Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La apoptosis o muerte celular programada es la eliminación de células que ya no son necesarias o que están dañadas genéticamente. Es controlada por una variedad de genes, muchos de los cuales presentan mutación y/o disfuncionalidad en su regulación, asociada a cáncer. Cuando esto ocurre, los pacientes presentan tumores más agresivos. La medición morfológica cuantitativa del índice apoptótico, especialmente por microscopía de luz, es difícil ya que los cambios celulares asociados son de corta duración. En la apoptosis ocurre fragmentación del ADN, la que puede ser detectada y marcada enzimáticamente mediante la técnica denominada TUNEL (terminal transferense mediaded dUTP-biotin nick end labelling). Permite detectar estados tempranos de apoptosis, incluso antes que el núcleo experimente los primeros cambios morfológicos. El Tumor Venéreo Transmisible (T.V.T), se caracteriza por presentar una fase de crecimiento progresivo muy acelerado con gran destrucción tisular local. Sin embargo, el tratamiento con sulfato de Vincristina, a diferencia de lo que ocurre en otras neoplasias, induce la regresión de la masa tumoral hasta su completa desaparición En este trabajo se seleccionaron 10 caninos adultos con TVT de ubicación genital en fase progresiva de crecimiento para inducirles regresión tumoral con Sulfato de Vincristina en dosis única de 0.03mg/Kg. Se obtuvieron muestras histológicas para estudiar el comportamiento apoptótico del tumor después del tratamiento, mediante la técnica de inmunotinción TUNEL. Se digitalizaron imágenes que fueron analizadas con un software morfométrico (Image Pro-Plus, Media Cybernetics, USA). Se observó una intensa inmunomarcación para apoptosis en tejidos de TVT en fase regresiva, involucrando muchas células que no presentaban aún cambios morfológicos asociados a apoptosis, contrastando con una inmunomarcación ocasional, de células aisladas, en la fase progresiva de crecimiento. El área promedio de células apoptóticas fue de 51.3±37.9m2 y 1396±828.6m2, por campo de 200X, para fase progresiva y regresiva, respectivamente, indicando una diferencia significativa entre ambas fases (p<0.0001). El tipo celular principal dentro de la población apoptótica, en ambas fases, correspondió a células tumorales con un 80.7% para fase progresiva y 89.4% para fase regresiva. Mientras, que los linfocitos representaban un 16.1% y 8.4%, en las fase progresiva y regresiva, respectivamente. Las epiteliales constituían sólo un 3.2% en fase progresiva y 2.2% en fase regresiva. Dentro de la población apoptótica, las células de T.V.T. mostraron un aumento significativo en fase regresiva (p<0.001). Los linfocitos disminuyeron en forma significativa en regresión (p<0.001). En cambio, la disminución registrada en las células epiteliales en fase regresiva no fue estadísticamente significativa (p ≥0.05). Este estudio indica que la Vincristina induce regresión en T.V.T. a través de apoptosis, llevando al colapso de la masa tumoral. El mecanismo por el cual la Vincristina induciría apoptosis en T.V.T. permanece aún por aclarar, sin embargo se ha demostrado, en otras neoplasias, activación de caspasas 9 y 3, sugiriendo que este tratamiento induce apoptosis por la vía mitocondrial, involucrando mecanismos asociados a la generación de radicales derivados del oxígeno y sobre expresión de gen Bcl-2

Se pone a punto y optimiza en legumbres, un método in vitro de estimación de la biodisponibilidad mineral, que incluye una digestión gastrointestinal simulada e incorpora un cultivo celular (células Caco-2) para evaluar la captación y el transporte de calcio, hierro y cinc. Este sistema se aplica a alubias, garbanzos y lentejas (producto crudo y sometido a cocción).Se caracteriza la línea celular Caco-2 como modelo de captación y/o transporte mineral. Para evaluar el estado del cultivo celular los parámetros utilizados son: curvas de crecimiento, formación y tamaño de domas, contenidos de proteínas totales y del borde en cepillo, y actividades de la fosfatasa alcalina y de la sacarasa-isomaltasa. Para evaluar la integridad de la monocapa celular, se utiliza la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y el transporte de rojo fenol del compartimento apical al basal. El efecto de la cocción sobre la captación del calcio, hierro y cinc depende de la legumbre considerada. En alubias la cocción tradicional aumenta los porcentajes de captación con respecto al producto crudo, siendo para el Ca: 21.87 y 0.57 % respectivamente, Fe: 29.37 y 1.66 %, y Zn: 15.51 y 2.12 % respectivamente para producto crudo y cocido. En garbanzos se observa el efecto contrario, los mayores porcentajes de captación corresponden a producto crudo (Ca: 8.45 %, Fe: 1.83 % y Zn: 5.81 % ) frente al cocido (Ca: 2.76 %, Fe: 1.42 % y Zn: 2.75 % ). En lentejas destaca la elevada captación de hierro de las sometidas a cocción industrial (11.12 %), frente a producto crudo (12.42 %) y cocción tradicional (no detectable). En las legumbres crudas el orden en el transporte mineral depende de la legumbre considerada. En alubias y lentejas el elemento con mayor porcentaje de transporte es el hierro (16.30 y 42.60 % respectivamente), mientras que en garbanzos los tres elementos presentan porcentajes similares (del orden del 20%). Cuando las lentejas se someten a cocción tradicional e industrial se observa que no se detecta hierro transportado. Para Ca y Zn los porcentajes de transporte obtenidos son de 10.1 y 12.4 % (producto crudo), 8.0 y 14.2 % (cocción tradicional), 17.0 y 13.0 % (cocción industrial) respectivamente. / An in vitro method useful to estimate mineral bioavailability in legumes was set up and validated. The method include a gastrointestinal digestion and a cell culture (Caco-2 cells) to evaluate the uptake and transport of calcium, iron and zinc. It has been applied applied to beans, chickpeas and lentils (raw and cooked products).The Caco- 2 cell line was characterized as a model for mineral uptake and/or transport. To evaluate the cell culture state the following parameters were used: growing curves, dome formation and size, total and brush border protein content, and alkaline phosphatase and sucrase-isomaltase activities. To evaluate the cell monolayer integrity the values of transepithelial electrical resistance (TEER) and red phenol transport from the apical to the basolateral compartment were used.The cooking effect on calcium, iron and zinc uptake depends on the type of legume. In beans traditional cooking increase uptake percentages when compared to raw product, these were for Ca 21,87 and 0.57 %, Fe 29.37 and 1.66 % and Zn 15.51 and 2.12 %, for cooked and raw product, respectively. In chickpeas the contrary effect was found the higher uptake percentages correspond to raw product, Ca: 8.45 and 2.76 %, Fe: 1.83 and 1.42 % and Zn: 5.81 and 2.75 %, for raw and cooked product, respectively. Finally, in lentils the high iron uptake of ready-to-eat lentils (11.12 %) when compare to raw product (12.42 %) stand out.In raw products, the mineral classification according to the value of mineral transport depended on the legume. In beans and lentils the higher transport percentage corresponded to iron, with values of 16.3 and 42.6 %, respectively, whereas in chickpeas similar transport percentages (20 %) were found for the three elements. In lentils traditionally or industrially cooked no transported iron was detected, while the following values were found for Ca and Zn: raw products (10.10 and 12.40 %), traditionally cooked products (8 and 14,20 %) and ready-to-eat products 17 and 13 %.

En aquest estudi, la toxicitat de diversos metalls pesants i l'arsènic va ser analitzada utilitzant diferents models biològics.En la primera part d'aquest treball, el bioassaig de toxicitat Microtox, el qual està basat en la variació de l'emissió lumínica del bacteri luminiscent Vibrio fischeri, va ser utilitzat per establir les corbes dosi-resposta de diferents elements tòxics com el Zn(II), Pb(II), Cu(II), Hg(II), Ag(I), Co(II), Cd(II), Cr(VI), As(V) i As(III) en solucions aquoses. Els experiments es varen portar a terme a pH 6.0 i 7.0 per tal de mostrar que el pH pot influir en la toxicitat final mesurada d'alguns metalls degut als canvis relacionats amb la seva especiació química. Es varen trobar diferents tipus de corbes dosi-resposta depenent del metall analitzat i el pH del medi. En el cas de l'arsènic, l'efecte del pH en la toxicitat de l'arsenat i l'arsenit es va investigar utilitzant l'assaig Microtox en un rang de pHs comprès entre pH 5.0 i 9.0. Els valors d'EC50 determinats per l'As(V) disminueixen, reflectint un augment de la toxicitat, a mesura que el pH de la solució augmenta mentre que, en el cas de l'As(III), els valors d'EC50 quasi bé no varien entre pH 6.0 i 8.0 i només disminueixen a pH 9.0. HAsO42- i H2AsO3- es varen definir com les espècies més tòxiques. Així mateix, una anàlisi estadística va revelar un efecte antagònic entre les espècies químiques d'arsenat que es troben conjuntament a pH 6.0 i 7.0.D'altra banda, els resultats de dos mètodes estadístics per predir la toxicitat i les possibles interaccions entre el Co(II), Cd(II), Cu(II), Zn(II) i Pb(II) en mescles binàries equitòxiques es varen comparar amb la toxicitat observada sobre el bacteri Vibrio fischeri. L'efecte combinat d'aquests metalls va resultar ser antagònic per les mescles de Co(II)-Cd(II), Cd(II)-Zn(II), Cd(II)-Pb(II) i Cu(II)-Pb(II), sinèrgic per Co(II)-Cu(II) i Zn(II)-Pb(II) i additiu en els altres casos, revelant un patró complex de possibles interaccions. L'efecte sinèrgic de la combinació Co(II)-Cu(II) i la forta disminució de la toxicitat del Pb(II) quan es troba en presència de Cd(II) hauria de merèixer més atenció quan s'estableixen les normatives de seguretat ambiental.La sensibilitat de l'assaig Microtox també va ser determinada. Els valors d'EC20, els quals representen la toxicitat llindar mesurable, varen ser determinats per cada element individualment i es va veure que augmenten de la següent manera: Pb(II) < Ag(I) < Hg(II) &#61627; Cu(II) < Zn(II) < As(V) < Cd(II) &#61627; Co(II) < As(III) < Cr(VI). Aquests valors es varen comparar amb les concentracions permeses en aigues residuals industrials establertes per la normativa oficial de Catalunya (Espanya). L'assaig Microtox va resultar ser suficientment sensible per detectar els elements assajats respecte a les normes oficials referents al control de la contaminació, excepte en el cas del cadmi, mercuri, arsenat, arsenit i cromat. En la segona part d'aquest treball, com a resultats complementaris dels resultats previs obtinguts utilitzant l'assaig de toxicitat aguda Microtox, els efectes crònics del Cd(II), Cr(VI) i As(V) es varen analitzar sobre la taxa de creixement i la viabilitat en el mateix model biològic. Sorprenentment, aquests productes químics nocius varen resultar ser poc tòxics per aquest bacteri quan es mesura el seu efecte després de temps d'exposició llargs. Tot i això, en el cas del Cr(VI), l'assaig d'inhibició de la viabilitat va resultar ser més sensible que l'assaig de toxicitat aguda Microtox. Així mateix, també va ser possible observar un clar fenomen d'hormesis, especialment en el cas del Cd(II), quan s'utilitza l'assaig d'inhibició de la viabilitat. A més a més, diversos experiments es varen portar a terme per intentar explicar la manca de toxicitat de Cr(VI) mostrada pel bacteri Vibrio fischeri. La resistència mostrada per aquest bacteri podria ser atribuïda a la capacitat d'aquest bacteri de convertir el Cr(VI) a la forma menys tòxica de Cr(III). Es va trobar que aquesta capacitat de reducció depèn de la composició del medi de cultiu, de la concentració inicial de Cr(VI), del temps d'incubació i de la presència d'una font de carboni. En la tercera part d'aquest treball, la línia cel·lular humana HT29 i cultius primaris de cèl·lules sanguínies de Sparus sarba es varen utilitzar in vitro per detectar la toxicitat llindar de metalls mesurant la sobreexpressió de proteines d'estrès. Extractes de fangs precedents de diverses plantes de tractament d'aigues residuals i diferents metalls, individualment o en combinació, es varen analitzar sobre cultius cel·lulars humans per avaluar el seu efecte sobre la taxa de creixement i la capacitat d'induir la síntesi de les proteïnes Hsp72 relacionades amb l'estrès cel·lular. No es varen trobar efectes adversos significatius quan els components s'analitzen individualment. Nogensmenys, quan es troben conjuntament, es produeix un afecte advers sobre tan la taxa de creixement com en l'expressió de proteins d'estrès. D'altra banda, cèl·lules sanguínies procedents de Sparus sarba es varen exposar in vitro a diferents concentracions de cadmi, plom i crom. La proteïna d'estrès HSP70 es va sobreexpressar significativament després de l'exposició a concentracions tan febles com 0.1 &#61549;M. Sota les nostres condicions de treball, no es va evidenciar una sobreexpressió de metal·lotioneïnes. Nogensmenys, les cèl·lules sanguínies de peix varen resultar ser un model biològic interessant per a ser utilitzat en anàlisis de toxicitat. Ambdós models biològics varen resultar ser molt adequats per a detectar acuradament la toxicitat produïda per metalls. En general, l'avaluació de la toxicitat basada en l'anàlisi de la sobreexpressió de proteïnes d'estrès és més sensible que l'avaluació de la toxicitat realitzada a nivell d'organisme.A partir dels resultats obtinguts, podem concloure que una bateria de bioassaigs és realment necessària per avaluar acuradament la toxicitat de metalls ja que existeixen grans variacions entre els valors de toxicitat obtinguts emprant diferents organismes i molts factors ambientals poden influir i modificar els resultats obtinguts. / In this study, the toxicity of some metals and arsenic was investigated using three different biological models. In the first part of this work, the Microtox® bioassay, which is based on variation in light emission by Vibrio fischeri luminescent bacteria, was used to establish dose-response curves for several toxic elements, namely, Zn(II), Pb(II), Cu(II), Hg(II), Ag(I), Co(II), Cd(II), Cr(VI), As(V), and As(III), in aqueous solutions. Experiments were carried out at either pH 6.0 or pH 7.0 to indicate that pH may influence the measured toxicity of some elements due to pH-related changes in their chemical speciation. Different types of dose-response curves were found depending on the analyzed metal and pH. In the case of arsenic, effect of pH on either arsenate or arsenite toxicity, was investigated using the Microtox® bioassay within a 5.0 - 9.0 pH range. EC50 values for As(V) were found to decrease, reflecting an increase in toxicity, as pH became basic, whereas in the case of As(III), EC50 values were almost unchanged within a 6.0 - 8.0 pH range and lowered at pH 9.0 only. HAsO42- and H2AsO3- were found to be the most toxic species. A statistical approach revealed an antagonistic effect between the arsenate chemical species found in combination at pH 6.0 or 7.0.On the other hand, results from two mathematical approaches to predict the toxicity of all the possible binary equitoxic mixtures of Co(II), Cd(II), Cu(II), Zn(II), and Pb(II) were compared to the observed toxicity of these mixtures to Vibrio fischeri bacteria. Combined effect of the metals was found to be antagonistic for Co(II)-Cd(II), Cd(II)-Zn(II), Cd(II)-Pb(II), and Cu(II)-Pb(II), synergistic for Co(II)-Cu(II) and Zn(II)-Pb(II) and merely additive in other cases, revealing a complex pattern of possible interactions. The synergistic effect of the Co(II)-Cu(II) combination and the strong decrease of Pb(II) toxicity when in the presence of Cd(II) should deserve much attention when establishing environmental safety regulations. Microtox bioassay sensitivity was also analyzed. EC20 values, which represent a measurable threshold of toxicity, were determined for each element individually and were found to rank as Pb(II) < Ag(I) < Hg(II) &#61627; Cu(II) < Zn(II) < As(V) < Cd(II) &#61627; Co(II) < As(III) < Cr(VI). These values were compared to the concentration levels allowed in industrial wastewater according to the official regulations in Catalonia (Spain). It appears that the Microtox® test is sensitive enough to detect the tested elements with respect to official regulations dealing with pollution control, with the exception of cadmium, mercury, arsenate, arsenite and chromate.In the second part of this work, as a complement to previous results obtained using the standard Microtox® acute toxicity test, the long-term effects of Cd(II), Cr(VI), and As(V) were studied on growth rate and viability of the same biological model. Surprisingly, these poisonous chemicals were found not to be very toxic to these bacteria when measuring their effect on viability or growth after long periods of exposure. Nevertheless, in the case of Cr(VI), the inhibition viability assay resulted to be more sensitive than the Microtox acute toxicity test was. Interestingly, it was possible to observe a clear hormesis phenomenon, especially for Cd(II), under the conditions of the viability assay. In addition, several experiments were performed as an attempt to explain the lack of Cr(VI) toxicity shown by Vibrio fischeri bacteria. The resistance shown by Vibrio fischeri bacteria could be attributed to the capacity of the bacteria to convert Cr(VI) ions into less toxic Cr(III) ions. This capacity of reduction was found to depend on culture medium composition, initial concentration of chromium, incubation time, and the presence of a carbon source. In the third part of this work, the HT29 human cell line and primary cultures of Sparus sarba blood cells were used in vitro to detect metal toxicity thresholds by measuring the overexpression of stress proteins. Sludge extracts from several wastewater treatment plants and metals, individually or in combination, were tested on human cultured cells for evaluating their ability to affect the growth rate and trigger a synthesis of the stress-related HSP72i proteins. No significant adverse effects were found when given individually. When given in combination, they were however found to affect both cell growth and stress proteins expression. On the other hand, blood cells freshly collected from Sparus sarba were exposed in vitro to different concentrations of cadmium, lead or chromium(VI). HSP70 stress protein was significantly overexpressed after exposure to a metal concentration as low as 0.1 µM. Under our experimental conditions, no overexpression of metallothioneins was evidenced. Nevertheless, fish blood cells appear as an interesting biological model for experimental toxicology.Both biological models were found convenient to detect toxicity produced by metals. In general, evaluation of toxicity based on stress proteins overexpression was found to be more sensitive than evaluation of toxicity performed at the organism level.Based on the results, it can be concluded that a battery of bioassays is necessary to accurately evaluate toxicity of metals since important variations between different organisms can be found and a lot of environmental factors may influence as well as modify the obtained results.