55 Abstract Frequency of selected genetic polymorphisms of cytochrome P450 in the Czech population and the influence of CYP2C9 genotype on the hypolipidemic effect of fluvastatin Introduction: One of the main factors of genetically determined variability in response of humans to administered drugs are differences in catalytic activity of metabolizing enzymes, which are caused mainly by genetic polymorphisms in cytochrom P450 family enzymes. This thesis consists of two parts and it is presented as a commentary to the original papers. The first aim was to investigate the frequency of functionally important variant alleles of three main isoenzymes of cytochrome P450 gene: CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, throughout the Czech population, predict the prevalence of poor metabolizer phenotypes, and then to compare the results to the data from other populations. Secondly, we analysed the correlation between the CYP2C9 genotype and cholesterol-lowering effect of fluvastatin in human hypercholesterolemic patients. Methods: Genotypes were determined by PCR-RFLP. The presence of alleles CYP2D6*1, *6, *5, *4, *3, and gene duplication was analysed in 233 healthy volunteers, CYP2C9*1, *2 and*3 in 254 subjects and CYP2C19*1, *2 and *2 in 218 subjects. Eighty seven patients on fluvastatin therapy, and 48 patients on monotherapy...

Hintergrund: Der Morbus Wilson ist eine seltene, angeborene Störung des Kupferstoffwechsels, bei welcher es zu Akkumulationen von Kupfer und infolgedessen zu Schäden in verschiedenen Organen des menschlichen Körpers kommt. Die Therapie besteht vor allem darin, den Kupferspiegel medikamentös zu senken. In einzelnen Fällen wurde der Kupferspiegel während der Therapie so weit gesenkt, dass bei den Patient*innen neurologische Symptome auftraten (sogenannte Kupfermangel-Myeloneuropathien). Kupfer ist ein essenzieller Kofaktor mehrerer Enzyme im menschlichen Körper, so auch der Cytochrom-c-Oxidase, welche einen wichtigen Bestandteil der mitochondrialen Atmungskette und damit der zellulären Energiegewinnung darstellt. Die Bestimmung ihrer Aktivität ist bisher für verschiedene Zellen und Gewebe etabliert worden, ein standardisierter Assay für die Bestimmung in Thrombozyten existiert jedoch nicht. Fragestellung: Für die optimale Bestimmung der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität in Thrombozyten sollen bereits existierende Methoden angepasst werden. Ziel dieser Arbeit ist es, die Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase bei Morbus Wilson-Patient*innen unter kupfersenkender Therapie zu untersuchen und auf einen Zusammenhang zum Serum-Kupferspiegel zu prüfen. Die Frage, ob eine zu starke Kupfersenkung durch die Therapie des Morbus Wilson zu einer verringerten Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität führt und ob diese Myeloneuropathien hervorruft, soll somit beantwortet werden. Material und Methodik: Es wurden 36 Morbus Wilson-Patient*innen unter kupfersenkender Therapie und 20 gesunde Kontrollproband*innen untersucht. Es erfolgte eine Blutabnahme für die Gewinnung der Thrombozyten sowie für die Bestimmung des Serum-Kupferspiegels. Die Bestimmung der Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase erfolgte spektralphotometrisch in Thrombozyten. Des Weiteren wurde die Aktivität des Komplex-II der Atmungskette bestimmt, da dieser nicht kupferabhängig ist und seine Aktivität daher bei Kupfermangel nicht eingeschränkt sein sollte. Zusätzlich ermöglichte die Berechnung des Quotienten der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und der Komplex-II-Aktivität die Erfassung sehr geringer Aktivitätseinschränkungen der Cytochrom-c-Oxidase. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die spektralphotometrische Messung dieser beiden Enzymaktivitäten in Thrombozyten entwickelt und optimiert. Zur Justierung der Enzymaktivitäten bei unbekannter Mitochondrienmenge diente die Aktivität der ausschließlich in Mitochondrien vorkommenden Citratsynthase. Die so bestimmten Enzymaktivitäten wurden mittels SPSS zwischen Wilson-Patient*innen und Kontrollproband*innen verglichen und untereinander sowie mit dem Serum-Kupferspiegel auf Zusammenhänge untersucht. Ferner wurden die Morbus Wilson-Patient*innen klinisch auf Anzeichen für Myeloneuropathien untersucht, um die Untersuchungsergebnisse anschließend auf einen Zusammenhang zu der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität zu prüfen. Ergebnisse: Der auf den Untersuchungen von Kirby et al. beruhende Assay für die spektralphotometrische Bestimmung der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität in isolierten Mitochondrien konnte durch die Zugabe von 0,3 mM Dodecylmaltosid für die Messung in Thrombozyten erfolgreich optimiert werden. Ebenso wurde der Assay für die Komplex-II-Aktivität durch die Zugabe von 1 mg/ml BSA für die Bestimmung in Thrombozyten erweitert (Kirby et al., 2007). Die Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase der Wilson-Patient*innen war signifikant niedriger als die der Kontrollgruppe, während die Kontrollgruppe eine signifikant höhere Komplex-II-Aktivität aufwies. Der Quotient von Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und Komplex-II-Aktivität war in der Patient*innengruppe folglich ebenfalls signifikant erniedrigt. In der Analyse aller untersuchten Proben zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen Serum-Kupferspiegel und Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität, welcher in der Betrachtung der Subgruppen (Wilson Patient*innen und Kontrollproband*innen) jedoch nicht nachgewiesen werden konnte. Keiner der untersuchten Patient*innen wies klinische Anzeichen für Myeloneuropathien auf. Schlussfolgerung: Der optimierte Assay der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und Komplex-II-Aktivität in Thrombozyten erlaubt die zuverlässige Bestimmung der Atmungskettenaktivität in einem einfach zugänglichen Gewebe und ist damit für vielfältige Fragestellungen einsetzbar, wenn Einflüsse medizinischer Maßnahmen auf die mitochondriale Funktion untersucht werden sollen. Mit 36 Morbus Wilson-Patient*innen umfasst diese Arbeit eine der bisher größten untersuchten Patient*innengruppen dieses seltenen Krankheitsbildes. Der erniedrigte Quotient der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und Komplex-II-Aktivität ist als Bestätigung einer Cytochrom-c-Oxidase-Einschränkung bei Morbus Wilson-Patient*innen unter kupfersenkender Therapie zu werten. Die Korrelation zwischen dem Serum-Kupferspiegel und der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität sowie die Aktivitätsreduktion der Cytochrom-c-Oxidase in der Patient*innengruppe ist eine wichtige Erkenntnis für die zukünftige Überwachung und gegebenenfalls Anpassung der Therapie von Morbus Wilson. Der Zusammenhang zwischen der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität und Myeloneuropathien sollte an Patient*innen mit Myeloneuropathien weiter untersucht werden. Es wurde jedoch gezeigt, dass Kupfermangel und niedrige Cytochrom-c-Oxidase-Aktivitäten nicht unbedingt mit Myeloneuropathien einhergehen. Therapie-induzierte Kupfermangel-Myeloneuropathien gilt es weiterhin zu vermeiden. / Background: Wilson’s disease is a rare, congenital disorder of copper metabolism, which leads to accumulations of copper and consequent damage in various organs of the human body. The therapy consists mainly in lowering the copper level by medication. In individual cases, the copper level was lowered during the therapy to such an extent that the patients developed neurological symptoms (so-called copper deficiency myeloneuropathies). Copper is an essential cofactor of several enzymes in the human body, including cytochrome c oxidase, which is an important component of the mitochondrial respiratory chain and thus of cellular energy production. The determination of its activity has been established so far for various cells and tissues, but a standardized assay for its determination in platelets does not exist. Purpose: For the optimal determination of cytochrome c oxidase activity in platelets, existing methods will be adapted. The aim of this work is to investigate the activity of cytochrome c oxidase in Wilson’s disease patients under copper-lowering therapy and to test for a correlation to serum copper levels. The question of whether excessive copper lowering by Wilson’s disease therapy leads to reduced cytochrome c oxidase activity and whether this possibly causes myeloneuropathies will thus be answered. Material and Methods: 36 Wilson’s disease patients under copper-lowering therapy and 20 healthy control subjects were studied. Blood was drawn for platelet collection and determination of serum copper levels. The activity of cytochrome c oxidase was determined spectrophotometrically in platelets. Furthermore, the activity of complex II of the respiratory chain was determined, since this is not copper-dependent and its activity should therefore not be limited in copper deficiency. In addition, calculation of the quotient of cytochrome c oxidase activity and complex II activity allowed detection of very low activity limitations of cytochrome c oxidase. In this dissertation, the spectrophotometric measurement of these two enzyme activities in platelets was developed and optimized. The activity of citrate synthase, which occurs exclusively in mitochondria, was used to adjust the enzyme activities when amount of mitochondria was unknown. The enzyme activities determined in this way were compared between Wilson’s disease patients and control subjects using SPSS and examined for correlations with each other and with serum copper levels. Furthermore, the Wilson’s disease patients were clinically examined for signs of myeloneuropathies, in order to subsequently examine the examination results for a correlation to the cytochrome c oxidase activity. Results: The assay for spectrophotometric determination of cytochrome c oxidase activity in isolated mitochondria, based on studies of Kirby et al, was successfully optimized for measurement in platelets by the addition of 0.3 mM dodecylmaltoside. Similarly, the assay for complex II activity was enhanced by the addition of 1 mg/ml BSA for determination in platelets (Kirby et al., 2007). The activity of cytochrome c oxidase of Wilson patients was significantly lower than that of the control group, with the control group had a significantly higher complex II activity. Consequently, the quotient of cytochrome c oxidase activity and complex II activity was also significantly lower in the Wilson patient group. A significant correlation between serum copper level and cytochrome c oxidase activity was found in the analysis of all samples examined, which, however, could not be proven in the examination of the subgroups (Wilson patients and control subjects). None of the patients examined showed clinical signs of myeloneuropathies. Conclusion: The optimized assay of cytochrome c oxidase activity and complex II activity in platelets allows reliable determination of respiratory chain activity in an easily accessible tissue and is thus applicable to a variety of questions when influences of medical interventions on mitochondrial function are to be investigated. With 36 Wilson's disease patients, this work includes one of the largest groups of patients of this rare disease studied so far. The decreased quotient of cytochrome c oxidase activity and complex II activity is a confirmation of cytochrome c oxidase impairment in Wilson’s disease patients on copper-lowering therapy. The correlation between serum copper level and cytochrome c oxidase activity as well as the reduction of cytochrome c oxidase activity in the patient group is an important finding for future monitoring and, if necessary, adjustment of Wilson’s disease therapy. The relationship between cytochrome c oxidase activity and myeloneuropathies should be further investigated in patients with myeloneuropathies. However, it has been shown that copper deficiency and low cytochrome c oxidase activities are not necessarily associated with myeloneuropathies. Therapy-induced copper deficiency myeloneuropathies should continue to be avoided.

Die Umwandlung in wasserlösliche Verbindungen, die renal ausgeschieden werden können, ist ein grundlegendes Prinzip im Abbau von Fremdstoffen. Hierbei unterscheidet man Phase-I- und Phase-II-Reaktionen. Die Aktivität vieler Phase-I- und Phase-II-Enzyme ist genetisch beeinflusst und kann starke interindividuelle Unterschiede im Metabolismus von Fremdstoffen verursachen und dadurch das Krebsrisiko und das Risiko für Arzneimittelnebenwirkungen beeinflussen. Die Häufigkeitsverteilungen der Allele der Gene, die Phase-I- und Phase-II-Enzyme kodieren, zeigen eine große interethnische Varianz. Die Polymorphismen dieser Enzyme wurden bisher jedoch noch nicht in der größten slawischen Volksgruppe, der russischen, untersucht. An der vorliegenden Studie nahm eine Gruppe von 325 Personen russischer Abstammung teil - gesunde Probanden bzw. Patienten, die nicht an einer malignen Erkrankung litten. Die Polymorphismen von zwei Enzymen der Phase I, CYP1A1 und CYP2D6, und von einem Enzym der Phase II, NAT2, wurden mittels PCR-RFLP-Genotypisierung und Real-time-PCR-Verfahren komplett untersucht. Die Häufigkeit der CYP1A1 Allele mit hoher Aktivität, CYP1A1*2A und CYP1A1*2B, betrug 4,6% (3,1%-6,5%) bzw. 5,1% (3,5%-7,1%). Die Häufigkeiten der genetischen Varianten von CYP1A1 waren: m1 (3801T>C) - 9,8% (95% Vertrauensbereich, 7,7%-12,4%), m2 (2455A>G) - 5,0% (95% VB, 3,5%-7,1%), m4 (2453C>A) - 2,5% (1,4%-4,0%), m5 (-4335G>A) - 25,8% (22,5%-29,4%), m6 (-3219C>T) - 6,0% (4,3%-8,1%), und m7 (-3229G>A) - 2,9% (1,8%-4,5%). Die Mutation m3, die bisher nur bei Afrikaner gefunden wurde, konnten wir nicht nachweisen. 5,9% (3,5%-9,2%) aller Probanden waren CYP2D6 Langsam-Metabolisierer und 3,4% (1,7%-6,3%) wurden als Ultraschnell-Metabolisierer identifiziert (CYP2D6*1x1/*1). Bei der Genotypisierung von acht verschiedenen Punktmutationen im NAT2-Gen ergab sich für 59,7% (54,1%-65,1%) der Studienteilnehmer ein Genotyp, der mit einer Langsam-Acetylierer-Status einhergeht. 34,7% (29,6%-40,2%) der Probanden hatten ein und 5,6% (3,3%-8,6%) zwei für die Schnellacetylierung kodierende Allele. Die Allelverteilung der für die wichtigsten Enzyme im Arzneimittelstoffwechsel kodierenden Gene ist bei Russen ähnlich wie bei anderen Kaukasiern. Es kann deshalb erwartet werden, dass die genetisch-bedingten Unterschiede in der Wirksamkeit und im Auftreten von Arzneimittelnebenwirkungen in der russischen Bevölkerung vergleichbar sind mit denen in anderen europäischen Populationen. / The basic principle of drug and xenobiotic metabolism in the body is to make them more water soluble and thus more readily excreted in the urine. Genetic polymorphisms of phases I and II xenobiotic transformation reactions are known to contribute considerably to interindividual variations in the metabolism of numerous drugs and xenobiotics and to associate with altered risk of adverse drug reactions and some cancers. The frequency of functionally important mutations and alleles of genes coding for xenobiotic metabolizing enzymes shows a wide ethnic variation. However, little is known of the frequency distribution of the major allelic variants in the Russian population. In this study we investigated 325 individuals of Russian origin, who were healthy volunteers or patients without malignant diseases. Our study included the complete investigation of two enzymes of phase I, CYP1A1 and CYP2D6, and one phase II enzyme, NAT2, using PCR-RFLP genotyping and LightCycler method. The frequencies of the CYP1A1 high-activity alleles, CYP1A1*2A and CYP1A1*2B, were 4.6% (3.1%-6.5%) and 5.1% (3.5%-7.1%), respectively. The mutations m1 (3801T>C), m2 (2455A>G), m4 (2453C>A), m5 (-4335G>A), m6 (-3219C>T), and m7 (-3229G>A) of CYP1A1 occurred in 9.8% (95% confidence interval, 7.7%-12.4%), 5.0% (95% C. I., 3.5%-7.1%), 2.5% (1.4%-4.0%), 25.8% (22.5%-29.4%), 6.0% (4.3%-8.1%), and 2.9% (1.8%-4.5%) of alleles, respectively. We did not find the m3 mutation, which has only been detected in Africans up to now. 5.9% (3.5%-9.2%) of all subjects were CYP2D6 poor metabolizers, whereas 3.4% (1.7%-6.3%) were identified as ultra-rapid metabolizers (CYP2D6*1x1/*1). Genotyping eight different single nucleotide polymorphisms in the NAT2 gene provided a genotype associated with slow acetylation in 59.7% (54.1%-65.1%) of individuals, 34.7% (29.6%-40.2%) of participants carried at least one allele encoding rapid acetylation, and 5.6% (3.3%-8.6%) were homozygous for the rapid-acetylation allele (wild-type allele *4 or mutant allele *12A). The overview of allele distribution of the important drug and xenobiotic metabolizing enzymes among Russians shows that the allele frequency is similar to that of other Caucasians. Therefore it may be expected that drug side effects and efficacy problems due to an individual's genetic background are similar compared to those in other European populations.

Genetische Polymorphismen in den Enzymen CYP2D6, CYP2C19 und CYP2C9 beeinflussen die Pharmakokinetik medizinisch bedeutsamer Arzneimittel wie Antidepressiva, oraler Antidiabetika und nichtsteroidaler Antiphlogistika in erheblichem Ausmaß. In der Zukunft kann die Bestimmung genetischer Varianten bei Patienten zur Verbesserung der Arzneitherapie genutzt werden, jedoch nur dann, wenn klinische Konsequenzen wie konkrete Therapieempfehlungen aus den genetischen Daten abgeleitet werden können. An gesunden Probanden wurde die die Bedeutung der beiden Aminosäurevarianten des Enzyms CYP2C9, Arg144Cys (CYP2C9*2) und Leu359Ile (CYP2C9*3) für die Pharmakokinetik von Tolbutamid, Glibenclamid, Nateglinid, Diclofenac, Ibuprofen, Celecoxib und Fluvastatin untersucht. Die Analyse der pharmakokinetischen Parameter ergab eine erheblich erniedrigte Clearance für diese Substrate bei homozygoten Trägern der Allelvariante CYP2C9*3, wie sie etwa 1% in der Bevölkerung tragen. Um bioäquivalente Konzentrationsverläufe zu erreichen, müssten diese Patienten deutlich niedrigere Dosierungen (unter 50%) der meisten der untersuchten CYP2C9-Substrate erhalten. Hingegen zeigte die CYP2C9*2-Variante nur einen geringen Einfluss auf die Pharmakokinetik der untersuchten Medikamente. Für den Bereich der Therapie mit Antidepressiva und Antipsychotika sollte untersucht werden, inwieweit umfassende pharmakogenetisch begründete Therapieempfehlungen gegeben werden können. Eine systematische Analyse aller bisher publizierten Daten zum Einfluss von Polymorphismen von CYP2D6, CYP2C19 und CYP2C9 ergab, dass für die meisten gängigen Antidepressiva bereits Studien zur Bedeutung von Cytochrom-P450-Polymorphismen durchgeführt wurden. Für die beiden in Deutschland sehr häufig verwendeten Trizyklika Trimipramin und Doxepin dagegen lagen keine ausreichenden Daten vor. Beide Medikamente wurden deshalb bei Probanden getestet, die jeweils Träger eines oder zweier Allele mit defizienter oder herabgesetzter Enzymaktivität von CYP2D6, CYP2C19 oder CYP2C9 waren. Es ergab sich ein deutlicher Einfluss des CYP2D6-Genotyps, ein schwächerer von CYP2C19 und des Genotyps CYP2C9*3/*3. Eine Dosisreduktion für Langsam-Metabolisierer von CYP2D6 und etwas moderater für Langsam-Metabolisierer von CYP2C19, sowie für Träger des Genotyps CYP2C9*3/* erscheint für diese beiden Antidepressiva sinnvoll. Die eigenen Daten und die Daten für andere Antidepressiva aus der Literatur wurden dazu verwendet, eine Methode zur Ableitung von pharmakogenetisch basierten Dosierungsempfehlungen zu entwickeln. Auf dem Prinzip der Bioäquivalenz basierend wurden Dosierungsanpassungen für unterschiedliche Genotypen je nach Unterschieden in der Clearance von Substanzen errechnet. Durch diese Dosierungsanpassungen können zumindest theoretisch die durch herabgesetzte Enzymaktivität verursachten Unterschiede in den Plasmakonzentrationsverläufen von Medikamenten ausgeglichen werden. Dabei wurden aktive an der Arzneimittelwirkung teilhabende Metaboliten mit berücksichtigt. Auf Seiten der Pharmakodynamik wurden die vielen Studien zu genetischen Polymorphismen in Serotonin-, Dopaminrezeptoren und Transportern und auch zu anderen Kandidatengenen für die Antidepressiva-, und Antipsychotikawirkung analysiert. Jedoch lassen sich aus den teilweise geringen Einflüssen einzelner Genotypen auf die Arzneimittelwirkung derzeit noch keine pharmakodynamisch begründeten Therapieempfehlungen ableiten. Zusammenfassend lassen sich also bereits heute pharmakogenetisch basierte Dosierungsempfehlungen für viele Medikamente berechnen. Derartige Empfehlungen müssen prospektiv überprüft, validiert und angepasst werden. Auf Seiten der Zielmoleküle der Arzneimittelwirkung ist eine Ableitung genetisch basierter Therapieempfehlungen schwieriger. Das Ziel, konkrete Therapieempfehlungen aus genetischen Daten abzuleiten, ist eine notwendige Bedingung, um Pharmakogenetik in die klinische Praxis der Arzneitherapie einzuführen. / Genetic polymorphisms of the cytochrome P450 enzymes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 largely influence pharmacokinetics of clinically important drugs such as antidepressants, oral antidiabetics and nonsteroidal antiphlogistic drugs. Pharmacogenetic diagnostics is ready to be used for optimization of drug treatment in the future if concise recommendations for clinical decisions can be derived from the genetic data. Panel studies in healthy volunteers served to characterize the impact of the amino acid variants Arg144Cys (CYP2C9*2) and Leu359Ile (CYP2C9*3) in cytochrome P450 2C9 on pharmacokinetics of the oral antidiabetics tolbutamide, glyburide and nateglinide, of the nonsteroidal analgetic drugs diclofenac, ibuprofen, celecoxib, and of fluvastatin. Analysis of pharmacokinetic parameters revealed largely reduced oral clearances in homozygous carriers of the CYP2C9*3 allele for most of the substrates studied. About 1% in the general population are carriers of this genotype and patients should get about 50% lower doses of most of the CYP2C9 substrates in order to achieve similar plasma concentration versus time courses. In contrast, the CYP2C9*2 variant had little influence on pharmacokinetics of the CYP2C9 substrates. For antidepressant and antipsychotic drug therapy, the aim was to derive detailed dose recommendations from the large amount of data existing. Thus, a systematic analysis of all published data on the clinical influence of genetic polymorphisms in CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 was performed and dose recommendations were given for many antidepressants. For two substances, the tricyclics doxepin and trimipramine, no pharmacogenetic data have been found, and therefore own clinical studies were performed. Healthy volunteers who were heterozygous and homozygous carriers of alleles with deficient activity of CYP2D6, CYP2C19 or CYP2C9 were tested for differences in metabolism and elimination of doxepin and trimipramine and compared to carriers of the wildtype. A significant influence of the CYP2D6 genotype was detected whereas CYP2C19 and the genotype CYP2C9*3/*3 had smaller influences. A significant dose reduction for CYP2D6 poor metabolizers and a smaller reduction for CYP2C19 poor metabolizers would be predicted from these data. According the principles of bioequivalence, calculation methods for pharmacogenetic based dose recommendations from clearance or drug concentration data were developed. Using all published data and the own study results, we developed dose adjustments for each genotype. These dose adjustments would allow to compensate for lower drug clearance caused by genetic variants. Active metabolites which contribute to overall drug effects were considered as well. With regard to target molecules of antidepressant and antipsychotic drug action, many studies have been performed on genetic polymorphisms in serotonin-, and dopamine receptors and in transporter molecules but as well in other candidate genes. However, it is not yet possible to derive therapeutic consequences based on these data. In conclusion, on the pharmacokinetic side of drug action, we are already able to give pharmacogenetic based therapeutic recommendations by adjusting the doses according to genotype. However, the benefit of pharmacogenetic dose adjustments has to be studied prospectively. With regard to the pharmacodynamic side of drug action, the situation is much more complex and we are not yet ready to give pharmacogenetics based therapeutic guidelines. However, this has to be a major goal in order to introduce pharmacogenetic diagnostic into clinical practice.

Die vorliegende Arbeit hatte die Aufgabe, die humane Hepatomzellinie Hep G2 hinsichtlich ihrer Biotransformationskapazität zu charakterisieren, um Aussagen über ihre Eignung als in vitro-Testsystem treffen zu können. Dazu wurden die Aktivitäten und die Induzierbarkeit von unterschiedlichen Cytochrom P450 Isoenzymen (CYP) bestimmt und mit Aktivitäten von isolierten Hepatozyten der Wistarratte verglichen. Als Vertreter der Phase II-Reaktionen wurde die Konjugierung von p-Nitrophenol untersucht. Hep G2-Zellen enthielten detektierbare CYP 1 A1 und 2-Aktivitäten, was mit Hilfe des 7-Ethoxyresorufin- und des 7-Ethoxycoumarin-Assays festgestellt werden konnte. Die Enzymaktivitäten waren durch 3-Methylcholanthren und Phenobarbital induzierbar. Die Umsatzraten waren höher als in Monolayerkulturen von Rattenhepatozyten. Die Umsatzraten der Azoreduktion von 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen waren in Hep G2-Zellen ebenfalls höher als in Hepatozyten der Wistarratte. Hep G2-Zellen zeigten sich hinsichtlich der Demethylierung von Aminophenazon, katalysiert durch CYP 3A1 und 2, und der Konjugierung von p-Nitrophenol den Rattenhepatozyten unterlegen. Die Konjugierung war durch 3-Methylcholanthren und Phenobarbital induzierbar. Des weiteren wurde die Biotransformation von 3 potentiellen Arzneistoffen in Hep G2-Kulturen untersucht. Dabei handelte es sich um AWD 100-041(3-(2-Mercaptoethyl)chinazolin-2, 4(1H,3H)-dion), AR 12463 (5-Piperidino-7-[N-pentyl-N (ß-hydroxyethyl)]amino-s-triazolo(1,5a)-pyrimidin) und dem Lipoxygenaseinhibitor FLM 5011(2-Hydroxy-5-methyllaurophenon -oxim). In allen drei Fällen wurden zwar die gleichen Hauptmetaboliten wie in Rattenhepatozyten gebildet, die Umsatzraten waren aber wesentlich geringer. Um die Toxizität dieser drei Verbindungen und die von Solanum lycopersicon- Mazeraten zu untersuchen, wurde der Proteingehalt und der DNA-Gehalt mit Hilfe von Amidoschwarz bzw. bisBenzimid der Kulturen bestimmt. Membranschäden wurden durch den LDH Cytotoxicity Test von Boehringer Mannheim detektiert. Unter anderem konnte gezeigt werden, daß die Toxizität von FLM 5011 in Hep G2-Zellen auf die Induktion apoptotischer Prozesse zurückzuführen ist, welche durch die sinkende Konzentration von 5(S)-Hydroxyeikosatetraensäure in der Zelle ausgelöst wird. Insgesamt stellen Hep G2-Zellen ein brauchbares in vitro-Modell für Biotransformations- und Zytotoxizitätsuntersuchungen dar. / This investigations had the intention to characterise the capacity of biotransformation of the human hepatoblastoma- derived cell line Hep G2 and to draw conclusions about its suitability as in vitro-model. The enzyme activities and inducabilities of cytochrome P450 isoenzymes (CYP) as phase I reactions were measured and compared with the activity of monolayer primary cultures of rat hepatocytes. As a phase II-reaction the conjugation of p-nitrophenol was examined. Hep G2 contained detectable activities of CYP 1A1 and 2 measured by the 7-ethoxyresorufin assay and the 7-ethoxycoumarin assay and which were inducable by 3-methylcholanthrene and phenobarbitone. The turnover was higher than in rat hepatocytes. Also reductive activities, detected by the azoreduction of 4-(N,N-dimethylamino)- azobenzene, had a higher level than rat hepatocytes. Hep G2 cells were inferior compared to rat hepatocytes concerning the demethylation of aminophenazone catalysed by CYP 3A1 and 2 and the conjugation of p-nitrophenol. The latter was highly inducable by phenobarbitone. The biotransformation of the three active substances AWD 100-041 (3-(2-mercaptoethyl) chinazoline-2,4(1H,3H)-dione), AR 12463(5-piperidino-7-[N- pntyl-N (ß-hydroxyethyl)]amino-s-triazolo[1,5a)-pyrimidin) and the lipoxygenase-inhibitor FLM 5011(2-hydroxy-5- methyllaurophenone-oxim) in Hep G2 cell were also examined. In all cases the major metabolites were the same as in rat hepatocytes but the turnover was much lower than in rat hepatocytes. To study the toxicity of these three compounds and of Solanum lycopersicon mazerates the protein and the DNA content of the Hep G2 cultures were measured with amido black and bisbenzimid respectively. Membrane damages were detected by the LDH Cytotoxicity Test of Boehringer Mannheim. It could be proved that the toxicity of FLM 5011 is due to apoptotic activities aroused by the down regulation of 5-(S)hydroxyeicosatetraenoic acid. Hep G2 cells are a useful model for assessing the metabolism and toxicity of xenobiotics.

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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.

Eleven species are distinguished in the genus Oxythyrea Mulsant, 1842 (Coleoptera: Scarabaeidae) nowadays. They are not divided into subspecies. Diversity of the genus is concentrated in the Mediterranean and Oxythyrea funesta (Poda, 1761) inhabit a wide area in the western Palearctic Region. It was observed in last decades, that O. funesta retreated from central Europe to south and then recolonized it back including new areas in northern regions. Master thesis is focused on resolving population structure of O. funesta and partial phylogeny of the genus Oxythyrea using molecular genetic methods. 145 individuals of O. funesta and 15 individuals of five other species of the genus Oxythyrea appear in analysis. We acquired sequences of mitochondrial genes cytochrome oxidase I (807 bp), cytochrome b (381 bp) and nuclear gene internal transcribed spacer 1 (946 bp) from these specimens. The results of phylogenetic analysis confirmed so far the only one existing interpretation of relationships within the genus Oxythyrea based on morphological data. We also confirmed complicated relationships between O. funesta and O. pantherina, which also appear in the historical development of their taxonomy. We detected different genetic lineage in Sicily, southern Italy and Tunisia using phylogenetic trees and haplotype...

The remediation of persistent chlorinated aromatic compounds has become a priority of great relevance due to the teratogenic, carcinogenic and endocrine-disrupting properties of these xenobiotics. The use of biological methodologies for the clean-up of contaminated sites, collectively referred to as "bioremediation", has been gaining an increasing interest in recent years because it represents an effective, cost-competitive and environmentally friendly alternative to the physico-chemical and thermal treatments. In this respect, "white rot" fungi, an ecological subgroup of filamentous fungi, display features that make them excellent candidates to design an effective remediation technology ("mycoremediation"). In spite of this, fungi have not been widely exploited for their metabolic capabilities and the mechanism by which they are able to degrade the aforementioned pollutants has not been fully elucidated yet. Within this frame, the present Ph.D thesis was aimed at: i) assessing the efficiency of different mycoremediation strategies for the clean-up of a polychlorinated biphenyl (PCBs)-contaminated soil; ii) understanding the fungal degradation pathways of polychlorinated biphenyls and their major metabolites, namely chlorobenzoic acids (CBAs) and hydroxylated polychlorinated biphenyls (OH-PCBs). i)...