per calcular el model GRAM. Està basat en un paràmetre de l'algorisme GRAM (á).Finalment s'ha desenvolupat un criteri per a determinar mostres discrepants (outliers).El criteri desenvolupat per detectar outliers està basat en el Senyal Analític Net (NAS).Tot l'esmentat anteriorment, s'ha aplicat a casos reals, en concret a l'anàlisi de naftalensulfonats i de contaminats polars presents en mostres d'aigua, tant de riu com de depuradora. Així s'ha pogut demostrar la utilitat del GRAM a la cromatografia, i comparar el GRAM amb altres mètodes de calibratge de segon ordre com el PARAFAC i MCR-ALS. Es va trobar que tots tres mètodes produïen resultats comparables. / Analytical measurements and the instruments that generate them can be classified regarding the number of data that are obtained when a sample is measured. When a matrix of response is obtained, it is known as second-order data.In this thesis, second-order data were used, obtained from a high performance liquid chromatography (HPLC) couple with a diode array detector (DAD). This instrument is quite common in the analytical laboratories. However, the concentration of the analytes of interest is normally found without using all the measured data. The spectral model only is used to identify the analytes of for verifying the peak purity, whereas the area or the height of the peak is used to quantify using univariate calibration. This is a very useful strategy. However, the measured response must be selective to the analyte of interest.When environmental pollutants were analyzed, like water samples, it is no so easy to get selective measurements. When the responses are not selective, the analyte on interest can still be quantified by using second-order calibration methods, which are the methods that use second-order data.This thesis is based on the study of the properties of the second-order calibration method Generalized Rank Annihilation Method (GRAM).This method was developed in the mid eighties and has very attractive properties:1) To determine the concentration of the analyte of interest in a test sample, it is only necessary one calibration sample or standard.2) Selective measurements are not necessary, implying the reduce of the separation time.Despite these advantages, GRAM has some limitations which make that it is not applied routinely. The objectives of the thesis are to study the advantages and limitations of GRAM and improve the negative points in order to apply GRAM routinely.To use GRAM the experimental data must accomplish some mathematical requirements: (i) the measured response must be result of the addition due to the different analytes in the peak and (ii) the response of the analyte must be proportional in the different samples: the analyte of interest must elute at the same retention time both in the calibration and in the test sample. When these conditions are not met, the GRAM predictions are biased.Mathematical algorithms have been developed to overcome such difficulties. An algorithm to align chromatographic peaks has been developed, based on curve resolution method (Iterative Target Transformation Factor Analysis, ITTFA). In HPLCDAD systems is quite often that the peaks of the analyte of interest elute at different retention time in the calibration and in the test sample. Even the differences are not big (few seconds), they can be enough to make the GRAM results incorrect.GRAM is a factor based calibration method, and the number of factors has to be introduced as an input to build a GRAM method. A graphical criterion has been selected to determine the number the number of factors, which is base on the use of a parameter of the GRAM algorithm (á).Finally, a criterion to detect outlying samples has been developed, which is based on the Net Analyte Signal (NAS).All the above commented were applied to real cases. Specifically to the analysis of aromatic sulfonates and polar pollutants in water form river samples and waste water plants. We were able to show the applicability of GRAM and to compare GRAM with other second-order calibration methods, such as PARAFAC i MCR-ALS. We found that the three methods provided comparable results.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000385855-Texto+Completo-0.pdf: 1436770 bytes, checksum: 28e687e815170b42a1f16566092ecf39 (MD5) Previous issue date: 2006 / Therapeutic drug monitoring, understood as the determination of plasma drug concentrations and the application of these determinations to the individualization of pharmacotherapy, is an useful approach in amitriptyline treatment, once therapeutic and toxic concentrations for this drug have been proposed. However, the achievement of therapeutic plasma levels is strongly influenced by the metabolism phenotypic variability. Frequently, the genotype of drug metabolism does not allow to predict the phenotype. One of the most common factor of inconsistence between genotype and phenotype is drug interactions. Considering that a significative amount of patients do not report the current use of drug and herbal medicines to their physicians, systematic toxicological analysis procedures can be useful to evaluate the co-administration of drugs. In this study, a computer system for chromatographic parameter calculation and database retrieval, based on previously published databases, was developed. The system is available in the world wide web, allowing the identification of substances of toxicological interest with high probabilities, even when performing simple and low cost analytical methods. A HPLC-DAD methodology for the simultaneous determination of omeprazole, 5-hydroxy-omeprazole and omeprazole sulphone in plasma samples was developed and validated, allowing the evaluation of the phenotype for CYP2C19 and CYP3A4 in a group of 38 healthy volunteers. Three poor metabolizers and one ultra-fast metabolizer were identified. Additionally, a HPLC-DAD method for the simultaneous determination of amitriptyline, nortriptyline, desmethylnortriptyline, E-10-hydroxy-amitriptyline, Z-10-hydroxy-amitriptyline, E-10-hydroxy-nortriptyline and Z-10-hydroxy-nortriptyline was developed and validated. Five volunteers with different phenotypes for CYP2C19 (1 ultra-fast, 3 extensive and 1 poor) received a single oral dose of 1mg. kg-1 amitriptyline, supplying blood samples at times 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 24 and 48 hours after dosing. Differences in pharmacokinetic parameters and in metabolic ratios were observed between the different phenotypes. The calculation of demethylation metabolic ratio based on amitriptyline and nortriptyline plasma concentrations in a sample collected 3 hours after a single, or a first, oral dose of amitriptiline can be used to determine the metabolic phenotype for CYP2C19, allowing an early posology adjustment. / O monitoramento terapêutico, compreendido como a determinação de concentrações plasmáticas de fármacos e a aplicação destas determinações à individualização da farmacoterapia, é uma abordagem útil quando da utilização de amitriptilina, considerando que faixas de concentração terapêutica e tóxicas estão propostas. Entretanto, a obtenção de níveis plasmáticos terapêuticos é fortemente impactada pela variabilidade fenotípica do metabolismo. Freqüentemente, o genótipo metabolizador não permite prever o fenótipo. Um dos fatores mais comuns de inconsistência entre genótipo e fenótipo é a interação entre fármacos. Considerando que uma parcela significativa dos pacientes não relatam o uso corrente de medicamentos e fitoterápicos aos médicos assistentes, procedimentos de análise toxicológica sistemática podem ser úteis para avaliar a co-administração de fármacos. Neste estudo, foi desenvolvido um sistema informatizado para cálculo de parâmetros cromatográficos e busca em bases de dados previamente publicadas, disponível na rede mundial de computadores. Este sistema permite a identificação de substâncias de interesse toxicológico com elevada probabilidade, mesmo com a utilização de métodos analíticos simples e de baixo custo. Também foi desenvolvida e validada uma metodologia para determinação simultânea de omeprazol, 5-hidróxi-omeprazol e omeprazol sulfona em plasma por HPLC-DAD, permitindo a avaliação do fenótipo metabolizador para CYP2C19 e CYP3A4 em um grupo de 38 voluntários saudáveis. Foram identificados três indivíduos considerados metabolizadores pobres para CYP2C19 e um indivíduo com fenótipo metabolizador ultra-rápido. Foi desenvolvido e validado um método por HPLC-DAD para determinação simultânea de amitriptilina, nortriptilina, desmetilnortriptilina, E-10-hidróxi-amitriptilina, Z-10-hidróxi-amitriptilina, E-10-hidróxi-nortriptilina e Z-10-hidróxi-nortriptilina. Posteriormente, 5 voluntários com diferentes fenótipos metabolizadores para CYP2C19 (1 ultra-rápido, 3 extensivos e 1 pobre) receberam uma dose oral de 1mg. kg-1 de amitriptilina e forneceram amostras de sangue nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 24 e 48 horas pós-dose. Foram observadas diferenças nos parâmetros farmacocinéticos e nas razões metabólicas de hidroxilação entre os diferentes fenótipos para CYP2C19. Deste forma, o cálculo do índice metabólico de desmetilação a partir das concentrações de amitriptilina e nortriptilina, determinadas em uma amostra coletada 3 horas após uma dose única ou após a primeira dose oral de amitriptilina, pode ser utilizada para determinar o fenótipo metabolizador para CYP2C19, permitindo um ajuste precoce da posologia.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Brazil is the third largest market for pesticide sales in the world, with almost 400 active ingredients registered in the country, including five dithiocarbamates. This pesticide class consists of very important protective nonsystemic fungicides with broad-spectrum activity registered for the control of fungal deseases on a large variety of crops. Due to its low acute toxicity, combined with strong action, low-cost production and low environmental persistence, the total amount used of these compounds used is still increasing world-wide. Many methods to determine dithiocarbamates are based on acid hydrolysis in the presence of stannous chloride and analysis of the evolved CS2 by different techniques. In the present work, three chromatographic methods were validated for the quantification of dithiocarbamates residues in lettuce using Gas Chromatography with Electron Capture Detection (GC-ECD), Flame Photometric Detection (GC-FPD) and Mass Spectrometry (GC-MS), and these three methods were compared with a spectrophotometric method.The experimental conditions for the chromatographic analysis were: capillary column CP-Sil 8 CB (50 m x 0.32 mm i.d. x 1.2 μm film thickness); temperature program column oven: 45 oC (1 min) - 10 oC min-1 to 250 oC (0 min); flow-rate of the carrier gas (Helium) 2 mL min-1; volume of injection 4 μL, with split 1:10 for GC-ECD and GC-MS and 1:15 for GC-FPD; temperature of the detector was 300 oC for ECD and 250 °C for FPD. The transferline and trap were heated to 230 °C and the manifold to 120 °C. The spectrophotometric analysis was done in 435 nm, after complexation of the CS2 with diethanolamine and copper. In the validation study of the methods, the following parameters were assessed: detection limit (LOD), quantification limit (LOQ), precision (under repeatability and reproducibility conditions) and recovery. Method LODs in the sample were 0.01 mg CS2 kg-1 and 0.28 mg CS2 kg-1 and LOQs were 0.02 mg CS2 kg-1 and 0.4 mg CS2 kg-1 for chromatographic and spectrophotometric methods respectively. The calibration curves were linear with correlation coefficients r2> 0.99. Acceptable precision with RDS% between 2.8 and 15.9 was obtained. The recoveries ranged from 87.7 to 107.4%. The results obtained in the validation step allow us to conclude that the methods are quite appropriate to determine residues of dithiocarbamates in lettuce. However, the chromatographic methods have shown a lot of advantages such as to be more sensitive, simple and faster than the spectrophotometric method. Beside, the sample preparation can be done simultaneously for a great number of samples and in a simplified way. / O Brasil é o terceiro maior mercado mundial de pesticidas, com aproximadamente 400 ingredientes ativos registrados no país, incluindo cinco ditiocarbamatos. Esta classe de pesticidas é composta por importantes fungicidas de ação não sistêmica e de amplo espectro de atividade empregados para controle de fungos em uma grande variedade de culturas. Devido a baixa toxicidade, combinado com forte atividade, baixo custo de produção e baixa persistência ambiental, a quantidade destes compostos tem aumentado no mundo inteiro. Muitos métodos para determinar ditiocarbamatos estão baseados na hidrólise ácida, em presença de cloreto de estanho II, e análise do CS2 gerado por diferentes técnicas. Neste trabalho, foram validados três métodos cromatográficos para a quantificação dos resíduos de ditiocarbamatos em alface empregando Cromatografia Gasosa com Detecção por Captura de Elétrons (GC-ECD), Detecção Fotométrica de Chama (GC-FPD) e Detecção Espectrométrica de Massas (GC-MS), e comparou-se com o método espectofotométrico. As condições para as análises cromatográficas foram: coluna capilar CP-Sil 8 CB (50 m x 0,32 d.i x 1,2 μm de espessura do filme); programa de temperatura do forno da coluna: 45 °C (1 min) com incremento de 10 °C min-1 à 250 ° C (0 min); vazão do gás de arraste em 2 mL min-1; volume de injeção de 4 μL com split 1:10 para GC-ECD e GC-MS, e 1:15 para GC-FPD; temperatura do ECD foi 300 °C e do FPD de 250 °C. O transferline e o trap foram aquecidos a 230 °C, e o manifold a 120 °C. A análise espectrofotométrica foi realizada a 435 nm, após a complexação do CS2 com dietanolamina e cobre. Para a validação dos métodos seguiram-se os seguintes parâmetros: limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e recuperação. Os LODs na amostra foram 0,01 e 0,28 mg CS2 kg-1, e os LOQs foram 0,02 e 0,4 mg CS2 kg-1 para os métodos cromatográficos e espectrofotométrico, respectivamente. As curvas analíticas apresentaram r2> 0,99. Os estudos de precisão apresentaram resultados aceitáveis, com valores de RSD% entre 2,8 e 15,9. As recuperações foram de 87,7 a 107,4%. Através dos resultados obtidos na validação, pode-se concluir que os métodos são apropriados para determinar resíduos de ditiocarbamatos em alface. Entretanto, os métodos cromatográficos têm apresentado várias vantagens como elevada sensibilidade, simplicidade, além de serem mais rápidos que o método spectrofotométrico, pois é possível realizar o preparo de um grande número de amostras simultaneamente.