Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09822.pdf: 14682529 bytes, checksum: b78ed1c4a8226797ef2bda81a2471100 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese(Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:00/01102-1

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 09820.pdf: 9119289 bytes, checksum: e59c57eae7bdaff76ea2557cc6f6a4d1 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 02947.pdf: 6721410 bytes, checksum: 6b8fd88ede9d8533a129cf94a67a4313 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP / FAPESP:92/02990-0

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-06-09T18:48:47Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-06-09T18:48:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5234352 bytes, checksum: 404f7b4f1ab797fa6090d6cd85ee8163 (MD5) Previous issue date: 2013-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plants are sessile organisms susceptible to biotic and abiotic stresses. Insect herbivore attacks are factors that affect their survival and development. To defend themselves, plants produce and release chemical compounds, such as non protein amino acids, that negatively affect the development processes of their attackers, as well as use phytohormones that regulate defense responses against herbivory. In the present work, we seek to understand in depth the insecticidal activity related to ConM, a lectin isolated from beach bean seeds (Canavalia maritima Aub.), through their crystal structure analysis in complex with the non protein amino acid GABA (gamma-aminobutyric acid) and adenine, a nitrogen base-precursor of cytokinins, phytohormones involved in defense responses against insect herbivores. In this way, we co-crystallized ConM with GABA and soaked the derived crystals into an adenine 5mM solution. It was viewed through ConM monomeric model that GABA stabilization occurs through interactions displayed with amino acid residues that participate in the coordination of its isomer alpha-aminobutyric acid (Abu). In the other hand, adenine molecule displays interactions with amino acid residues from ConM Carbohydrate Recognition Domain due ahydrophobic pocket adjacently localized to this ligand-binding site and formed from a secondary non repetitive structure of β-bulge. A dimeric model of ConM reveals that lectin insecticidal activity is related to conformational changes of Gln132, resulting in GABA release without quaternary structure change. Hence, the presented results might contribute to greater understanding of lectins interactions with different chemical ligands, helping their application as biotechnological tools. / Plantas são organismos sésseis que encontram-se susceptíveis a estresses bióticos e abióticos. O ataque de insetos herbívoros é um fator que afeta sua sobrevivência e seu desenvolvimento. Como defesa, estes organismos são capazes de produzir e liberar compostos químicos, como aminoácidos não proteicos, que interferem no desenvolvimento dos insetos agressores, e utilizam fitohormônios para regular suas respostas de defesa. No presente trabalho, buscamos entender o papel inseticida da ConM, uma lectina isolada de sementes do feijão-de-praia (Canavalia maritima Aub.), a partir da análise de sua estrutura tridimensional em complexo com o aminoácido não proteico GABA (ácidogama-aminobutírico) e com a base nitrogenada adenina, precursora das citocininas, fitohormônios envolvidos com processos de defesa contra insetos herbívoros. Para tanto, resolvemos a estrutura cristalográfica da ConM co-cristalizada com o GABA e soaked com a adenina 5mM. O modelo monomérico da lectina mostrou que o GABA encontra-se coordenado por interações com resíduos de aminoácidos previamente reportados como sendo participantes da estabilização do ácido alfaaminobutírico (Abu). A adenina, por outro lado, é estabilizada por interações com resíduos constituintes do domínio de reconhecimento a carboidrato da ConM, o que pode ser explicado pela presença de uma região hidrofóbica adjacente a este sítio, formada por uma estrutura secundária não repetitiva do tipo β-bulge. Um modelo dimérico da ConM revela que a atividade inseticida de lectinas está relacionada com mudanças conformacionais da Gln132, permitindo que o GABA seja liberado sem alteração da estrutura quaternária. Assim, os resultados aqui apresentados podem contribuir para um maior entendimento acerca da capacidade de interação de lectinas vegetais com diferentes tipos de ligantes, facilitando sua utilização como ferramenta biotecnológica.

Foram determinadas as estruturas de dois compostos naturais, um fosfato sintético, um complexo de cobre e refinada a estrutura de outro complexo de cobre. As intensidades das reflexões foram medidas com um difratômetro automático CAD-4. As estruturas foram resolvidas por métodos diretos com MULTAN-80 ou pela função de Patterson e refinadas por míninos quadrados com matriz completa. Neste trabalho apresenta-se um capítulo sobre métodos direto. Epiheineanina, C21H26N2 . C3H6 O, é um alcalóide extraído de Peschiera affinis, pertence ao sistema ortorrômbico, P212121, a= 8,626 (1), b=13,490 (4), c=19,181(3) &#197 Z= 4, do(flot)= 1,16 (1) Mg.m-3 dc=1,22 Mg.m-3, V=2232 (1) &#1973. O empacotamento molecular é constituído por tiras de moléculas interligadas por pontes de hidrogênio entre N(1) de uma molécula e 0(1) de outra relacionada com a primeira através de uma translação em Z, atuando N(1) como doador.Uma segunda ponte de hidrogênio de uma molécula de acetona presente como resultado do processo de cristalização. Acetonídeo do ácido rotúndico, C33H52O5.C6H6, foi obtido a partir do extrato etanólico de Guettarda angelica, é ortorrômbico, P212121, a= 11,353 (2), b=13,111 (4), c=24,049 (3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,05 Mg.m-3, dc= 1,12 Mg.m-3, V= 3580 (2) &#1973. A estrutura é constituída de 6 anéis hexagonais, com quatro em conformação de cadeira, um em meio bote e o último entre cadeira e meio bote, apresentando-se distorcido. O empacotamento é constituído por moléculas inter-ligadas por pontes de hidrogênio. Fosfato ácido de ferro tetra-hidratado, Fe2+Fe3+2 (HPO4)4. 4H2O, foi obtido por síntese hidrotérmica, é monoclínico, P21/n, &#914= 90,84(1) 0,a= 5,152 (1)0, b= 16,629 (2)0, c= 8,749(1) &#197, Z=2 fórmulas/cela, do (flot)= 2,7(1) Mg.m-3, dc=2,76 Mg.m-3, V= 749,5 (5) &#1973. Íon Fe2+ em posição especial e Íon Fe3+ ocupando posição geral, são octaedricamente coordenados por ligantes água e oxigênios dos (HPO4)&#8254 e (PO4)2-, formando um arranjo de poliedros acoplados entre si pelos vértices. As águas e os OH&#8254 participam de pontes de hidrogênio. Tetraclorocuprato de bis-ll amino undecanóico (CuCl4)2-(NH+3 - (CH2)10 - COOH) 2, foi derivado a partir do ácidoll-amino undecacóico, é triclínico, p&#8254l&#8254, a= 7,237(l), b=7,536(1), c=27,605(1) &#197, &#945= 97,98(8) o, &#946= 92,45(8) o, &#978= 90,02(8) o, Z=2, d=o= 1,35 Mg.m-3, dc= Mg.m-3, V= 1489(l) &#1973. Os dois Cu2+ em posição especial são octaedricamente coordenadas por ligantes Cl&#8254. Os octaedros, com coordenação (4+2) e (6) compartilham vértices e estão arranjados no plano da face C. Duas cadeias de aminoácidos estendem-se aproximadamente nos planos (100) e (200), dimerizadas através de suas carboxilas em torno dos centros de simetria ½, ½, ½ e 0, 0, ½. Três carbonos de uma das cadeias apresentam-se desordenados. Os carbonos e nitrogênio terminais das cadeias estão fora do plano médio das respectivas cadeias. Sulfato de cobre de bis-ll amino undecanóico TR-hidratado, [Cu(NH+ - CH2)10) COO&#8254)2] SO4.3H2O, foi derivado a partir do ácido ll-amino undecanóico, é triclínico, Pl&#8254, a=7,745(2), b=9,535 (4), c=20,343 (5) &#197, &#945= 80,91 (3)o, &#946= 79,28 (2)o, &#978= 87,58(3)o, Z=2, do(flot)= 1,38 (2) Mg.m-3, dc= 1,40 (1) Mg.m-3, V= 1460(1) &#1973. O sulfato tem coordenação tetraédrica e o Cu+2 octaédrica distorcida (4+1+1), com distâncias Cu-O longas de 2,238 e 2,785 &#197. Todos os nitrogênios e as águas participam extensivamente de pontes de hidrogênio. O conjunto de tetraedros e octaedros dispõem-se em torno no plano (0 0 1). / The structure of two natural compounds, a synthetic phosphate and a cooper complex were determined and the structure of another copper complex was refined. The reflection intensities were measured with a CAD-4 automatic diffractometer. The structures were solved by direct methods using either MULTAN-80 or the Patterson function and were refined by the least squares method, with a full matrix. Epiheyneanine, C21H26N2O3 . C3H6 O, is a alcaloid extracted from Peschiera affinis, belongs to the orthorhombic system, P212121, a= 8,626 (1), b=13,490 (4), c=19,181(3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,16 (1) Mg.m-3 dc=1,22 Mg.m-3, v= 2232 (1) &#1973. The molecular packing is in strips which are interlinked by hydrogen bonds between the N(1) atom of one molecule and O(1) of another which is translated along the X axis, with the nitrogen acting as the donor. A second hydrogen bond occurs between the O(1) of the first molecule and the oxigena tom of an acetone molecule present as a result of the crystallization process. Acetonide of rotundic acid, 33H52O5.C6H6, was extracted from Guettarda angélica in ethanol, is orthombic, P212121, a= 11,353 (2), b=13,111 (4), c=24,049 (3) &#197, Z= 4, do(flot)= 1,05 Mg.m-3, dc= 1,12 Mg.m-3, V= 3580 (2) &#1973. The structure consists of six hexagonal rings, with four of them in a chair conformation, one in a half boat conformation and the last is between a chair and a half conformation that is distorced. The molecular packing consists of molecules interlinked by hydrogen bonds. Tetra-hydrated iron phosphate acid, Fe2+Fe3+2+ (HPO4)4. 4H2O, was obtained by hydrothermal synthesis, is monoclinic, P21/n, &#914= 90,84(1) 0,a= 5,152 (1)0, b= 16,629 (2)0, c= 8,749(1) &#197, Z=2 fórmulas/cela, do (flot)= 2,7(1) Mg.m-3, dc=2,76 Mg.m-3, V= 749,5 (5) &#1973. The Fe2+ íon is in a special position and the Fe3+ion is in a general position, both are octahedricaly coorfinated by water and the oxygen of the (HPO4) and (PO4)2-, forming a net of polyhedral joined at the vertices. The water molecules and the OH&#8254 ions participate in the hydrogen bonds. Bis-ll amino undecanoic chlorocuprate, (CuCl4)2-(NH+3 - (CH2)10 - COOH) 2, was obtained from the ll-amino undecanoic acid, is triclinic, p&#8254l&#8254, a= 7,237(l), b=7,536(1), c=27,605(1) &#197, &#945= 97,98(8) o, &#946= 92,45(8) o, &#978= 90,02(8) o, Z=2, d=o= 1,35 Mg.m-3, dc= Mg.m-3, V= 1489(l) &#1973. The two Cu2+ ions in special position are octahedrical co-ordinated by Cl&#8254. The octahedral, with (4+2) and (6) co-ordination , share vertices and are distributed in the C face plane. Two aminoacid chains are stretched along the (1 0 0 ) and the (2 0 0 ) planes, dimerized through their carboxyl groups around the symmetry centers ½, ½, ½ and 0, 0, ½. Three carbons of one of the chains are disordered. The terminal carbons and nitrogen chains are out of the mean plane of their respective chains. Bis-ll amino undecanoic Cu(II) sulphate tri-hydrate, [Cu(NH+3.(CH2)10) COO&#8254)2] SO4.3H2O, was derived from the ll-amino undecanoic acid, is triclinic, Pl&#8254, a=7,745(2), b=9,535 (4), c=20,343 (5) &#197, &#945= 80,91 (3)o, &#946= 79,28 (2)o, &#978= 87,58(3)o, Z=2, do(flot)= 1,38 (2) Mg.m-3, dc= 1,40 (1) Mg.m-3, V= 1460(1) &#1973. The sulphate has tetrahedral co-ordination and the Cu2+ ion has distorted (4 + 1 + 1) co-ordination with Cu-O long distances of 2,238 and 2,785 &#197. All the nitrogen atoms and water molecules participate extensively in the hydrogen bonds. The tetrahedral and the octahedral groups are located around the (0 0 1) plane

Foram determinadas as estruturas cristalinas e moleculares, por método de difração de raios-X de monocristais, da série de quatro complexos de cloreto de Cobalto (II) com tri-benzilfosfinóxido, dibenzilfenilfosfinóxido, benzildifenilfosfinóxido e trifenilfosfinóxido. Os dados cristalinos sao: Dicloro bis(tribenzilfosfinóxido) Cobalto(II), CoCl2.2tbpo, COCl2&#8204(C7H7)3PO&#8204 2; sistema cristalino: ortorrômbico; grupo espacial: P212121; a = 15,133(1), b = 15,905(1), c = 16,493(1)&#197, V = 3954 ޵ dc = 1,289(2) g.cm-3; do = 1,29(1) g.cm-3. Dicloro bis(dibenzilfosfinóxido) Cobalto(II), CoCl2.2dbfpo, CoCl2 &#8204(C7H7)2(C6H5)PO&#8204 2; sistema cristalino: monoclínico; grupo espacial: c2/c; a = 18,187(9), b = 10,998(7), c = 18,954(3) &#197, &#946 = 96,12#176(4), V = 3769޵ dc = 1,314 (3) g.cm-3, do = 1,33(1) g.cm-3. Dicloro bis(benzilfosfinóxido) Cobalto(II), CoCl2.2dbfpo, CoCl2 &#8204(C7H7)2(C6H5)PO&#8204 2; sistema cristalino: monoclínico; grupo espacial: p21/c; a = 10,217(2), b = 16,776(2), c = 21,920(3)&#197, = 112,15&#176(3), V = 3494 ޵ dc = 1,364(3) g.cm-3; do = 1,37(1) g.cm-3. Dicloro bis(trifenilfosfinóxido) Cobalto(II), CoCl2.2tbpo, CoCl2&#8204(C6H5)3PO&#8204 2; sistema cristalino: ortorrômbico; grupo espacial: Fdd2; a = 20,73092), b = 32,947(6), c = 9,761(2) &#197, V = 6666 &#1973, dc = 1,368(1) g.cm-3; do = 1,37(1) g.cm-3. As intensidades das reflexões foram medidas por difratometria automática. As estruturas foram resolvidas pelo método direto e refinadas por mínimos quadrados com matriz completa. As distâncias e ângulos mais relevantes para os quatro compostos são dadas na ordem CoCl2.2dbfpo; CoCl2.bdfpo, CoCl22tfpo, para Co-O: 1,937(7) e 1,920(6); 1,974(3), 1, 974(3) e 1,977(3); 1,940(10)&#197, para Co-Cl: 2,255(3) e 2,249(3); 2,249(2); 2,243(2) e 2,249(2); 2,243(4)&#197, para O-P: 1,505(7) e 1,547(7); 1,529(4); 1,513(4) e 1,501(4), 1,505(10)&#197, para Cl-Co-Cl: 113,01(14)° 120,5(1)V; 121,78(7)° 111,55(28)&#176, para O-Co-O: 104,98(30)° 103,7(2)° 100,04(16)° 100,25(67)&#176, para Co-O-P: 153,0(8)&#176 e 176,0(8)° 135,2(2)° 140,80(26)&#176 e 136,43(24)° 155,21(73)&#176. Nas quatro estruturas o Cobalto (II) apresenta-se tetraedricamente coordenado. Uma comparação dos parâmetros moleculares destas quatro estruturas entre si e com dados da literatura permite concluir que o Cobalto (II) exerce predominantemente um efeito de orientação dos ligantes orgânicos. A estrutura molecular dos complexos CoCl2.2bdfpo e CoCl2.2tfpo possui eixo 2 de simetria enquanto que nos 2.2bdfpo e CoCl2.2tbpo a coordenação em torno do Cobalto (II) é suficientemente distorcida para que essa simetria seja perdida. Isto permite explicar os espectros de I.V. destes complexos no que tange ao desdobramento das respectivas freqüências de estiramento da ligação P-O. Em todos os complexos o empacotamento cristalino consiste de um arranjo discreto das moléculas. / The crystal and molecular strctures of a series of four complexes of Cobalt (II) Chloride with tribenzylphosphine oxide and triphenylphosphine oxide, benzyldiphenylphosphine oxide and triphenylphosphine oxide were determined by single crystal X-ray diffraction. The crystal data are: Bis (tribenzylphosphine oxide) dichloro Cobalt(II), CoCl2.2tbpo, COCl2&#8204(C7H7)3PO&#8204 2; crystal system: orthorrombic; space group: P212121; a = 15,133(1), b = 15,905(1), c = 16,493(1)&#197, V = 3954 ޵ dc = 1,289(2) g.cm-3; do = 1,29(1) g.cm-3. Bis (dibenzylphosphine oxide) dichloro Cobalt(II), CoCl2.2dbfpo, CoCl2 &#8204(C7H7)2C6H5)PO&#8204 2; crystal system: monoclinic; space group: c2/c; a = 18,187(9), b = 10,998(7), c = 18,954(3) &#197, &#946 = 96,12#176(4), V = 3769޵ dc = 1,314 (3) g.cm-3, do = 1,33(1) g.cm-3. Bis (benzylphosphine oxide) dichloro Cobalt(II), CoCl2.2dbfpo, CoCl2 &#8204(C7H7)2(C6H5)PO&#8204 2; crystal system: monoclinic; space group: p21/c; a = 10,217(2), b = 16,776(2), c = 21,920(3)&#197, = 112,15&#176(3), V = 3494 ޵ dc = 1,364(3) g.cm-3; do = 1,37(1) g.cm-3. Bis (triphenylphosphine oxide) dichloro Cobalt(II), CoCl2.2tbpo, CoCl2&#8204(C7H7)3PO&#8204 2; crystal system: orthorrombic; space group: Fdd2; a = 20,73092), b = 32,947(6), c = 9,761(2) &#197, V = 6666 &#1973, dc = 1,368(1) g.cm-3; do = 1,37(1) g.cm-3. The intensities of the reflexion were measured by automatic diffractometry. The structures were solved by Direct Method, and refined by full matrix least-squares. The relevant distances and angles the four compounds are given in order CoCl2.2dbfpo; CoCl2.bdfpo, CoCl22tfpo, for Co-O: 1,937(7) and 1,920(6); 1,974(3), 1, 974(3) e 1,977(3); 1,940(10)&#197, for Co-Cl: 2,255(3) e 2,249(3); 2,249(2); 2,243(2) and 2,249(2); 2,243(4)&#197, for O-P: 1,505(7) and 1,547(7); 1,529(4); 1,513(4) and 1,501(4), 1,505(10)&#197, for Cl-Co-Cl: 113,01(14)° 120,5(1)V; 121,78(7)° 111,55(28)&#176, for O-Co-O: 104,98(30)° 103,7(2)° 100,04(16)° 100,25(67)&#176, for Co-O-P: 153,0(8)&#176 and 176,0(8)° 135,2(2)° 140,80(26)&#176 and 136,43(24)° 155,21(73)&#176. In the four structures the Cobalt (II) are tetrhaedrically coordinated. A comparison among the molecular parameters of these four structures, and with other data from the literature allows us to conclude that the Cobalt (II) orients the organic ligands. A two fold axis is presented by the molecular structure of the complexes CoCl2.2bdfpo and CoCl2.2tfpo while in CoCl2.2bdfpo and CoCl2.2tbpo the coordination around the Cobalt (II) is so distorced that is symmetry axis is lost. This allows us to explain the i.r. spectra of this complexes in the region associated to the splitting of the P-O stretching band. In all complexes the crystal packing consists of a arrangement of discrete molecules

A determinação de estruturas tridimensionais de quelatos com metais pesados e de alguns potencialmente úteis agentes quelantes, é uma ferramenta muito importante no estudo de complexos que poderão agir como antídotos na intoxicação por ingestão de metais pesados. Um conhecimento detalhado destes complexos é exigido para auxiliar na modelagem de estruturas moleculares e na determinação de procedimentos que sejam mais efetivos na neutralização dos processos, desenvolvidos por indivíduos com intoxicação crônica por metais pesados. Aqui serão reportados os resultados de um estudo sistemático de complexos [TlMe2L], onde L = 2-mercapto-3-piridina ácido carboxílico (I), 6-mercapto-3-piridinametoxicarboxilato (II), 2-mercapto-3-piridina-metoxicarboxilato (III), 6-mercapto-3-piridina-etoxicarboxilato (IV) e 2-mercapto-3-piridina-etoxicarboxilato (V). O estudo dos arranjos supramoleculares destes complexos mostra que, apesar das diferenças na simetria dos grupos espaciais e os substituintes nos ligantes, o empacotamento no cristal são similares. Os complexos formam polimeros infinitos em uma, duas e três dimensões, baseadas em interações TI - S, T1 - N e T1 - O e ligações de hidrogênio. Existem várias formas de correções dos dados de difração de raios X em monocristais. Durante o processamento das intensidades coletadas realizam-se várias correções, tais como de Lorentz, polarização, absorção e eventualmente correção por deterioração da amostra. A correção por absorção é fortemente recomendada para cristais que possuem fortes absorvedores em sua forma estrutural. Foram estudados os efeitos da absorção dos raios X em amostras cristalinas e uma comparação dos resultados obtidos ao aplicar os diferentes métodos de correções por absorção disponíveis. Constatou-se que após serem realizados diferentes formas de correção por absorção, houve diferenças significativas nas figuras de mérito, picos e vales de densidade de carga residual e parâmetros de deslocamentos anisotrópicos. Já nos ângulos e distâncias de ligações não foram observados mudanças significativas. / The determination of the three-dimensional structures of heavy-metal chelates and of some potentially useful chelating agents is a very important to01 in the study of complexes that may act as antidotes against poisoning by ingestion of heavy metals. A detailed knowledge of these complexes is expected to assist in the design of molecular structures and procedures that are more effective in counteracting the life threatening processes inevitably developed by individuals with chronic heavy-metal intoxication. Within this framework a series of dimethylthallium(III) complexes were studied. Here we present complexes of the type [TlMe2L], where L=2-mercapto-3- pyridine carboxylic acid(I), 6-mercapto-3-pyridine-methoxycarboxylate(II), 2-mercapto-3-pyridine-methoxycarboxylate(III), 6-mercapto-3-pyridineethoxycarboxylate(IV) and 2-mercapto-3-pyridine-ethoxycarboxylate(V). The study of the supramolecular arrangement of these complexes shows that, in spite of the differences in space group symmetry and substituents in the ligand, the crystals packing are remarkably similar. The complexes form infinite polymers in one, two and three dimensions, based upon TI-S, T1-0 e T1-N covalent bonds and intermolecular secondary interactions. The complexes also present strong hydrogen bond intermolecular interactions. There are many forms of corrections to the data collected in a single crystal X-ray diffration experiment. During the data reduction many corrections take place, such as: Lorentz, polarization, absorption and eventualy corrections for the deterioration of the sample. The absorption correction is strongly recommended for crystals with strong absorbers in its structural form. The effect of the absorption of the X rays has been studied in crystalline samples, as well as a comparison between the result obtained from the different available methods of absorption corrections. This work that showed different forms of absorption correction, made significant differences in the merit figures, peak and hole of residual charge density, as well as the anisotropic displacements parameters. Bonds distances and angles, on the other hand, did not change significantly.

O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.

Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pelas Leishmanioses, classificadas como doenças negligenciadas, que causam um risco a 350 milhões de pessoas em todo o mundo. As fumarato hidratases (FHs) são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, apontam essas enzimas como potenciais alvos para o planejamento de compostos com ação tripanossomicida e leishmanicida. O presente trabalho visou à caracterização funcional e estrutural das enzimas fumarato hidratase de Leishmania major através da determinação da estrutura por técnicas de difração de raios-X em monocristais, aliadas a técnicas espectroscópicas, de mutagênese sítio dirigida e simulação de dinâmica molecular. A susceptibilidade dessa classe de enzimas ao oxigênio devido a presença de um complexo do tipo [4Fe-4S] exigiu a utilização de técnicas modernas para a realização dos experimentos em condição de anaerobiose. A estrutura da isoforma citosólica da FH em L. major (LmFH-2) foi determinada por técnicas de difração de raios-X em monocristais e consiste na primeira estrutura de uma proteína da classe I das FHs a ser determinada. O enovelamento de LmFH-2 foi descrito como novo e consiste em uma proteína dimérica na qual cada monômero apresenta dois domínios denominados domínios N- e C- terminais, que possuem grande mobilidade entre si. A análise das estruturas cristalográficas de LmFH-2 em complexo com o substrato malato e os inibidores malonato e succinato, associada aos estudos de dinâmica molecular, nos permitiu propor que a mobilidade entre os domínios está associada à entrada do substrato no sítio ativo. Os dados estruturais corroborados pelos dados espectroscópicos e bioquímicos foram utilizados para mapear o sítio ativo e construirmos um modelo para descrever o mecanismo de ação enzimática adotado por essa classe de enzimas. Na tentativa de dar ínicio à validação do nosso modelo, o resíduo conservado Thr467, pertencente ao sítio ativo da LmFH-2 e identificado como importante na interação com o substrato, teve seu papel catalítico avaliado através da combinação de técnicas de mutação sítio-dirigida associada a estudos cinéticos e estruturais. A perda significativa na atividade da proteína mutante LmFH-2-T467A fortaleceu nossas hipóteses de que a Thr467 poderia atuar como ácido ou base no mecanismo RESUMO | II de ação das FHs da classe I. Os resultados obtidos nesse trabalho nos fornecerão as bases estruturais para o mapeamento acerca do mecanismo catalítico adotado pelas enzimas fumarato hidratase da classe I, assim como, para o planejamento de ligantes específicos como uma importante ferramenta na avaliação do potencial desta classe de enzimas como alvo para o desenvolvimento de novas terapias contra a Leishmaniose. / Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, classified as neglected tropical diseases, with 350 million people at risk of infection. Fumarate hydratases (FH) are enzymes that catalyze the stereospecific reversible hydratation of fumarate to S-malate and recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes are essential for the parasite survival and should be exploited as potential targets for the development of new therapies against trypanosomatid related diseases. The present work focused the functional and structural characterization of both fumarate hydratase enzymes from Leishmania major by a combination of crystallographic, spectroscopic, site-direct mutagenesis and molecular dynamics techniques. The susceptibility to oxygen observed for this class of proteins due to the presence of a [4Fe-4S] cluster required the use of state-of-art infrastructure to perform the experiments under anaerobic environment. The structure of LmFH-2 has been determined by X-ray diffraction techniques and consists of the first class I FH structure to be reported. LmFH-2 folding has been found to be unique and consists of a dimer with each monomer composed of two major domains named N- and C-terminal domains. The analysis of the crystallographic structure of LmFH-2 in complex with the substrate malate and with both inhibitors malonate and succinate has allowed us to propose that the movement observed between both N- and C-domains is associated to the entrance of the substrate into the active site. The structural data corroborated with biochemical and spectroscopic studies have been used to map the active site and to build a model to describe the mechanism of action adopted by this class of enzymes. As our first attempt to validate our model, the residue Thr467 that belongs to the active site and has been identified as important in the interaction with the substrate, had its catalytic role evaluated by site-direct mutagenesis in combination with kinetic and structural studies. The significant loss in activity observed for the mutant LmFH-2-T467A supports our hypothesis that Thr467 can act as either acid or base during catalysis. Our results have provided the structural basis for the complete mapping of the catalytic mechanism adopted by fumarate hydratase enzymes, as well as for the design of specific ligands as an important tool for evaluating FHs as drug targets in development of new therapies against Leishmaniasis.