Les nombreuses pressions naturelles et anthropiques qui pèsent sur les écosystèmes coralliens font craindre leur disparition pour les années futures. Parmi les mesures de conservation, la cryoconservation permet de maintenir en sécurité les échantillons sur le long terme et à coût réduit. Les premiers travaux sur la cryoconservation des Anthozoaires incitent à développer davantage la méthode de vitrification plutôt que la congélation lente. Dans ce contexte, cette thèse propose d'expérimenter la technique de vitrification sur plusieurs formes pluricellulaires dont les apex, les planulae, les polypes primaires, les polypes isolés et les balles tissulaires (TB), toutes issues du Scléractiniaire Pocillopora damicornis. Les meilleurs résultats ont été produits avec les TB obtenues après exposition à une solution de KSW puis traitées selon la méthode V Cryo-plate. L'éthylène glycol (EG) s'est avéré le cryoprotecteur (CPA) le mieux toléré jusqu'à 4.0 M pendant 20 min à température ambiante (RT). Les mélanges binaires et ternaires de CPA ont cependant permis d'obtenir de meilleures tolérances des TB qu'avec les solutions individuelles. L'utilisation de solutions successives a permis d'obtenir des survies jusqu'à 4.5 M selon le protocole : 1.5 M EG + 0.5 M Glycérol (Gly) (5 min, RT) puis 1.5 M DMSO + 1.5 M EG + 1.5 M Gly (10 min, 0°C) et enfin 1.5 M EG + 0.5 M Gly (5 min, RT). L'intégrité des cellules épithéliales de l'ectoderme apparaît essentielle au maintien des TB durant et après les traitements. Si le protocole de vitrification n'a pu être mis au point, en revanche, l'utilisation des TB à des fins de cryoconservation apparaît très intéressante pour de futures investigations. / Numerous environmental and anthropic pressures threaten reef ecosystems, rising concerns on species loss in coming years. Among conservation measures, cryopreservation ensures the safe and cost-effective long-term conservation of biological material. The first publications focusing on Anthozoa cryopreservation reported that the vitrification approach was preferable to the slow-cooling approach. In this context, this thesis aimed at investigating a vitrification technique with several pluricellular forms of the Scleractinian Pocillopora damicornis including apexes, planulae, primary polyps, isolated polyps and tissue balls (TB). The best results were obtained using TBs produced by exposing coral branches to a KSW solution. TBs were cryopreserved using the V Cryo-plate method. The highest TB tolerance was obtained after exposure to solution containing ethylene glycol (EG) concentrated to 4.0 M for 20 min at room temperature (RT). Binary and ternary cryoprotectant (CPA) solutions were better tolerated by TBs compared with individual cryoprotectant solutions. Exposure of TBs to a series of cryoprotectant solutions with progressively increased concentration allowed obtaining TB tolerance to cryoprotectant with a concentration of 4.5 M with: 1.5 M EG + 0.5 M Glycerol (Gly) (5 min, RT), 1.5 M DMSO + 1.5 M EG + 1.5 M Gly (10 min, 0°C) and then 1.5 M EG + 0.5 M Gly (5 min, RT). Epithelial cells from the ectoderm were essential to maintain TB integrity during and following CPA treatments. Successful cryopreservation was not achieved in this work; however, it demonstrated that the use of TBs constitutes a promising way for further cryopreservation research.

Aujourd'hui, la congélation de l'embryon est la voie privilégiée pour la cryoconservation des ressources génétiques lapin au sein de la Cryobanque Nationale. Les objectifs de notre travail étaient d'optimiser la production des embryons et de développer une nouvelle voie de cryoconservation des ovocytes MII de lapin par congélation lente et par vitrification. Les expériences menées sur les traitements de superovulation et de synchronisation ainsi que sur le moment d'insémination par rapport au sevrage montrent que les conditions d'environnement des lapines sont plus importantes que la nature des traitements administrés. De plus, l'évaluation du métabolisme, de la structure et de la capacité de développement ovocytaire après réchauffement suggère que la vitrification et la congélation lente altèrent fortement les ovocytes par des lésions associées respectivement à leur importante sensibilité aux cryoprotecteurs et à la cristallisation intracellulaire.

In the present study, we examined several cryoextenders previously used by several authors and various freezing protocols to determine the relative importance of each parameter on sperm freezing. The effects of controlled seeding and changes in cooling rate at different stages of freezing were also examined. Sperm samples from seven individual carp males were frozen in 0.5 ml straws by conventional freezing. Cooling rates were determined by monitoring the sample's internal temperature. We compared four freezing protocols, which involved placing sperm samples at various levels (1, 3, 6, and 9 cm) above the liquid nitrogen (LN) surface (corresponding to -190, -150, -110, and -70 °C, respectively) for 20 min followed by transferring the samples into LN. Freezing at 3 cm above the LN surface resulted in the highest motility (33 ? 8 %) and velocity (118 ? 9 ?m/s) of spermatozoa after thawing and diluting in swimming medium. We determined that -90 °C is an optimal temperature at which immersing the samples in LN does not affect sperm motility after thawing. The sperm motility of samples immersed in LN before or immediately after the crystallisation point (-16 °C) was 0 %. Motility of spermatozoa cryopreserved with or without a seeding procedure was not significantly different after thawing. Therefore, we hypothesise that supercooling the sample during the conventional freezing procedure is not the main damaging factor during carp spermatozoa cryopreservation.

Cette étude visait à établir un protocole de cryoconservation pour des apex de vigne et à tester l'efficacité de la cryoconservation pour éliminer des virus de la vigne sélectionnés. Des cultures in vitro de génotypes sains de huit cultivars croates autochtones de vigne, Plavac mali, Maraština, Pošip, Debit, Grk, Lasina, Plavina et Vugava et de génotypes infectés de Plavac mali ont été établies. Les différences de survie, de reprise et des paramètres de croissance observés se sont avérées spécifique des génotypes. Les cultivars infectés se sont montrés moins réactifs que les cultivars sains. Un protocole de cryoconservation basé sur la vitrification avec PVS2 a été établi. Les modifications de la préculture avec le saccharose et l'utilisation de solutions alternatives de cryoconservation n'ont pas amélioré la reprise. A l'opposé, l'état physiologique du matériel végétal a joué un rôle essentiel pour la cryoconservation. Des bourgeons en croissance active prélevés sur des microboutures mononodales ont montré une reprise plus élevée que des bourgeons prélevés directement sur les vitroplants. La position des bourgeons sur la tige des plantes-mères in vitro a affecté la reprise après cryoconservation. L'addition de benzylaminopurine au milieu de culture des microboutures a eu un effet positif sur la reprise après immersion dans l'azote liquide, alors qu'aucun effet positif n'a été observé sur la reprise avec la zéatine riboside ou la proline. Le protocole de cryoconservation établi a permis d'obtenir environ 50% de reprise avec le cultivar Portan et avec trois des quatre cultivars internationaux utilisés. Par contre, aucune reprise ou une reprise très faible a été observée avec les cultivars croates testés. En se basant sur les tests ELISA réalisés, le virus GFLV a été éliminé de 82,4% des apex non cryoconservés et de 77,8% des apex cryoconservés chez le cultivar Chardonnay et le GLRaV-3 a été éliminé de 100% des apex non cryoconservés et cryoconservés chez le cultivar Cabernet Sauvignon. Ces résultats sont à relier à nos études d'immunolocalisation, qui ont montré que le GFLV était présent dans le dôme apical et les tissus méristématiques chez le cultivar Pinot Noir and que le GLRaV-3 était présent dans les tubes criblés chez le cultivar Merlot. La stabilité génétique des plantes régénérées à partir des apex cryoconservés a été étudiée en utilisant les marqueurs AFLP. Avec les huit combinaisons d'amorces utilisées sur les 43 plantes testées, aucun polymorphisme n'a été observé après la préculture au saccharose, le traitement avec la solution de loading et la solution de PVS2 diluée de moitié. Par contre, des fragments polymorphes ont été observés sur des explants non cryoconservés et cryoconservés traités avec la solution PVS2, dont le nombre augmentait avec l'augmentation de la durée d'exposition à la solution PVS2. / This study aimed at establishing a cryopreservation protocol for grapevine shoot tips and at testing the efficiency of cryopreservation in eliminating selected grapevine viruses. In vitro cultures of healthy genotypes of eight Croatian autochthonous grapevine cultivars Plavac mali, Maraština, Pošip, Debit, Grk, Lasina, Plavina and Vugava and of virus-infected genotypes of Plavac mali were successfully established. Differences in survival, regrowth and growth parameters were genotype-specific. Infected cultivars were less reactive compared to healthy ones. A PVS2-based cryopreservation protocol was successfully established. Modifications in sucrose preculture conditions and use of PVS2-derived alternative vitrification solutions did not improve growth recovery. By contrast, the physiological state of the plant material played a critical role in cryopreservation. Actively growing buds sampled from single-node microcuttings displayed higher regrowth compared to buds sampled directly on in vitro plantlets. The position of buds on the stem of in vitro mother-plants affected regrowth after cryopreservation. The addition benzylaminopurine in the shooting medium had a positive effect on regrowth after liquid nitrogen exposure, while no such positive effect was observed with zeatine riboside or proline. The cryopreservation protocol established led to approximately 50% recovery with cultivar Portan and three of the four international cultivars tested. By contrast, no or very low recovery was noted with the Croatian cultivars tested. Based on ELISA tests, the GFLV virus was eliminated from 82.4% of non-cryopreserved samples and from 77.78% of cryopreserved samples in cultivar Chardonnay and the GLRaV-3 virus was eliminated from 100% of both non-cryopreserved and cryopreserved samples in cultivar Cabernet Sauvignon. These results may be related with our immunolocalisation studies, which showed that GFLV was found in the apical dome and meristematic tissues in cultivar Pinot Noir and GLRaV-3 in sieve elements of cultivar Merlot. Genetic stability of plants regenerated from cryopreserved shoot tips was studied using AFLP markers. With the eight AFLP primer combinations employed on the 43 plants tested, no polymorphism was observed after sucrose preculture, treatment with the loading solution and half-strengthPVS2. However, polymorphic fragments were observed in non-cryopreserved and cryopreserved samples treated with PVS2 solution, the number of which increased with increasing durations of exposure to PVS2 solution.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Le domaine du génie tissulaire ouvre la voie à l'utilisation de nouvelles stratégies pour l'obtention de tissus de remplacement. Un soin particulier doit être porté lors de la production de ces substituts afin d'optimiser la quantité et la qualité des cellules prolifératrices présentes à l'intérieur de ces tissus. Nos analyses ont permis de déterminer que les caractéristiques du site de prélèvement cutané influençaient la quantité de cellules souches retrouvées in situ. De plus, nos expérimentations sur le modèle de peau reconstruite par auto-assemblage permet de préserver les cellules avec un cycle lent de division cellulaire, une caractéristique des cellules souches cutanées. Finalement, la cryopréservation, utilisée pour conserver les lignées de kératinocytes, n'influence pas la fonction des cellules souches épithéliales. Ces résultats suggèrent que les techniques utilisées pour la production de substituts cutanés sont optimales dans un contexte où la conservation des cellules souches est une nécessité.

Ce mémoire compare, dans un premier temps, les impacts de deux protocoles de congélation de la semence de bouc (diluants à base de jaune d’œuf ou de lait) sur la qualité de la semence décongelée ainsi que sur son pouvoir fécondant. Pour ce faire, les semences de sept boucs de race Alpine, soumis à une photopériode alternant les jours courts (JC) et les jours longs (JL) toutes les six semaines, ont été récoltées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 mois. Chaque éjaculat récolté a été analysé (volume, concentration, viabilité, intégrité de l’acrosome), divisé et congelé selon les deux protocoles de cryoconservation. La semence a été analysée de 0 à 5 h après sa décongélation. Afin de comparer l’impact du protocole de congélation sur le pouvoir fécondant de la semence, une série d’inséminations artificielles (IA) intra cervicales a été réalisée sur des chèvres en chaleurs synchronisées. Dans un deuxième temps, ce mémoire évalue l’efficacité des IA réalisées sur les chèvres en chaleurs synchronisées et sur les chèvres en chaleurs naturelles. Dans un troisième temps, ce mémoire documente l’influence d’une photopériode de 6 semaines sur l’activité sexuelle et sur la qualité de la semence (fraîche et décongelée) des boucs québécois. Les résultats ont démontré une tendance favorable au diluant à base de lait. La fertilité de la semence congelée dans le lait est supérieure à la semence congelée dans le jaune d’œuf (P = 0,067). La qualité de la semence congelée permet d’expliquer les taux de fertilité obtenus. La semence congelée dans le lait montre une meilleure motilité, viabilité, intégrité de l’acrosome et activité des mitochondries à différents temps entre 0 et 5 h après décongélation. Ainsi, le protocole de congélation à base de lait permet une meilleure conservation de la qualité de semence des boucs que le protocole à base de jaune d’œuf. Une grande variabilité de fertilité entre les mâles a également été observée. Les IA des chèvres en chaleurs naturelles et synchronisées ont permis des fertilités équivalentes. De plus, la photopériode de 6 semaines de JC et 6 semaines de JL a permis de récolter et congeler la semence de bouc tout au long de l’année. Ce travail a permis l’approfondissement des connaissances en lien avec les procédés de congélation de la semence des boucs québécois, de synchronisation des chaleurs et d’IA chez la chèvre. / This work compare the impact of two buck semen freezing process (egg yolk or milk-based diluents) not only on thawed semen quality, but also on fertility rate following artificial inseminations. Semen of seven Alpine bucks, housed under alternative photoperiod of longs days and shorts days every 6 weeks, were collected 2 or 3 times a week for 12 months. Each ejaculate was analysed (volume, concentration, viability and acrosome integrity), divised and frozed in both feezing process. Semen was analysed 0 to 5 hours after thawing. To compare the impact of freezing process on fertility, artificial inseminations were realised on a group of oestrus synchronised goats. This work also evaluate the efficiency of artificial insemination on goat after synchronised or natural oestrus detection. Finaly this work documents the influence of alternative 6 weeks photoperiod on sexual activities and on quebec Alpine buck semen quality (fresh and thawed). Results showed favorable tendency of milk-based diluent. Fertility rate of semen frozen in milk process was superior than in egg yolk process (P = 0.067). Post thawed semen quality explain these fertility results. Milk-based thawed semen show higher molitity, viability, acrosome integrity and mitochondria activity at different times between 0 and 5 hours post-thaw. Thus, milk based freezing process permitted better preservation of semence quality compare to egg yolk based freezing process. Large variability of fertility between bucks have also been observed. Morever, fertility rate following artificial inseminations on goats with natural or syncrhonised oestrus permitted equivalent results. Finaly, the use of 6 weeks photoperiod cycles allowed buck semen collections all year long. This work has increased knowledge related to quebec buck freezing semen process, oestrus synchronisation and artificial inseminations of goats.

Le défi actuel des chercheurs est d’élaborer de nouveaux modèles de substituts cutanés plus perfectionnés et d’optimiser leur méthode de production afin d’améliorer leur reproductibilité. Cette étude a évalué l’impact de la congélation des substituts cutanés à -20°C pendant 2 mois via leurs propriétés physico-chimiques et leur fonctionnalité. Les analyses d’ATR-FTIR montrent que la cryopréservation n’affecte pas l’organisation des lipides de la couche cornée tandis que les analyses d’absorption percutanée montrent que la congélation affecte la perméabilité des substituts cutanés. De plus, le modèle de peau a été optimisé par l’incorporation de lymphocytes T permettant ainsi d’étudier le rôle des lymphocytes sur la différenciation cellulaire des kératinocytes et de mieux comprendre le rôle de la fractalkine dans le développement du psoriasis. Ces résultats nous incitent à penser que la fractalkine se démarque des autres cytokines inflammatoires dans le développement du psoriasis et se doit d’être mieux connue. / The current challenge for researchers is to develop new models for more advanced skin substitutes and optimize their production methods to improve reproducibility. This study evaluates the impact of the freezing of skin substitutes at -20°C for 2 months via their physicochemical properties and functionality. The ATR-FTIR analysis show that the cryopreservation did not affect the lipid organization of the stratum corneum while percutaneous absorption analysis show that the freezing of the permeability affects skin substitutes. In addition, the skin model was optimized by incorporating T lymphocytes and to study the role of lymphocytes in cell differentiation of keratinocytes and better understand the role of fractalkine in the development of psoriasis. These results lead us to believe that fractalkine differs from other inflammatory cytokines in the development of psoriasis and should be investigated.

Couramment utilisées dans les laboratoires du monde entier, les techniques de cryoconservation issues des recherches en cryobiologie sont aujourd’hui devenues des outils incontournables dans plusieurs domaines tels que la biomédecine et l’industrie agroalimentaire. À partir de l’étude des écrits du biologiste anglais Alan Sterling Parkes (1900-1993), ce mémoire propose une reconstruction historique et épistémologique des avancées en cryobiologie. Pour ce faire, nous examinerons, dans un premier temps, les premières observations qui ont avivé l’intérêt pour l’étude des effets du froid sur les organismes vivants. Nous prendrons comme point de départ les découvertes fascinantes des naturalistes du XVIIe siècle. Nous verrons que leurs constats sont souvent étroitement associés à d’autres épisodes majeurs de l’histoire de la pensée biologique. Nous aborderons ensuite la période plus prolifique concernant les avancées en biologie aux basses températures. La découverte des propriétés protectrices du glycérol par l’équipe du National Institute of Medical Research (NIMR) au milieu du siècle dernier marque un point de rupture dans l’histoire de cette spécialité. Ce cryoprotecteur permet en effet d’élargir considérablement la gamme de tissus et de cellules pouvant être cryoconservés. Les développements orchestrés par les chercheurs anglais ont, à cet égard, contribué à l’émergence d’une nouvelle discipline scientifique : la cryobiologie. Enfin, nous étudierons dans une dernière section de ce mémoire le contexte sociohistorique dans lequel ont eu lieu les premières applications pratiques des méthodes de cryoconservation. Cela nous conduira à analyser, en particulier, certains enjeux soulevés par l’implantation de ces techniques dans le champ de la médecine reproductive. Ce mémoire aura non seulement permis de retracer certains évènements qui ont jalonné l’histoire de la cryobiologie au fil du temps, mais aussi de mettre en valeur les contributions fondatrices de Parkes et son équipe tout en montrant le rôle de premier plan qu’elles ont joué dans la structuration de cette discipline. / With a panoply of applications ranging from therapeutics to everyday processes in the biomedical and agricultural industry, cryobiology-derived techniques have become essential to many present-day human activities. In this master’s thesis, I explore the history and epistemology of cryobiology through the lens of English biologist Alan Sterling Parkes (1900-1990). I will start by looking at the very first observations made by naturalists in the XVIIth century on the effects of low temperatures on living organisms and how these have been essential to the field of cryobiology. Those observations, as we will see, are also linked to other major episodes in the history of biology. From there, I will trace the early days of cryobiology, with a particular focus on a major scientific breakthrough: the discovery of protective properties of glycerol by Parkes and his colleagues at the National Institute of Medical Research (NIMR) at the end of World War II. This new cryoprotective agent enabled the preservation of living tissues and cells, thus revolutionizing the field of biology at low temperatures as well cementing cryobiology as a brand-new research field of its own. Finally, I will analyze the socio-historical context of cryobiology’s first practical applications, most notably in the field of reproductive medicine. This work aims at reconstructing the history of cryobiology and highlights the contribution of Parkes and his NIMR colleagues while also showing the role these played into structuring the emerging field.

La cryoconservation d'ovocytes est une méthode qui faciliterait la conservation du potentiel génétique chez la femelle et permettrait plus de flexibilité dans l'application des techniques de reproduction assistée chez les animaux domestiques et les espèces en voie de disparition. Chez le cheval, le taux de réussite de cette technique est faible comparée à celui obtenu chez d’autres espèces animales. Par conséquent, plus d’études seront nécessaires pour élucider les mécanismes spécifiques responsables du faible taux de succès après la cryopréservation. Le but de cette étude était d'évaluer l'effet de la vitrification d'ovocytes équins immatures sur leur taux de maturation, de clivage et le développement de blastocystes en utilisant un protocole de vitrification en trois étapes avec de l’ethylène glycol (EG) et du diméthylsulfoxyde (DMSO), ainsi que comparer l'effet des milieux hors congélation. Le protocole de vitrification utilisé dans la présente étude a été conçu en fonction des résultats obtenus au cours d’études préliminaires. Des ovocytes provenant de follicules immatures de juments ont été conservés pendant une nuit (14-18 heures) à température ambiante (~22⁰C) dans un milieu de maintien. Le lendemain, les ovocytes ont été dénudés et placés dans une solution de base (BS) composée de 20% de sérum de veau foetal (FBS) + M199/Hanks’ salts. Les ovocytes ont ensuite été répartis au hasard dans différents groupes : contrôle, vitrification et exposés aux agents cryoprotecteurs (CPA)-. Les ovocytes du groupe contrôle ont été immédiatement mis en maturation in vitro (IVM). Trois ovocytes ont été exposés à un protocole de vitrification en trois étapes décomposées en (1) solution de pré-vitrification (PVS) 1 (5% EG / 5 DMSO) 40s. (2) PVS 2 (10% EG / 10% DMSO) 40s et enfin, (3) solution de vitrification (VIT) (17,5% EG / 17,5% DMSO / 3 M saccharose) 10s. Le groupe vitrification est plongé dans l'azote liquide alors que les groupes CPA-exposés ont été exposés aux cryoprotecteurs mais n’ont pas été congelés. Les ovocytes ont ensuite été transférés sur un maillage en acier inoxydable stérile puis réchauffés à 42 ° C dans un BS pendant 5 min. Les ovocytes ont ensuite été soumis à l’IVM, fécondés par injection intracytoplasmique d’un spermatozoïde puis mis en culture dans le but de produire des embryons. Les différences en termes de maturation, de clivage et de taux de blastocystes entre les groupes ont été analysées par le test exact de Fisher. Le taux de maturation des deux groupes vitrification et CPA-exposés ne différait pas significativement avec le groupe contrôle. Aucun blastocyste n'a cependant été obtenu des groupes vitrification et CPA-exposés. Ces résultats ont montré que les ovocytes équins immatures peuvent maintenir une viabilité et une compétence méiotique après vitrification similaires à celles du groupe contrôle; de plus, l'exposition aux cryoprotecteurs n'a pas abouti à la formation de blastocystes en comparaison avec le groupe contrôle. Une étude plus approfondie sur la physiologie des ovocytes équins est nécessaire afin de pouvoir optimiser la production d’embryons. / Oocyte cryopreservation would facilitate the conservation of female genetic material and allow more flexibility in the application of assisted reproductive techniques in domestic animals and endangered species. The overall success rate of this technique in the horse is low compared with other species. Therefore, further research is required to elucidate the species-specific mechanisms responsible for poor survivability following vitrification. This study aimed to evaluate the effect on maturation rate, cleavage and blastocyst development of vitrified immature equine oocytes, using a three-step vitrification protocol with ethylene glycol (EG) and dimethyl sulfoxide (DMSO); and comparing the effect of media without freezing. The vitrification protocol was designed based on the results of preliminary experiments. Oocytes were recovered from immature follicles of live mares. Oocytes were held overnight at room temperature (14-24 hrs) in a holding medium. Oocytes were then denuded and placed in a base solution (BS) composed of 20% fetal bovine serum (FBS) + M199/Hanks’ salts. Oocytes were randomly allotted to control, vitrification, and cryoprotectant agents (CPAs)-exposed groups. Control oocytes were cultured directly for in-vitro maturation (IVM). Three oocytes were exposed to a three-step vitrification protocol composed of a pre-vitrification solution (PVS) 1 (5% EG/ 5% DMSO); PVS 2 (10% EG/ 10% DMSO) during 40s each; and finally vitrification solution (VS) (17.5% EG/ 17.5% DMSO/ 3 M sucrose), during 10s. All media were diluted in M199/Hanks’ salts + 20% FBS. Oocytes were then transferred to a 75-μm sterile stainless steel mesh. The oocytes were warmed at 42 °C in the BS for 5 minutes. Oocytes from the vitrified group were plunged into liquid nitrogen, while oocytes from CPA-exposed groups were only exposed to cryoprotectants. Oocytes were then subjected to IVM, fertilization and embryo culture. Fisher's Exact Test analyzed differences in maturation, cleavage and blastocyst rates between groups. The maturation rate of vitrified and CPA-exposed groups did not differ significantly from control oocytes. However, no blastocysts were obtained from CPA-exposed and vitrified groups. Vitrification and control groups showed that immature equine oocytes could maintain viability and meiotic competence; moreover, cryoprotectant exposure did not show any blastocyst formation as compared to control. Further investigation is necessary to understand the overall physiology of equine oocytes in order to optimize the developmental capacity of embryos.

La cryoconservation du sperme a des avantages évidents pour l'industrie animale. Cependant, ce processus semble affecter les propriétés du sperme ainsi que son pouvoir fécondant. La présente thèse vise à étudier l'hypothèse que la congélation du sperme a un impact négatif sur son pouvoir fécondant. Cet impact pourrait être dû à des dommages à l'ADN causés par le stress oxydatif qui accompagne la congélation. Il pourrait aussi découler de l'altération d'autres paramètres fonctionnels suite au processus du congélation-décongélation. Le sperme ovin utilisé provenait de cinq béliers de race Dorset, logés au Centre d'expertise en production ovine du Québec (CEPOQ, La Pocatière, Qc, Canada). Le sperme bovin congelé provenait de 14 taureaux ayant un pouvoir fécondant connu par L'Alliance Boviteq (St-Hyacinthe, Qc, Canada). Immédiatement après la décongélation (0 h) et durant 24 h d'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle, les semences bovines et ovines ont été soumises au SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) et aux tests d'évaluation de qualité du sperme incluant les paramètres de motilité, de viabilité, l'état physiologique (patron de CTC), la peroxydation lipidiques ainsi que les niveaux cytosoliques du calcium. Le premier objectif a porté sur l'étude des effets de la cryoconservation et de l'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle sur l'intégrité de l'ADN du sperme. Les résultats montrent une altération de l'intégrité de l'ADN juste après la décongélation et durant l'incubation dans le milieu SOF (synthetic oviductal fluid). Cette altération est plus significative dans la semence congelée, par rapport à la semence fraîche. De tels dommages à l'ADN du sperme ovin pourraient être dus au stress oxydatif. Pour tester cette hypothèse, la stabilité de l'ADN ainsi que la peroxydation lipidique (LPO) ont été évaluées dans le sperme de béliers frais et congelé, traité ou non avec du H2O2. Alors que la congélation n'a pas d'effet sur la LPO, le H202 (150 ou 300 uM) affecte l'intégrité de l'ADN après 24 h d'incubation. Également, et malgré la baisse de la motilité et l'augmentation du pourcentage de spermatozoïdes ayant un patron AR de réaction à l'acrosome à 1 h, ni la LPO ni la viabilité du sperme ont été affectées par le H2O2. Cette LPO était corrélée avec l'instabilité de l'ADN. Ces résultats montrent clairement que la cryoconservation facilite l'instabilité de l'ADN de la semence de bélier. Cet effet est, en partie, dû au stress oxydatif. Concernant les essais avec le sperme bovin, deux expériences ont été menées sur 14 taureaux (1 à 4 éjaculats/taureau) classés en deux groupes de haute ou de faible fertilité in vivo évaluée par le taux de non-retour en chaleurs des vaches inséminées. L'essai 1 portait sur l'étude des corrélations entre la stabilité de l'ADN du sperme du taureau et sa fertilité durant une incubation dans le Talp-BSA à 0 et à 7 h. L'essai 2 a porté sur l'étude des corrélations entre les niveaux cytosoliques de calcium du sperme bovin cryopréservé et la fertilité du taureau in vivo. Les résultats montrent que l'altération de l'ADN était significativement plus élevée chez le groupe de faible fertilité à 0 h. En revanche, les niveaux de calcium cytosolique ont été similaires à 0 h et réduites significativement chez les taureaux les plus fertiles à 7 h d'incubation dans le Talp-BSA. À la lumière de ces résultats, il découle que la réduction de la fertilité du taureau in vivo est due aux dommages à l'ADN du sperme cryoconservé. Également, la cytométrie en flux semble être un outil de choix permettant une analyse objective et rapide de plusieurs paramètres spermatiques d'un grand nombre de spermatozoïdes en même temps. Pour ces raisons, il est recommandé d'utiliser l'analyse de cytométrie en flux (y compris le test de l'intégrité de l'ADN) dans l'industrie de l'insémination artificielle afin d'évaluer la qualité du sperme et sa relation avec la fertilité masculine.