Shiga toxin-producing E. coli (STEC) comprise a group of pathogenic organisms that elaborate a family of protein exotoxins known as Shiga toxins (Stxs). Intestinal infection with these organisms may lead to hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome, a life-threatening condition characterized by thrombocytopenia, non-immune hemolytic anemia, and acute renal failure. Vascular endothelial damage is believed to be a key initiating event in Stx-mediated diseases. At the molecular level, these toxins depurinate human 28S rRNA and inhibit translation. In addition, at concentrations that only minimally affect global protein synthesis, they have been found to alter expression of specific target genes. To better understand the endothelial damage induced by Stx, we investigated the global effects of Stx on endothelial gene expression, and defined a specific group of genes whose expression was altered by the toxin. Of interest, the CXCR4/CXCR7/SDF-1 chemokine pathway, a pathway central to vascular biology, was activated by Stx. In vitro studies demonstrated that Stx enhanced both transcript levels of these molecules, as well as their association with ribosomes. To define the relevance of these findings in vivo, a mouse model was established and key changes were noted in plasma and tissue content of CXCR4/CXCR7/SDF-1 following Stx exposure. Inhibition of CXCR4/SDF-1 interaction decreased indices of endothelial activation and organ injury and improved animal survival. Importantly, in children infected with E. coli O157:H7, plasma SDF-1 levels were significantly elevated in individuals who progressed to hemolytic uremic syndrome. A second pathway critical to endothelial health and function is VEGF signaling. Of interest, our endothelial gene expression analyses revealed changes in this pathway in vitro. VEGF mRNA association with cellular polyribosomes increased following Stx treatment. Further studies in vivo demonstrated decreased cardiac function and blood pressure, and increased vascular permeability in specific tissues. VEGF, an important inducer of vascular permeability, increased in mouse plasma. Additionally, altered mRNA expression was observed in key organs, such as the kidney and heart, following Stx challenge. Inhibition of VEGF significantly improved survival of animals treated with Stx, indicating that VEGF plays a role in Stx-mediated pathogenesis. Moreover, in vitro studies demonstrated that Stx-mediated endothelial permeability was attenuated in the presence of a VEGF inhibitor. Taken together, these data indicate that E. coli-derived Stxs induce pathological changes in two pathways key to vascular biology. These pathways represent novel targets for the development of preventative and therapeutic strategies for complications associated with Shiga toxin-producing E. coli infection.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 2007. / Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Campus access only. Vita. Bibliography: 70-76..

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abstract: Traumatic brain injury (TBI) is a significant public health concern in the U.S., where approximately 1.7 million Americans sustain a TBI annually, an estimated 52,000 of which lead to death. Almost half (43%) of all TBI patients report experiencing long-term cognitive and/or motor dysfunction. These long-term deficits are largely due to the expansive biochemical injury that underlies the mechanical injury traditionally associated with TBI. Despite this, there are currently no clinically available therapies that directly address these underlying pathologies. Preclinical studies have looked at stem cell transplantation as a means to mitigate the effects of the biochemical injury with moderate success; however, transplants suffer very low retention and engraftment rates (2-4%). Therefore, transplants need better tools to dynamically respond to the injury microenvironment. One approach to develop new tools for stem cell transplants may be to look towards the endogenous repair response for inspiration. Specifically, activated cell types surrounding the injury secrete the chemokine stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α), which has been shown to play a critical role in recruiting endogenous neural progenitor/stem cells (NPSCs) to the site of injury. Therefore, it was hypothesized that improving NPSC response to SDF-1α may be a viable mechanism for improving NPSC transplant retention and migration into the surrounding host tissue. To this end, work presented here has 1. identified critical extracellular signals that mediate the NPSC response to SDF-1α, 2. incorporated these findings into the development of a transplantation platform that increases NPSC responsiveness to SDF-1α and 3. observed increased NPSC responsiveness to local exogenous SDF-1α signaling following transplantation within our novel system. Future work will include studies investigating NSPC response to endogenous, injury-induced SDF-1α and the application of this work to understanding differences between stem cell sources and their implications in cell therapies. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Bioengineering 2015

Notre objectif était d’analyser l’implication potentielle des voies associées aux récepteurs de chimiokines CXCR2 et CXCR4 dans le cancer colorectal métastatique au foie. Les niveaux d’expression de CXCR2, CXCR4 et de leurs chimiokines étaient évalués dans les métastases hépatiques de cancers colorectaux dans le but d’étudier leurs corrélations avec la survie globale et la survie sans récidive de patients ayant reçu, ou non, une chimiothérapie néoadjuvante. Des analyses d’expression pour RT-PCR quantitative et immunohistochimie étaient réalisées en utilisant des prélèvements humains de métastases hépatiques de cancers colorectaux. Les niveaux d’expression de CXCR2, CXCR4 et de leurs ligands étaient statistiquement analysés en fonction des traitements par chimiothérapie néoadjuvante administrés ou non, et en fonction du suivi des patients. Des modèles murins de xénogreffes sous-cutanées et orthotopiques intracaecales ont été mis au point et utilisés pour étudier l’expression de CXCR2, CXCR4 et CXCL7 en relation avec le traitement des souris par chimiothérapie.Nous avons montré que la surexpression de CXCR2 et CXCL7 était corrélée à de plus courtes survies globales et sans récidive de nos patients. En analyse multivariée, l’expression de CXCR2 et de CXCL7 étaient des facteurs indépendants de survie globale et sans récidive. La chimiothérapie néoadjuvante augmentait significativement l’expression de CXCR2, et de CXCL7 de façon proche de la significativité. Les résultats de nos modèles murins ont montré une tendance à la surexpression de nos gènes d’intérêts dans les tissus tumoraux des souris traités. En conclusion, ces résultats suggèrent l’implication de la voie de signalisation CXCL7/CXCR2 comme facteur prédictif de mauvais pronostic dans le cancer colorectal métastatique. Les chimiothérapies à base de 5 Fluoro-uracile augmentent l’expression de ces gènes dans les métastases hépatiques, fournissant une explication sur l’agressivité des tumeurs métastatiques en échappement thérapeutique. Un blocage sélectif de l’axe CXCR2/CXL7 pourrait fournir de nouvelles opportunités thérapeutiques. / Our aim was to analyze the potential role of chemokine receptors CXCR2 and CXCR4 signalling pathways in liver metastatic colorectal cancer (CRC) relapse. Expression levels of CXCR2, CXCR4, and their chemokine ligands were evaluated in liver metastases of colorectal cancer in order to study their correlation with overall and disease-free survival of patients having received, or not received, a neoadjuvant chemotherapy regimen.Quantitative RT-PCR and CXCR2 immunohistochemical staining were carried out using human CRC liver metastasis samples. Expression levels of CXCR2, CXCR4, and their ligands were statistically analyzed according to treatment with neoadjuvant chemotherapy and patients ' outcome. Murine models of subcutaneous and orthotopic intracaecal xenografts have been developed and used to study the expression of CXCR2, CXCR4 and CXCL7 in connection with the treatment of mice with chemotherapy.We showed that CXCR2 and CXCL7 overexpression are correlated to patient’s shorter overall and disease-free survival. By multivariate analysis, CXCR2 and CXCL7 expressions are independent factors of overall and disease-free survival. Neoadjuvant chemotherapy increases significantly the expression of CXCR2 and CXCL7 was overexpressed close to significance. Results of our mouse models have shown a trend over-expression of our interest genes in tumor tissues of the treated mice.In conclusion, we show the involvement of CXCL7/CXCR2 signalling pathways as a predictive factor of poor outcome in metastatic CRC. 5-Fluorouracil-based chemotherapy regimens increase the expression of these genes in liver metastasis, providing one explanation for aggressiveness of relapsed drug-resistant tumors. Selective blockage of CXCR2/CXCL7 signalling pathways could provide new potential therapeutic opportunities.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23467号 / 医博第4774号 / 新制||医||1053(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 森信 暁雄, 教授 上野 英樹, 教授 小柳 義夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

In dieser Dissertation wurde die Beziehung zwischen den Chemokinrezeptoren CXCR4, und CXCR7 sowie dem onkofetalen Glykoprotein 5T4 in verschiedenen Tumorzelllinien untersucht.

Les chimiokines sont des petites protéines qui régulent la migration et le "homing" des cellules leucocytaires. Elles jouent également un rôle clef dans le développement de certains cancers en régulant les phénomènes de prolifération, d'angiogenèse ou encore de migration des cellules métastatiques. À ce jour, environs 40 chimiokines et plus de 19 récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été répertoriés. De nombreuses études ont montré que les récepteurs liant les chimiokines pouvaient s'associer sous forme de complexes homo et hétéromériques. Les conséquences fonctionnelles associées à l'hétéromérisation sont diverses et fonction de la nature des récepteurs étudiés, du type de cellules sur lesquelles ces récepteurs sont exprimés et de l'expression relative des récepteurs. Cependant, le rôle physiologique exact de l’hétéromérisation des récepteurs aux chimiokines, et des RCPGs de manière générale, resteencore peu connu. Nous avons tenté de répondre à cette question dans ce travail de doctorat en étudiant plus particulièrement l’hétéromérisation de CXCR4 et CCR7 au cours du développement des lymphocytes B. Nous avons montré que le récepteur CXCR4 est exprimé à la surface des lymphocytes B à tous les stades de leur développement et qu’une diminution de l’expression de CXCR4s’opère lors de la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures. Cette transition s’accompagne d’une «uprégulation » du récepteur CCR7 qui est le plus fortement exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Nous avons par ailleurs montré que la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures s’accompagne d’une forte inhibition de CXCR4, les cellules B matures étant totalement réfractaires à la migration dans un gradient de CXCL12. Cette perte totale de fonctionnalité ne pouvant pas s’expliquer par la diminution partielle de l’expression de CXCR4, nous avons testé si l’expression du récepteur CCR7 pouvait contribuer à la perte de fonction de CXCR4 observée. Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de CXCR4 à induire la chimiotaxie des lymphocytes B matures provenant de souris sauvages ou de souris CCR7KO déficientes pour l’expression de CCR7. Nous avons montré que l’absence de CCR7 permet de récupérer une migration significative des lymphocytes B matures dans un gradient de CXCL12. De manière intéressante, l’absence de CCR7 affecte spécifiquement la fonction de CXCR4 mais pas celle des récepteurs CXCR5 et CCR6 également exprimés à la surface des lymphocytes B matures. De plus, l’inhibition de CCR7 des lymphocytes B matures sauvages par des anticorps bloquant ne permet pas de reproduire l’effet de l’absence de CCR7. Ce résultat suggère que la signalisation du récepteur CCR7 ne serait pas impliquée. Nous avons également montré que l’absence de CCR7 s’accompagne d’un nombre plus important de lymphocytes B matures dans la moelle osseuse des souris CCR7KO, en parfait accord avec le rôle connu de CXCR4 dans la rétention des progéniteurs hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse. Nous avonségalement montré que l’expression du récepteur humain CCR7 dans la lignée lymphocytaire Pré-B humaine Nalm-6 ou dans des cellules CHO-K1 exprimant le récepteur CXCR4 suffit à induire une perte de fonctionnalité de CXCR4. Tout comme pour les lymphocytes B maturesmurins, cette inhibition s’exerce en absence de toute stimulation de CCR7. Nous avons aussi montré que l’expression de récepteurs CCR7 mutants incapables de lier les chimiokines CCL19 et CCL21 (mutant CCR7NT) ou d’induire une signalisation (mutants CCR7D(R/A)Y et CCR7(N/A)PXXY) sont toujours capables d’induire l’inhibition de CXCR4, ce qui confirme qu’une signalisation CCR7 n’est pas nécessaire pour induire le phénomène de la régulation de CXCR4. Ce résultat montre aussi que les fonctions de signalisation et de régulation de CCR7peuvent être découplées.Nous avons également tenté d’identifier le mécanisme moléculaire associé à l’inhibition de CXCR4 par CCR7. Grâce à l’utilisation de biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G, nous avons montré que l’expression de CCR7 inhibe fortement l’activation de la protéine Gαi2 connue pour jouer un rôle important dans la migration des lymphocytes. Ce résultat permet donc d’expliquer la perte de migration détectée dans les lymphocytes B coexprimant CXCR4 et CCR7. Cependant, nous avons aussi montré que l’expression de CCR7 n’empêche pas l’interaction physique de la protéine Gαi2 avec le récepteur CXCR4. Nous avons alors émis l’hypothèse que CCR7 exercerait son effetinhibiteur sur CXCR4 en interagissant physiquement avec lui et en altérant sa capacité à activer la protéine Gαi2. Nous avons montré par différentes techniques que le récepteur CCR7 interagit avec CXCR4 et que la conformation du complexe formé par CXCR4 et la protéineGαi2 est différente suivant que cette interaction a lieu au sein d’un homomère CXCR4/CXCR4 ou d’un hétéromère CXCR4/CCR7. L’ensemble de ces données suggère donc que l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 change la conformation du complexe CXCR4/Gαi2 et la capacité de CXCR4 à activer la protéine Gαi2. De manière intéressante, l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 inhibe également l’activation de la protéine Gαi1 mais pas celle de la protéine Gαi3. Ce résultat très intéressant suggère que l’hétéromérisation CXCR4/CCR7 ne serait pas simplement associée à une inhibition de la fonction de CXCR4 mais plutôt à une modulation de son profil d’activation. Cette hypothèse suggère donc que le récepteur CCR7 jouerait le rôle de modulateur allostérique endogène de CXCR4 capable de moduler l’activation de certaines voies de signalisation tout en en laissant d'autres fonctionnelles. Cependant, le manque de temps ne nous a pas permis de confirmer le maintiend’un signal dépendant de Gαi3 dans les cellules coexprimant CXCR4 et CCR7.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le récepteur aux chimiokines CCR7 exercerait le rôle de modulateur allostérique de CXCR4 au cours du développement des lymphocytes B et que cette fonction nécessiterait l’interaction physique de CXCR4 et CCR7.À notre connaissance, ces résultats constituent la première indication que l’hétéromérisation de récepteurs aux chimiokines peut jouer un rôle dans un processus physiologique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished