La cryoconservation d'ovocytes est une méthode qui faciliterait la conservation du potentiel génétique chez la femelle et permettrait plus de flexibilité dans l'application des techniques de reproduction assistée chez les animaux domestiques et les espèces en voie de disparition. Chez le cheval, le taux de réussite de cette technique est faible comparée à celui obtenu chez d’autres espèces animales. Par conséquent, plus d’études seront nécessaires pour élucider les mécanismes spécifiques responsables du faible taux de succès après la cryopréservation. Le but de cette étude était d'évaluer l'effet de la vitrification d'ovocytes équins immatures sur leur taux de maturation, de clivage et le développement de blastocystes en utilisant un protocole de vitrification en trois étapes avec de l’ethylène glycol (EG) et du diméthylsulfoxyde (DMSO), ainsi que comparer l'effet des milieux hors congélation. Le protocole de vitrification utilisé dans la présente étude a été conçu en fonction des résultats obtenus au cours d’études préliminaires. Des ovocytes provenant de follicules immatures de juments ont été conservés pendant une nuit (14-18 heures) à température ambiante (~22⁰C) dans un milieu de maintien. Le lendemain, les ovocytes ont été dénudés et placés dans une solution de base (BS) composée de 20% de sérum de veau foetal (FBS) + M199/Hanks’ salts. Les ovocytes ont ensuite été répartis au hasard dans différents groupes : contrôle, vitrification et exposés aux agents cryoprotecteurs (CPA)-. Les ovocytes du groupe contrôle ont été immédiatement mis en maturation in vitro (IVM). Trois ovocytes ont été exposés à un protocole de vitrification en trois étapes décomposées en (1) solution de pré-vitrification (PVS) 1 (5% EG / 5 DMSO) 40s. (2) PVS 2 (10% EG / 10% DMSO) 40s et enfin, (3) solution de vitrification (VIT) (17,5% EG / 17,5% DMSO / 3 M saccharose) 10s. Le groupe vitrification est plongé dans l'azote liquide alors que les groupes CPA-exposés ont été exposés aux cryoprotecteurs mais n’ont pas été congelés. Les ovocytes ont ensuite été transférés sur un maillage en acier inoxydable stérile puis réchauffés à 42 ° C dans un BS pendant 5 min. Les ovocytes ont ensuite été soumis à l’IVM, fécondés par injection intracytoplasmique d’un spermatozoïde puis mis en culture dans le but de produire des embryons. Les différences en termes de maturation, de clivage et de taux de blastocystes entre les groupes ont été analysées par le test exact de Fisher. Le taux de maturation des deux groupes vitrification et CPA-exposés ne différait pas significativement avec le groupe contrôle. Aucun blastocyste n'a cependant été obtenu des groupes vitrification et CPA-exposés. Ces résultats ont montré que les ovocytes équins immatures peuvent maintenir une viabilité et une compétence méiotique après vitrification similaires à celles du groupe contrôle; de plus, l'exposition aux cryoprotecteurs n'a pas abouti à la formation de blastocystes en comparaison avec le groupe contrôle. Une étude plus approfondie sur la physiologie des ovocytes équins est nécessaire afin de pouvoir optimiser la production d’embryons. / Oocyte cryopreservation would facilitate the conservation of female genetic material and allow more flexibility in the application of assisted reproductive techniques in domestic animals and endangered species. The overall success rate of this technique in the horse is low compared with other species. Therefore, further research is required to elucidate the species-specific mechanisms responsible for poor survivability following vitrification. This study aimed to evaluate the effect on maturation rate, cleavage and blastocyst development of vitrified immature equine oocytes, using a three-step vitrification protocol with ethylene glycol (EG) and dimethyl sulfoxide (DMSO); and comparing the effect of media without freezing. The vitrification protocol was designed based on the results of preliminary experiments. Oocytes were recovered from immature follicles of live mares. Oocytes were held overnight at room temperature (14-24 hrs) in a holding medium. Oocytes were then denuded and placed in a base solution (BS) composed of 20% fetal bovine serum (FBS) + M199/Hanks’ salts. Oocytes were randomly allotted to control, vitrification, and cryoprotectant agents (CPAs)-exposed groups. Control oocytes were cultured directly for in-vitro maturation (IVM). Three oocytes were exposed to a three-step vitrification protocol composed of a pre-vitrification solution (PVS) 1 (5% EG/ 5% DMSO); PVS 2 (10% EG/ 10% DMSO) during 40s each; and finally vitrification solution (VS) (17.5% EG/ 17.5% DMSO/ 3 M sucrose), during 10s. All media were diluted in M199/Hanks’ salts + 20% FBS. Oocytes were then transferred to a 75-μm sterile stainless steel mesh. The oocytes were warmed at 42 °C in the BS for 5 minutes. Oocytes from the vitrified group were plunged into liquid nitrogen, while oocytes from CPA-exposed groups were only exposed to cryoprotectants. Oocytes were then subjected to IVM, fertilization and embryo culture. Fisher's Exact Test analyzed differences in maturation, cleavage and blastocyst rates between groups. The maturation rate of vitrified and CPA-exposed groups did not differ significantly from control oocytes. However, no blastocysts were obtained from CPA-exposed and vitrified groups. Vitrification and control groups showed that immature equine oocytes could maintain viability and meiotic competence; moreover, cryoprotectant exposure did not show any blastocyst formation as compared to control. Further investigation is necessary to understand the overall physiology of equine oocytes in order to optimize the developmental capacity of embryos.

La toxicologie génétique est une discipline qui vise à détecter des facteurs chimiques ou physiques interagissant avec l'ADN des cellules et qui, en l'absence de réparation fidèle, sont susceptibles de provoquer des mutations géniques et/ou chromosomiques. Le test des comètes est un test court de génotoxicité simple, reproductible et rapide pour étudier la survenue de lésions primaires de l'ADN. Il s'agit d'une technique micro-électrophorétique très sensible permettant la mise en évidence des lésions de l'ADN de cellules eucaryotes individuelles exposées à des agents génotoxiques. En présence de cassures de l'ADN, les fragments d'ADN ainsi formés migrent plus rapidement que l'ADN intact lors de l'électrophorèse, donnant aux noyaux cellulaires l'aspect de comètes. La cryoconservation des ovocytes matures par vitrification a de nombreuses applications: alternative à la congélation d'embryons en FIV, préservation de la fertilité avant traitement gonadotoxique, développement du don d'ovocyte. La vitrification consiste à transformer un liquide en un état vitreux et utilise des agents cryoprotecteurs (CP) à haute concentration. Plusieurs centaines de naissances d'enfants en bonne santé ont été décrites . Néanmoins peu d'études ce sont intéressées aux effets à long terme de cette technique en particulier au plan génétique. L'objectif de ce travail a été dans un premier temps de développer et de valider une technique de test des comètes sur ovocyte de souris, puis d'utiliser ce test pour évaluer la génotoxicité du PrOH sur les ovocytes de souris qu'il soit employé seul ou inclus dans les solutions de vitrifications commercialisées pour la cryoconservation d'ovocytes humains. / Genetic toxicology is a discipline that aims to detect chemical or physical factors interact with the DNA of somatic and / or germ cells and in the absence of accurate repair, are likely to cause gene and / or chromosomal mutations. The comet assay is a simple, reproductive and rapid test to study primary DNA damage. This microelectrophoretic technique, is used to visualize denatured DNA fragments migrating out of the cell nucleus during electrophoresis. The image obtained is a ''comet'' with a distinct head consisting of intact DNA and a tail containing relaxed DNA loops or broken pieces of DNA. Oocyte vitrification techniques is booming in the world, with the key to many applications: alternative to IVF embryo freezing, fertility preservation before gonadotoxic treatment, development of oocyte donation. Oocyte Vitrification traps all the aqueous solutions in a vitreous solid phase, preventing any ice crystal formation, because of very high cooling rates and high cryoprotectants concentrations. vitrification-cryopreservation has led to several hundred live births with reassuring obstetrical and perinatal outcomes. However, little is known about the possible long-term consequences on human live births after oocyte vitrification. The objective of this work was initially to develop and validate a technique comet assay on mouse oocyte, then to evaluate on mature oocytes the genotoxic effects of PrOH solution and finally the genotoxic effects of three oocyte vitrification protocols used in human ART the genotoxic of three oocyte vitrification protocols used in human.

L‘intérêt de développer de nouvelles applications de la nanotechnologie pharmaceutique dans les soins de santé augmente année après année. Le rôle des nanosystèmes est devenu évident, surtout après que certains d'entre eux aient contribué à des solutions révolutionnaires dans des maladies graves. Dans notre projet, nous avons cherché à synthétiser des nanoparticules (NPs) intelligentes capables de livrer, de façon sélective, des agents anticancéreux. Les NPs ont été synthétisées afin de cibler des cellules cérébrales atteintes par le glioblastome multiforme (GBM), un cancer du cerveau présentant un mauvais pronostic et un taux de survie médian très faible. À cet effet, nous avons planifié de synthétiser et analyser ces nanoparticules et également d’étudier les preuves de concept de leur efficacité. Tout d'abord, nous avons sélectionné avec soin, la procédure de formulation ainsi que les polymères avant d’optimiser les caractéristiques physico-chimiques des nanogels (NGs) formulés à base de chitosane. Après l'optimisation de la taille, du PdI et du potentiel de surface des NGs, nous avons synthétisés des NGs chargés en substance active. Deux molécules thérapeutiques ont été retenues La première était la doxorubicine HCl (DOX) qui est trop hydrophile pour passer la BHE, bien qu’ayant démontré une efficacité in vitro contre le GBM. Le deuxième médicament était le témozolomide (TMZ) qui est déjà utilisé dans le traitement de GBM, comme adjuvant à la radiothérapie, après l’intervention chirurgicale. Les méthodes d'analyses ont ensuite été développées pour déterminer l’efficacité du taux d'encapsulation (EE%) et l'efficacité de chargement de médicament (DLE%) des deux médicaments. Pour la préparation des nanogels théranostiques, nous avons suivi les mêmes procédures après l’addition de l’agent de contraste USPIO, durant la synthèse des NGs. Ensuite, nous avions besoin d’assurer la qualité de nos NGs lors du stockage à long terme. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une procédure de lyophilisation en utilisant différents sucres de nature et de concentrations variables. Les sucres ont été ajoutés pour cryoprotéger les NGs contre les contraintes mécaniques et physiques mises en jeu lors de la lyophilisation. Les sucres qui ont démontré des résultats satisfaisants avec NGs vides ont été utilisés, par la suite, dans la cryoprotection des NGs chargées de médicament au cours de leur lyophilisation. Finalement, nous avons étudié la libération de la DOX à partir des NGs chargées avant et après lyophilisation. Cette étude, en particulier avait deux objectifs. Le premier était de comparer l'effet de la lyophilisation sur le comportement de la libération de DOX des NGs, en observant l’impact de cette procédure sur la cinétique de libération Le deuxième but de l'étude de relargage était de tester la capacité des NGs à libérer leur contenu à trois pH différents : 5.8 (pH intracellulaire des cellules tumorales), 6.8 (espace interstitiel de la tumeur) et 7.4 (plasma sanguin). / The interest in developing new applications of nanotechnology in the pharmaceutical health care increases year after year. The role of nanosystems became clearer, especially after some of them contributed to revolutionary solutions in serious diseases. In our project, we sought to synthesize ‘intelligent’ nanoparticles (NPs) capable of selectively delivering anticancer agents. NPs were synthesized to target brain cells affected by glioblastoma multiforme (GBM), a brain cancer with a poor prognosis and a very low rate of median survival. To this end, we planned to synthesize and analyze these nanoparticles and also to study the proof-of-concept of their efficiency. First, we carefully selected the formulation process and the polymers prior to optimize physicochemical characteristics of the nanogels (NGs) formulated with chitosan. After optimization of the NGs size, PDI and surface potential, we synthesized NGs loaded with active substances. Two therapeutic molecules were selected. First we chose doxorubicin HCl (DOX) which is too hydrophilic to cross the BBB, whereas demonstrating in vitro efficacy against GBM. The second drug was temozolomide (TMZ), already used in the treatment of GBM as an adjuvant to radiotherapy after surgery. Analytical methods were then developed to determine the encapsulation efficiency (EE %) and drug loading efficiency (DLE %) of both drugs. For the preparation of theranostic nanogels, we followed the same procedures after the addition of the USPIO contrast agent during the NGs synthesis. Next, we needed to ensure the quality of our NGs during long-term storage. To achieve this goal, we developed a freeze-drying process using different kind of sugar cryoprotectants at varying concentrations, in order to protect NGs against mechanical and physical stresses at play during freeze-drying. Most promising sugars used with unloaded NGs were subsequently used to cryoprotect DOX-loaded NGs. Finally, we studied the release of DOX from DOX-loaded NGs before and after freeze-drying. This study in particular had two objectives. The first was to compare the effect of the freeze-drying process on the behavior of the DOX-loaded NGs, observing the impact of this procedure on the release kinetics. The second purpose of the release study was to test the ability of NGs to release their contents at three different pH: 5.8 (intracellular pH of tumor cells), 6.8 (interstitial space of the tumor) and 7.4 (blood plasma).

Ibourahema COULIBALY (2010). Contribution à létude de la résistance au séchage des bactéries lactiques (thèse de doctorat en français) ; Université de Liège, Gembloux Agro-Bio Tech, (Belgique), 260 p., 22 tableaux, 39 figures. Résumé Lutilisation de souches lactiques, à léchelle industrielle, nécessite une sélection sur base des propriétés technologiques, physiologiques et biochimiques, ainsi que la mise en oeuvre de procédés biotechnologiques bien maîtrisés pour leur production et leur conservation. A cet effet, le séchage est une étape importante. Sous forme sèche, le produit est plus facilement manipulable. Cependant au cours du séchage, les microorganismes subissent un stress thermique et/ou osmotique qui se traduit par une perte de viabilité pendant le stockage. Lutilisation dagents protecteurs au cours du stockage a permis dobtenir une bonne viabilité. En effet, les bactéries sont soumises pendant la lyophilisation et au cours du stockage à une mortalité liée en grande partie à loxydation des acides gras membranaires. Lanalyse de ces acides au cours des différents procédés de fabrication et de stockage permet de noter la présence des hydroperoxydes. Cette oxydation est engendrée par laction de loxygène sur les acides gras polyinsaturés principalement lacide linoléique (C18:2) et linolénique (C18:3) ce qui engendre la formation des hydroperoxydes : acide hydroperoxyoctadecadienoique (HPOD) et acide hydroperoxyoctadecatrienoique (HPOT) méthylés ou non en position 13- et 9-. Une analyse des composés secondaires émanant des poudres de bactéries lactiques indique la présence de composés volatils. Parmi ceux-ci, apparaissent des molécules volatiles (principalement des aldéhydes), qui modifient la flaveur dorigine des corps gras. Les études menées au niveau des constituants phospholipidiques de la membrane montrent un lien entre le degré doxydation et la mortalité cellulaire au cours du stockage. Les différents phospholipides déterminés au nombre de sept (7) subissent tous cette oxydation à des degrés divers. Lutilisation dantioxydant au cours du stockage permet dinhiber les phénomènes de peroxydation des lipides et permet également de maintenir la valeur nutritionnelle (teneur en AGPI, réduction des dérivés peroxydés nocifs) du produit. Ibourahema COULIBALY (2010). Contribution to the study of resistance of lactic acid bacteria subject to drying. (Dissertation in French) ; University of Liège, Gembloux Agro- Bio Tech , (Belgium), p. 260 p., 22 tables, 39 figures. Summary The use of lactic strains in industrial scale requires selection on the basis of technological, physiological and biochemical properties, as the implementation of biotechnological processes under control for their production and conservation. At this effect drying process is an important step. In dry form, the product is more easily manipulated. However during the drying process, microorganisms undergo heat stress and/or osmotic resulting in a loss of viability during storage. The use of protective agents during storage has resulted in a good viability. In fact, the bacteria are subjected during lyophilization and during storage to a mortality largely oxidation the membrane fatty acids. The analysis of these acids during the process helps to note the presence of hydroperoxydes which are the cause of this mortality. This oxidation is caused by the action of oxygen on polyunsaturated acids linoleic acid (C18:2) and linolenic (C18:3) mostly, causing the formation of hydroperoxydes: hydroperoxyoctadecadienoic acid (HPOD) and hydroperoxyoctadeca-trienoic acid (HPOT) at position 13 - and 9 - methyl or not. An analysis of secondary compounds from the powders indicates the presence of birds. These products appear volatile compounds (mainly aldehydes), hydrocarbons, alcohols, acids etc., which altered the original flavour of fat. Studies in phospholipids constituents of the membrane show a link between the degree of oxidation and cell death during storage. The various phospholipids determined, seven (7) are all undergo this oxidation to various degrees. The use of antioxidants during storage can inhibit the process of lipid peroxydation and helps also to maintain the nutritional value (PUFA content, reduction of harmful peroxide-derived) product.