Le cycle cellulaire est hautement régulé par la phosphorylation réversible de plusieurs effecteurs. La kinase dépendante des cyclines Cdk1 déclenche la mitose en induisant le bris de l’enveloppe nucléaire, la condensation des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. Chez les animaux métazoaires, ces évènements sont contrés par la protéine phosphatase PP2A-B55, qui déphosphoryle plusieurs substrats de Cdk1. La kinase Greatwall (Gwl) est activée par le complexe cycline B-Cdk1 en début de mitose et induit ensuite l’inhibition de PP2A-B55 via Endos/Arpp19. Toutefois, les mécanismes moléculaires qui régulent Gwl sont encore peu connus. Nous avons montré que Gwl a une activité s’opposant à PP2A-B55, qui collabore avec la kinase Polo pour assurer l’attachement du centrosome au noyau et la progression du cycle cellulaire dans le syncytium de l’embryon de la drosophile. Ensuite, nous avons trouvé dans des cellules de drosophile que Gwl est localisée au noyau pendant l’interphase, mais qu’elle se relocalise au cytoplasme dès la prophase, avant le bris de l’enveloppe nucléaire. Nous avons montré que cette translocation de Gwl est cruciale pour sa fonction et qu’elle dépend de la phosphorylation de plusieurs résidus de la région centrale de Gwl par les kinases Polo et Cdk1. Cette région centrale contient également deux séquences de localisation nucléaire (respectivement NLS1 et NLS2). De plus, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de Gwl par la kinase Polo promeut sa liaison avec la protéine 14-3-3ε, ce qui favorise la rétention cytoplasmique de Gwl. Le rôle de Cdk1 dans cette translocation reste quant à lui inconnu. De plus, nous avons montré que le complexe cycline B-Cdk1 entre dans le noyau avant que Gwl ne soit transportée dans le cytoplasme. Cdk1 pourrait donc activer Gwl et phosphoryler ses substrats nucléaires, à l’abri de PP2A-B55 qui est largement cytoplasmique. Gwl est ensuite exclue du noyau et relocalisée dans le cytoplasme afin d’induire l’inhibition de PP2A-B55. Cela permet de synchroniser les événements de phosphorylation se produisant dans le noyau et dans le cytoplasme. Fait intéressant, un mécanisme de régulation de la localisation de Gwl similaire à cela a été découvert chez l’humain et chez la levure, suggérant que ce mécanisme est conservé entre différentes espèces. / Reversible phosphorylation of proteins, triggered by cyclically activated kinases and phosphatases, is a key mechanism to control cell cycle progression. CyclinB-Cdk1 is a crucial kinase phosphorylating a large number of substrates to trigger mitotic entry. However, in metazoans, it is counteracted mainly by a Protein Phosphatase 2A carrying the B55 regulatory subunit (PP2A-B55). On the other hand, the Greatwall (Gwl) kinase is activated by CyclinB-Cdk1 upon mitotic entry and subsequently induces the inhibition of PP2A-B55 by Endos/Arpp19, thus promoting mitotic entry and maintenance. Nonetheless, the regulatory mechanisms of Gwl are less clear. We demonstrated that in Drosophila syncytial embryos, PP2A-B55 is negatively regulated by Gwl, but collaborates with Polo kinase to ensure both nucleus attachment of centrosome and faithful cell cycle progression. Later, we discovered that in Drosophila, the subcellular localization of Gwl changes dramatically throughout the cell cycle. Gwl is nuclear in interphase but suddenly becomes mostly cytoplasmic in prophase before nuclear envelope breakdown. Such translocation is important for Gwl’s function and requires the phosphorylation of Gwl by both Polo kinase and Cdk1 in the region containing two Nuclear Localization Signals (NLSs). Phosphorylation of Gwl by Polo likely promotes its association with14-3-3ε thereby promoting Gwl cytoplasmic retention, whereas Cdk1’s role in this translocation remains elusive. Moreover, I found that most cyclin B is imported into the nucleus before Gwl translocates to the cytoplasm. Therefore, Cdk1 can activate Gwl and phosphorylate its nuclear substrates without the perturbation of PP2A-B55 which is largely cytoplasmic. Subsequently, Gwl translocates into cytoplasm to mediate the inhibition of PP2A-B55 so that the phosphorylation events can be synchronized between the nucleus and the cytoplasm. Interestingly, similar spatial regulation of Gwl was also uncovered in mammal cells and in yeast, implying a conserved regulatory mechanism across species.

La mitose est une phase importante du cycle cellulaire. Les mécanismes de surveillance s'assurent de l'ordre et de l'exécution correcte des événements du cycle cellulaire dont les erreurs peuvent conduire à l'aneuploïdie. Pendant la mitose, la séparation des chromatides sœurs est régulée par le point de contrôle du fuseau mitotique qui s'assure que tous les chromosomes sont correctement alignés sur la plaque métaphasique. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par l'activation et l'inactivation du complexe cycline B/Cdk1. Cette fine régulation fait intervenir de nombreuses kinases et phosphatases. Dans ce projet nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux AGC kinases : RSK2 et Greatwall (Gwl).Au cours de cette étude nous nous sommes proposés d'analyser l'implication de RSK2, substrat majeur de la MAPK, dans le point de contrôle du fuseau mitotique. Nos résultats montrent que RSK2 est essentielle pour l'activité du point de contrôle du fuseau mitotique dans les extraits d'œufs de xénope ainsi que pour la localisation des autres protéines de ce mécanisme de surveillance localisées aux kinétochores. Nous montrons également que RSK2 participe au point de contrôle dans les cellules humaines. En effet, RSK2 est nécessaire à la localisation aux kinétochores de Mad1, Mad2 et Cenp-E, protéines essentielles à l'activité de ce checkpoint. L'entrée et la sortie de mitose sont régulées par le complexe cycline B/Cdk1 et des phosphatases. Gwl est une nouvelle kinase essentielle à l'entrée en mitose et au maintien de l'état mitotique dans les extraits d'œufs de xénope. En effet, nos résultats montrent que Gwl maintient l'état mitotique indépendamment du complexe cycline B/Cdk1, en régulant négativement PP2A, une phosphatase responsable de la déphoshorylation des substrats mitotiques. / Mitosis is an important phase of cell cycle. The Spindle Assembly Checkpoint (SAC) verifies the orders and the events correct execution of the cell cycle, as errors may lead to aneuploidy. During the mitosis, the checkpoint delays the anaphase onset until all chromosomes are correctly attached to the spindle‘s microtubules. Entry and Exit of mitosis are regulated by the activation and inactivation of cyclin B/Cdk1. A lot of kinases and phosphatases are involved in this fine regulation. In this project, we are particularly focusing on two AGC kinases: RSK2 and Greatwall (Gwl).In this study, we analyzed RSK2, a major substrates of MAPK, involvement in SAC. Our results show that RSK2 is essential to the activation of SAC in xenopus egg extracts and for the localization at the kinétochores of the others SAC components. We also show that RSK2 participate in the maintenance of the SAC in human cells. Indeed, RSK2 is necessary for Mad1, Mad2 and Cenp-E localization, essential proteins for SAC activation.Entry and exit of mitosis are regulated by cyclin B/Cdk1 complex and phosphatases. Gwl is a new kinase essential to the entry into mitosis and maintenance of the mitotic state in xenopus egg extracts. Indeed, our results showed that Gwl maintains the mitotic state independently of cyclin B/Cdk1 but with the negative regulation of PP2A, which dephosphorylate the mitotic substrates

La progression mitotique est principalement régulée par la phosphorylation et la déphosphorylation des protéines. La kinase dépendante des cyclines liée à la cycline B (Cdk1 - cycline B) et d'autres kinases phosphorylent une myriade de protéines pour promouvoir l’entrée à la mitose. Ces phosphorylations sont réversées par les phosphatases lors de la sortie mitotique. La protéine phosphatase 2A avec sa sous-unité régulatrice B55 (PP2A-B55) est une des principales phosphatases neutralisant les phosphorylations par Cdk1. Dans ce projet, nous avons vu que Ankle2 participe à la sortie de la mitose. En utilisant D. melanogaster comme modèle puissant, nous avons observé que Ankle2 est important pour le recrutement des protéines BAF et Lamin associées à l'enveloppe nucléaire (NE) à la télophase, assurant la formation d'un seul noyau. In vivo, nos résultats indiquent que Ankle2 est crucial pour le développement de l'embryon de drosophile, car les embryons ARNi Ankle2 sont arrêtés lors de la première mitose. Pour amorcer l’étude des mécanismes moléculaires par lesquels Ankle2 remplit ces foncions, nous avons identifié ses partenaires d’interactions. Nous avons constaté que Ankle2 est associé à une forme active de PP2A, suggérant Ankle2 comme une sous-unité régulatrice potentielle de PP2A. De plus, Ankle2 forme un complexe avec la cycline B et les Cdks mitotiques, et nos résultats génétiques suggèrent que les deux protéines peuvent avoir des rôles opposés. Nous avons également découvert que Ankle2 interagit avec la protéine du réticulum endoplasmique (ER) Vap33 à travers son motif FFAT. Dans ce projet, nous avons constaté que Ankle2 est une protéine associée au ER chez la drosophile qui est cruciale pour la complétion de la mitose, et que pourrait réguler l'activité des kinases et phosphatases mitotiques. Cette étude servira de base pour déchiffrer les mécanismes moléculaires précis par lesquels Ankle2 favorise la sortie de la mitose. / Protein phosphorylation and dephosphorylation is one of the mechanisms that regulates mitotic progression. Cyclin dependent kinase 1 bound to cyclin B (Cdk1 – cyclin B) and other kinases phosphorylate a myriad of proteins to promote early mitotic events. These phosphorylations are reversed by phosphatases during mitotic exit. The Protein Phosphatase 2A with its regulatory subunit B55 (PP2A-B55) is the major phosphatase counteracting Cdk1 phosphorylations. In this project, we have found that Ankle2 participates in mitotic exit. Using D. melanogaster as a model, we have found that Ankle2 is important for the Nuclear Envelope (NE)-associated proteins BAF and Lamin recruitment at telophase, ensuring the formation of a single nucleus. In vivo, we have found that Ankle2 is crucial for Drosophila embryo development, as RNAi Ankle2 embryos are arrested in the first mitosis. To study the molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit, we identified its interacting partners. We found that Ankle2 is associated with an active form of PP2A, suggesting Ankle2 as a potential regulatory subunit of PP2A. Moreover, Ankle2 engages in a complex with cyclin B and mitotic Cdks, and our genetic results suggest that Ankle2 and mitotic cyclin – Cdk complex may have opposite roles. We have also found that Ankle2 interacts with the Endoplasmic-Reticulum (ER) protein Vap33 through its FFAT motif. In this project, we have found that Ankle2 is an ER-associated protein in Drosophila that is crucial for completion of mitosis, probably regulating the activity of mitotic kinases and phosphatases. This study will serve as a basis to decipher the precise molecular mechanisms by which Ankle2 promotes mitotic exit.