Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Themenschwerpunkte. Ein supramolekulares Projekt beinhaltete die Entwicklung von neuen flexiblen, selbst-aggregierenden Zwitterionen als Bausteine für supramolekulare Polymere. In einem zweiten bioorganischem Teil bestand das Ziel darin, Rezeptoren für Aminosäuren und Dipeptide in Wasser zu entwickeln. Beide Projekte basieren auf dem Guanidiniocarbonylpyrrol als effizientes Bindungsmotiv für die Komplexierung von Carboxylaten in wässrigen Lösungen. Eine notwendige Voraussetzung für die Realisierung dieser Projekte war jedoch zunächst die Entwicklung einer allgemeinen, effizienten und milden Synthese für Guanidiniocarbonylpyrrole. Die bei der zuvor verwendeten Methode aggressiven Reaktionsbedingungen und die problematische Aufreinigung verhinderten eine größere Anwendung dieses Bindungsmotivs in bioorganischen und supramolekularen Projekten. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mir erfolgreich eine neue Syntheseroute zu entwickeln. Hierbei wurde mono-tBoc-Guanidine mit dem Benzylester mittels PyBOP gekuppelt und nach Entschützung der Benzylschutzgruppe wurde die zentrale Zwischenstufe für die weiteren Synthesen, die tBoc-geschützte Guanidinocarbonylpyrrol-Säure erhalten. Durch diese neuartige Synthese war es möglich, eine Reihe von flexiblen Zwitterionen 3-6 herzustellen und deren Selbst-Aggregation und den Einfluß der Kettenlänge und somit Flexibilität der Alkylkette auf Struktur und Stabilität der gebildeten Aggregate in Lösung sowie auch in der Gasphase zu untersuchen. In DMSO deuten NMR-Verdünnungsreihen darauf hin, dass die flexiblen Zwitterionen mit n = 1, 3 und 5 oligomere Strukturen ausbilden. Im Falle von n = 1 werden hoch stabile helicale und Nanometer große Aggregate in der gebildet. In den Gasphasen-Studien wurde die Stabilität und Zerfallskinetik einer Reihe von Natriumaddukten der Dimere von n = 2, 3 und 5 untersucht. Dieses gelang durch die Methode der „infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry“ (IRMPD-FT-ICR MS). Solche Studien ermöglichen möglicherweise in Zukunft das gezielte Design von supramolekularen Bausteinen. Der bioorganische Teil meiner Arbeit setzte sich aus drei Einzelprojekten zusammen. So synthetisierte ich durch eine fünfstufige Synthesesequenz vier neue Arginin-Analoga, die in Zukunft als Ersatz für Arginin in Peptide eingebaut werden können. Als Testreaktion für die Eignung dieser Verbindungen in einer Festphasenpeptidsynthese, wurde ein Tripetid Ala-AA1-Val (AA: Arginin-Analogon) mit einem eingebauten Arginin-Analogon erfolgreich hergestellt. In einem zweiten Projekt habe ich den Einfluß einer zusätzlichen ionischen Wechselwirkung in unserem Bindungsmotiv untersucht. Dazu wurde ein zweifach-kationischer Rezeptor und der dreifach-geladenen Rezeptor synthetisiert und physikalisch-organisch ihre Bindungseigenschaften mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten gegen eine Reihe von Aminosäuren untersucht. Der dreifach-kationische Rezeptor 11 zeigte hierbei herausragende Bindungseigenschaften und war um ca. den Faktor 100 besser als für die bisher bekannten Guanidiniocarbonylpyrrole. Die Assoziationskonstanten waren auch fast reinem Wasser mit bis zu Kass = 2000 noch bemerkenswert hoch. Im dritten Projekt habe ich einen de-novo entwickelten Rezeptor für C-terminale Dipeptide in einer beta-Faltblatt Struktur entwickelt.Dieser Rezeptor wurde mittels NMR and UV-Titrationen untersucht. In 40 % Wasser/ 60 % DMSO waren die Bindungskonstanten zu hoch um überhaupt quantifiziert zu werden. Deshalb wurden die Bindungseigenschaften des Rezeptors mittels UV Titrationen in einer Mischung aus 90 % Wasser mit 10 % DMSO gegen eine Reihe von Dipeptiden und Aminosäuren getestet. Die Bindungsdaten zeigen, dass Rezeptor Dipeptide mit ausgezeichneten Bindungskonstanten (Kass > 10000 M-1) komplexiert. Im Gegensatz dazu bindet der Rezeptor 12 Aminosäuren um den Faktor zehn schlechter (Kass > 1000 M-1). Die Komplexstabilität nimmt hierbei in Abhängigkeit von der Seitenkette des Dipeptids in der Reihe Gly < Ala < Val zu, was sich mit der abnehmenden Flexibilität und zunehmenden Hydrophobizität der Seitenkette erklären lässt. Diese Eigenschaften machen den Rezeptor 12 zu dem besten bisher bekannten Dipeptidrezeptor in wässrigen Lösungen. Innerhalb meiner Arbeit gelang es mir somit, nicht nur eine essentiell wichtige, milde und effiziente Synthese für Guanidinocarbonylpyrrole zu entwickeln, sondern es gelang mir ebenso ein neues Bindungsmotiv für die Komplexierung von Aminosäuren in Wasser zu entwickeln. Zusätzlich konnte noch der Dipeptidrezeptor erfolgreich synthetisiert und untersucht werden. Mit Bindungskonstanten für von Kass > 10000 M-1 ist er der derzeit beste Dipeptidrezeptor in wässriger Lösung. / The present thesis encompasses two parts. The first supramolecular part focuses on the development of new flexible self-assembling zwitterions as building blocks for supramolecular polymers. In the second part, the aim was to develop bioorganic receptors for amino acids and dipeptides in aqueous media. Both research projects are based on the guanidiniocarbonyl pyrrole 1 as a new efficient binding motif for the complexation of carboxylates in polar solution.A necessary requirement for the realization of these research projects was to develop an efficient and mild synthetic approach for the cationic guanidiniocarbonyl pyrroles in general. The harsh reaction conditions of the previously used method and the problematic purification of the cationic guanidinocarbonyl pyrroles so far prevented a more extensive exploration in bioorganic and supramolecular research. In the course of this work I successfully developed a new synthesis starting with mono tBoc-protected guanidine that was coupled with a benzyl protected pyrrole carboxylic acid. After deprotection of the benzyl group, a key intermediate in the newly developed synthesis, the tBoc-protected guanidinocarbonyl pyrrole acid, was obtained. This new, mild and extremely efficient synthetic approach for the introduction of acyl guanidines is now the standard procedure in our group for the preparation of both solution and solid-phase guanidiniocarbonyl pyrroles. With this facile method at hand, a new class of flexible zwitterions, in which a carboxylate is linked via an alkyl chain to a guanidiniocarbonyl pyrrole cation was synthesized. The self-aggregation and the influence of the length and therefore flexibility of the alkyl spacer on the structure and stability of the formed aggregates were studied in solution and gas phase. In solution the aggregation was studied by NMR-dilution experiments in DMSO which suggest that flexible zwitterions with n = 1, 3 and 5 form oligomers. For n = 1, highly stable helical aggregates with nanometer size are formed. In the gas phase studies the stability and the fragmentation kinetics of a series of sodiated dimeric zwitterions with n = 2, 3 and 5 were investigated. This was done by infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (IRMPD-FT-ICR-MS). These kinds of studies can be used in the future for a more directed design of supramolecular building blocks The bioorganic research part comprises three different projects. In a first project I synthesized four new arginine analogues which can be implemented in peptides as a substitute for arginine. Therefore, I developed the new multi-step synthesis shown below for these arginine analogues. As a test for their application in normal solid phase synthesis, I successfully prepared a tripeptide sequence Ala-AA1-Val (AA: arginine analogue. In a second project I studied the influence of additional ionic interactions within our binding motif. I synthesized a di-cationic and a tris-cationic receptor and evaluated the binding properties via NMR titration experiments against a variety of amino acids. Especially, the tris-cationic receptor was capable to strongly complex amino acids. The association constants were about a factor of 100 higher than those for the guanidiniocarbonyl pyrroles known so far. Even in 90 %water/10 % DMSO the association constants determined by NMR titration were extremely high with values around Kass = 2000 M-1. In the third project I developed a de-novo designed receptor for C-terminal dipeptides in a beta-sheet conformation based on molecular calculations. This receptor was studied in NMR and also UV titration experiments. In 40 % water/ 60 % DMSO the association constants were too strong to be measured by NMR titration experiments. Therefore, the complexation properties of 12 were studied by UV titration in water (with 10 % DMSO added for solubility reasons) with various dipeptides and amino acids as substrates. The data show that 12 binds dipeptides very efficiently even in water with association constants Kass > 10000 M-1, making 12 one of the most effective dipeptide receptors known so far. In contrast to that, simple amino acids are bound up to ten times less efficiently (Kass > 1000 M-1) than dipeptides. In the series of dipeptides studied the complex stability increases depending on the side chains present in the order Gly < Ala < Val which is a result of the decreasing flexibility of the peptide and the increasing hydrophobicity of the side chains. The binding properties of this receptor are superior to any other dipeptide receptor reported so far. Within my thesis I have not only developed an essential, mild and efficient synthetic approach for guanidiniocarbonyl pyrroles in general, but also a new binding motif for the complexation of amino acids 15, 11 and in addition a dipeptide receptor 12 that is superior to all dipeptides receptors known so far.

The development and in-depth characterization of new fluoroaryl functionalized ORMOCER® materials (inorganic-organic hybrid polymers) for optical waveguide applications in telecommunication is presented. The preparation of the materials included precursor silane synthesis, hydrolysis/polycondensation of organoalkoxysilane mixtures, and photolithographic processing of the resulting oligosiloxane resins in order to establish the inorganic-organic hybrid network. During all stages of ORMOCER® preparation, structure-property relations were deduced from characterization data, particularly with respect to low optical loss in the important near-infrared spectral region as well as refractive index. With the aid of molecular modeling, structural characteristics of oligomeric intermediates were visualized, which was found valuable in the fundamental understanding of the material class. The material development started with the syntheses of a variety of commercially unavailable fluorinated and unfluorinated arylalkoxysilanes by means of Grignard and hydrosilylation pathways, respectively. A survey of silane optical properties, particularly their absorptions at the telecom wavelengths 1310 nm and 1550 nm, gave an impulse to the choice of suitable precursors for the preparation of low-loss ORMOCER® resins. Accordingly, precursor silane mixtures and hydrolysis/polycondensation reaction conditions were chosen and optimized with regard to low contents of C-H and Si-OH functions. Thus, absorptions as low as 0.04 dB/cm at 1310 nm and 0.18 dB/cm at 1550 nm, respectively, could be obtained from an oligosiloxane resin based on pentafluorophenyltrimethoxysilane (1) mixed with pentafluorophenyl(vinyl)-dimethoxysilane (5). In order to improve the organic crosslinkability under photolithographic processing conditions, further resins on the basis of the aforementioned were prepared, which additionally incorporated the styrene-analogous precursor 4-vinyltetrafluorophenyl-trimethoxysilane (4). Thus, ORMOCER® resins with low optical losses of 0.28 dB/cm at 1310 nm and 0.42 dB/cm at 1550 nm, respectively, were prepared, which exhibited excellent photopatternability. The manufacture of micropatterns such as optical waveguide structures by UV-photolithography under clean room conditions was the final stage of material synthesis. The optimization of processing parameters allowed the preparation of test patterns for the determination of optical, dielectrical and mechanical properties. A low optical loss of 0.51 dB/cm at 1550 nm could be measured on a waveguide manufactured from a photopatternable fluoroaryl functionalized ORMOCER®. The structural characterization of liquid resins as well as cured ORMOCER® samples was accomplished chiefly with solution and solid state 29Si-NMR spectroscopy, respectively. Particularly for polycondensates incorporating species based on more than one precursor silane, the spectra showed a high degree of complexity. An additional challenge arouse from the partial loss of fluoroaryl groups during ORMOCER® condensation and curing, which resulted in even more condensation products. Thus, in order to provide a basis for resin analysis, first the hydrolysis/condensation reactions of the isolated precursors were investigated under reaction time-resolution with NMR spectroscopy at low temperature. Backed by signal assignments in these single-precursor systems, the respective species could also be identified in the complex resin spectra, allowing for their quantitative interpretation. The structural characterization was rounded out by IR spectroscopy and SAXS analyses. With the help of molecular modeling, the experimental data were finally transferred into a three-dimensional image of an organosiloxane oligomer, which is representative for a photopatternable fluoroaryl functionalized ORMOCER® resin. The combination of low-temperature NMR, which made the characterization of polycondensates possible, with oligomer modeling paved the way to a further understanding of ORMOCER® resin systems. On the basis of this visualization of structural characteristics, e.g. properties such as organic crosslinkability of oligomers were discussed in the light of steric features within the molecular structure. Thus, new possibilities were established for the systematic optimization of ORMOCER® formulations. Structure-property relations with respect to optical loss and refraction, as determined within this work, follow trends, which are in accordance with the literature. Particularly the direct comparison of data derived from analogous fluorinated and unfluorinated ORMOCER® resins showed that fluorination results in significant decrease in NIR optical loss. Additionally, different unfluorinated aryl functionalized systems with varying aliphatic C-H content were compared. In case of a lower aliphatic content, a widening effect on the 1310 nm window was found. This is due to a shift of arylic C-H vibrations (1145 nm) towards lower wavelengths compared to aliphatic C-H (1188 nm). Finally, on the basis of NIR spectra of analogous fluorinated resins with low and high silanol content, respectively, a significant impact of (Si)O-H groups on the 1550 nm window was demonstrated, while the 1310 nm window was unaffected. This is due to O-H vibrations with a maximum at 1387 nm and further bands at higher wavelength. The index of refraction was drastically lowered due to fluorination. Thus, the analogous fluorinated and unfluorinated ORMOCER® resins had indices of 1.497 and 1.570, respectively, in the VIS region. For the fluorinated systems, refraction did not change significantly during organic cross-connection and hardbake. In conclusion, the new fluoroaryl functionalized ORMOCER® systems represent low-loss materials for telecom applications. In addition, in-depth characterization during material development allowed the proposal of structure-property relations, particularly with respect to optical properties, which are of considerable importance for future developments. / Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung und detaillierten Charakterisierung von fluorarylmodifizierten ORMOCER®en (anorganisch-organischen Hybridpolymeren) für optische Wellenleiteranwendungen in der Tele- und Datenkommunikation. Die Materialsynthese erstreckte sich von der Darstellung von kommerziell nicht erhältlichen Arylalkoxysilanen, die als molekulare Vorstufen dienten, über deren Hydrolyse/Polykondensationsreaktion bis hin zur abschließenden photochemischen Prozessierung zum Aufbau des hybriden Polymernetzwerkes. Zu jedem dieser Entwicklungsstadien wurden Struktur-Eigenschaftsbeziehungen ermittelt. Hauptaugenmerk hierbei lag auf der optischen Dämpfung im relevanten Nah-Infrarotspektralbereich und der Brechzahl. Details in der Molekülstruktur von oligomeren Zwischenstufen schließlich wurden basierend auf spektroskopischen Daten mit Hilfe von Molecular Modeling visualisiert. Die Synthesen der fluorierten und unfluorierten Arylalkoxysilane stützten sich wesentlich auf Grignard- und Hydrosilylierungsrouten. Bereits die Ermittlung von optischen Eigenschaften der Vorläufersilane lieferte wichtige Impulse für den einzuschlagenden Weg bei der Entwicklung von verlustarmen ORMOCER®-Harzen. Zur Erreichung geringer Schwingungsabsorptionen bei 1310 nm und 1550 nm wurden somit sowohl die initialen Silangemische als auch die Bedingungen der Polykondensationsreaktionen hinsichtlich geringem Gehalt an C-H und Si-OH Gruppen optimiert. Auf diese Weise konnten geringe optische Verluste von 0.04 dB/cm bei 1310 nm und 0.18 dB/cm bei 1550 nm an einem ORMOCER®-Harz gemessen werden, das ausgehend von Pentafluorphenyltrimethoxysilan (1) und Pentafluorphenyl(vinyl)-dimethoxysilan (5) dargestellt wurde. In der Folge wurden weitere Harzsysteme entwickelt, um die organische Vernetzbarkeit der Materialien unter photolithographischen Prozessierungsbedingungen zu erhöhen. Hierzu wurde basierend auf der vorgenannten Silanzusammensetzung das Styrol-analoge 4-Vinyltetrafluorphenyltrimethoxysilan (4) zum Ausgangsgemisch hinzugefügt. Damit konnten ORMOCER®-Harze von ausgezeichneter Photostrukturierbarkeit dargestellt werden, die geringe optische Verluste von bis zu 0.28 dB/cm bei 1310 nm und 0.42 dB/cm bei 1550 nm aufwiesen. Die Materialsynthese wurde vervollständigt durch die photolithographische Darstellung von optischen Wellenleitern und anderen Mikrostrukturen unter Ausbildung des anorganisch-organischen Hybridnetzwerks. Unter Reinraumbedingungen konnten Prozessierungsparameter dahingehend optimiert werden, dass die Präparation von ORMOCER®-Teststrukturen für die optische, dielektrische und mechanische Charakterisierung ermöglicht wurde. An einem optischen Schichtwellenleiter aus einem photostrukturierbaren fluorarylfunktionalisierten ORMOCER® wurde bei 1550 nm eine optische Dämpfung von 0.51 dB/cm gemessen. Die Strukturaufklärung von flüssigen Harzen und ausgehärteten ORMOCER®-Proben erfolgte größtenteils mittels 29Si-NMR Spektroskopie. Die Polykondensatspektren setzten sich aus einer Vielzahl von Signalen zusammen, die einerseits die Ausgangssilangemische und andererseits deren unterschiedliche Kondensationsstufen widerspiegelten. Eine zusätzliche Herausforderung ergab sich aus der partiellen Abspaltung der Fluorarylfunktionalität während der Prozessierung, die zu weiteren Kondensationsprodukten führte. Aufgrund der damit gegebenen Komplexität der Spektren wurden zunächst die Ausgangssilane isoliert einer Hydrolyse/Kondensationsreaktion unterworfen und die Reaktionsgemische zeitaufgelöst mittels Tieftemperatur-Messreihen analysiert. Auf Grundlage der damit getroffenen Signalzuordnungen für die Reaktionsintermediate konnten in der Folge ebenfalls die komplexen Kondensatspektren quantitativ aufgeschlüsselt werden. Die Strukturaufklärung wurde mittels Infrarotspektroskopie und Röntgenkleinwinkelstreuung (im Fall der Harze) vervollständigt. Die Veranschaulichung der molekularen Struktur eines Siloxanoligomers in einem photopolymerisierbaren fluorarylfunktionalisierten ORMOCER®-Harz erfolgte mittels Molecular Modeling. Hierbei ist zu betonen, dass das resultierende Modell wesentlich auf experimentell ermittelten Strukturkenndaten basierte. Mit der Kombination Tieftemperatur-NMR / Harzcharakterisierung / Oligomermodeling wurde somit ein wichtiger Zugang zum weiteren Verständnis von ORMOCER®-Harzsystemen eröffnet. Als Beispiel konnten gestützt auf die Visualisierung von sterischen Charakteristika Eigenschaften wie die organische Vernetzbarkeit des Siloxanoligomers diskutiert werden. Hieraus eröffnen sich zukünftig neue Möglichkeiten zur gezielten Optimierung von ORMOCER®-Formulierungen. Aus Charakterisierungsdaten wurden Struktur-Eigenschaftsbeziehungen hinsichtlich optischer Dämpfung und Brechzahl abgeleitet, die literaturkonformen Trends folgten. Insbesondere im direkten Vergleich von analogen fluorierten und unfluorierten Materialien wurde der Effekt des Ersatzes von C-H durch C-F Bindungen deutlich. Optische Dämpfungswerte im NIR wurden durch Fluorierung signifikant verringert. Darüber hinaus konnte im Vergleich von unfluorierten Hybridpolymeren mit unterschiedlich hohem Anteil an aliphatischen und aromatischen C-H Bindungen gezeigt werden, wie durch einen geringeren Anteil an Aliphaten das Telekommunikationsfenster bei 1310 nm erweitert wird. Dies ist durch die unterschiedliche Lage von Obertonschwingungen für aliphatische (1188 nm) und aromatische C-H (1145 nm) begründet. Schließlich konnte anhand von analogen fluorierten Harzen mit unterschiedlichem Silanolgehalt eine signifikante Erhöhung der Dämpfung bei 1550 nm durch (Si)O-H Obertonschwingungen nachgewiesen werden, während die Absorption bei 1310 nm unbeeinflusst blieb. Hierfür war ein Absorptionsmaximum bei 1387 nm sowie eine Reihe schwächerer Banden bei höheren Wellenlängen verantwortlich. Die Brechzahl der Materialien wurde durch Fluorierung drastisch verringert. So wurden im VIS-Spektralbereich bei analogen fluorierten und unfluorierten Harzen Werte von 1.497 bzw. 1.570 ermittelt. Für den Fall der fluorierten Harzsysteme wurde keine signifikante Brechzahlveränderung im Zuge der organischen Quervernetzung festgestellt. Die neuentwickelten fluorarylfunktionalisierten ORMOCER®e eignen sich im Fazit als niedrig dämpfende Materialien für Telekomanwendungen. Zudem konnten mit Hilfe einer detaillierten Strukturaufklärung Struktur-Eigenschaftsbeziehungen herausgearbeitet werden, die wichtige Impulse für zukünftige Entwicklungen auf dem Gebiet liefern.

Subject of this work was to investigate the influence of nonadiabatic coupling on the dynamical changes of electron and nuclear density. The properties of electron density have neither been discussed in the stationary case, nor for excited electronic states or for a coupled electronic and nuclear motion. In order to remove these restrictions one must describe the quantum mechanical motion of all particles in a system at the same level. This is only possible for very small systems. A model system developed by Shin and Metiu [1, 2] contains all necessary physical ingredients to describe a combined electronic and nuclear motion. It consists of a single nuclear and electronic degree of freedom and the particle interaction is parameterized in such a way as to allow for a facile switching between and adiabatic (Born-Oppenheimer type) and a strongly coupled dynamics. The first part of the work determined the “static” properties of the model system: The calculation of electronic eigenfunctions, adiabatic potential curves, kinetic coupling elements and transition dipole moments allowed for a prediction of the coupled dynamics. The potentials obtained from different parameterization showed two distinct cases: In the first case the ground and first excited state are separated by a large energy gap which is the typical Born-Oppenheimer case; the second one exhibits an avoided crossing which results in a breakdown of the adiabatic approximation. Due to the electronic properties of the system, the quantum dynamics in the two distinct situations is very different. This was illustrated by calculating nuclear and electron densities as a function of time. In the Born-Oppenheimer case, the electron density followed the vibrational motion of the nucleus. This was demonstrated in two examples. In the strongly coupled case the wave packet did not exhibit features caused by nonadiabatic coupling. However, projections of the wave function onto the electronic states revealed the usual picture obtained from solutions of the nuclear Schrödinger equation involving coupled electronic states. In that case the nuclear motion triggered charge transfer via nonadiabatic coupling. The second part of the work demonstrated that the model system can easily be modified to yield binding situations often found in diatomic molecules. The different situations can be characterized in terms of bound and dissociative adiabatic potential curves. The investigation focussed on the case of an electronic predissociation, where the ground state is dissociative in the asymptotic limit of large internuclear distances. Within our model system we were able to demonstrate how the character of the electron density changes during the fragmentation process. In the third part we investigated the influence of external fields on the correlated dynamics of electron and nucleus. Employing adiabatic potential curves, the structure of absorption spectra can be understood within the weak-field limit. In the above described Born-Oppenheimer case the adiabatically calculated spectrum was in very good agreement with the exact one, whereas in the strongly coupled case the obtained spectrum was not able to resemble the exact one. Regarding the dynamics during a laser excitation process the time-dependent electron and nuclear densities nicely illustrated the famous Franck-Condon principle. The interaction with strong laser pulses lead to an excitation of many bound electronic and vibrational states. The electron density reflected the classical-like quiver motion of the electron induced by the fast variations of the electric field. The nucleus did not follow these fast oscillations because of its much larger mass. The last part of the work extended the original model system by including an additional electron. As a consequence of the Pauli principle, the spatial electronic wave function has to be either symmetric or anti-symmetric with respect to exchange of the two electrons. This corresponds to anti-parallel or parallel electron spins, respectively. The extended model already contains the physical properties of a many-electron system. Solving the time-dependent Schrödinger equation for a typical vibrational wave packet motion clearly indicated that the electron density is no longer suited to “localize” single electrons. We extended the definition of the electron localization function (ELF) to an exact, time-dependent wave function and demonstrated, how the ELF can be used to further characterize a coupled electron and nuclear motion. Finally, we gave an outlook of how to define electron localization in the case of anti-parallel electron spins. We derived a quantity similar to the ELF denoted “anti-parallel spin electron localization function” (ALF) and demonstrated that the ALF allows to follow time-dependent changes of the electron localization in a numerical example. [1] S. Shin, H. Metiu, J. Chem. Phys. 1995, 102, 9285. [2] S. Shin, H. Metiu, J. Phys. Chem. 1996, 100, 7867. / Gegenstand dieser Arbeit war es, den Einfluss nichtadiabatischer Kopplung auf die dynamischen Änderungen von Elektronen- und Kerndichten zu untersuchen. Die Eigenschaften der Elektronendichte wurden bislang weder für den nicht-stationären Fall, noch für angeregte elektronische Zustände oder für eine gekoppelte Elektronen- und Kerndynamik diskutiert. Diese Einschränkungen lassen sich beseitigen, indem man die quantenmechanische Bewegung aller Teilchen eines Systems auf dem gleichen Niveau beschreibt. Dies ist nur für sehr kleine Systeme überhaupt möglich. Ein Modellsystem, das von Shin und Metiu [1, 2] entwickelt wurde, erfüllt alle notwendigen physikalischen Vorraussetzungen, um eine gekoppelte Elektronen- und Kernbewegung zu beschreiben. Das Modell enthält jeweils nur einen Freiheitsgrad für Kern und Elektron, und die Parametrisierung der Teilchenwechselwirkung ermöglicht den flexiblen Wechsel von adiabatischer (Born-Oppenheimer-Fall) zu stark gekoppelter Dynamik. Der erste Teil der Arbeit untersuchte die „statischen“ Eigenschaften des Modellsystems: Die Berechnung elektronischer Eigenfunktionen, adiabatischer Potentialkurven, kinetischer Kopplungselemente und Übergangsdipolmomente erlaubte gewisse Vorhersagen über die zu erwartende, gekoppelte Dynamik. Die Potentiale, die man für verschiedene Parametrisierung erhielt, zeigten zwei deutlich unterschiedliche Fälle: Im ersten Fall, einer gültigen Born-Oppenheimer-Näherung, sind der Grund- und erste angeregte Zustand durch eine große Energielücke voneinander getrennt. Der zweite Fall zeigt eine vermiedene Kreuzung, die zu einem Versagen der adiabatischen Näherung führt. Aufgrund der elektronischen Eigenschaften des Systems, unterscheidet sich die Quantendynamik in den beiden betrachteten Fällen grundlegend, wie durch die Berechnung zeitabhängiger Kern- und Elektronendichten veranschaulicht wurde. Im Born-Oppenheimer-Fall folgte die Änderung der Elektronendichte der Schwingungsbewegung des Kerns. Im Falle starker Kopplung zeigte das Wellenpaket keine Anzeichen einer nichtadiabatischen Kopplung. Die Projektionen der Wellenfunktion auf die elektronischen Zustände enthüllten jedoch das übliche Bild, das man aus der Lösung der Schrödingergleichung der Kerne für gekoppelte elektronische Zustände erhält. In diesem Fall verursachte die Kernbewegung einen Ladungstransfer aufgrund nichtadiabatischer Kopplung. Der zweite Teil der Arbeit zeigte, dass das Modellsystem leicht modifiziert werden kann, um in zweiatomigen Molekülen vorhandene Bindungssituationen zu simulieren. Die verschiedenen Fälle sind durch gebundene und dissoziative adiabatische Potentialkurven charakterisiert. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den Fall einer elektronischen Prädissoziation, d.h. der Grundzustand ist dissoziativ für große Kernabstände. Innerhalb unseres Modellsystems konnten wir zeigen, wie sich die Elektronendichte während des Fragmentierungsprozesses ändert. Im dritten Teil untersuchten wir den Einfluss externer elektrischer Felder auf die korrelierte Elektronen- und Kernbewegung. Mit Hilfe adiabatischer Potentiale kann die Struktur von Absorptionsspektren im Falle schwacher Felder verstanden werden. Für den oben beschriebenen Fall gültiger Born-Oppenheimer-Näherung, stimmte das adiabatisch berechnete Spektrum sehr gut mit dem exakten überein. Für den Fall starker nichtadiabatischer Kopplung zeigte das erhaltene Spektrum keine Übereinstimmung mit dem exakt berechneten. Die Berechnung zeitabhängiger Elektronen- und Kerndichten, während der Wechselwirkung mit einem Laserfeld, veranschaulichte deutlich das Franck-Condon-Prinzip. Die Wechselwirkung mit einem intensiven Laserpuls führte zur Anregung vieler gebundener elektronischer und Schwingungszustände. Die Elektronendichte zeigte die einer klassischen Bewegung sehr ähnliche Zitterbewegung des Elektrons, die durch die schnellen Änderungen des elektrischen Feldes hervorgerufen wird. Der Kern folgte aufgrund seiner wesentlich höheren Masse diesen schnellen Oszillationen nicht. Der letzte Teil der Arbeit erweiterte das ursprüngliche Modell durch Hinzufügen eines weiteren Elektrons. Als Konsequenz des Pauli-Prinzips muss die Ortsraumwellenfunktion entweder symmetrisch oder antisymmetrisch bezüglich Austausches der beiden Elektronen sein. Dies entspricht antiparallelen, bzw. parallelen Elektronenspins. Das erweiterte Modell enthält bereits die physikalischen Eigenschaften eines Mehrelektronensystems. Das Lösen der Schrödingergleichung für eine Schwingungsbewegung des Kerns legte nahe, dass sich die Elektronendichte nicht eignet, die Lokalisierung der Elektronen zu charakterisieren. Wir erweiterten deshalb die Definition der Elektronenlokalisierungsfunktion (ELF) auf eine exakte, zeitabhängige Wellenfunktion und untersuchten, inwieweit sich die ELF eignet, eine gekoppelte Elektronen- und Kernbewegung genauer zu analysieren. Am Ende der Arbeit folgte ein Ausblick, wie Elektronenlokalisierung im Falle antiparalleler Elektronenspins definiert werden kann. Die von uns abgeleitete „Elektronenlokalisierungsfunktion für antiparallelen Spin“ (ALF) erlaubt es, die zeitabhängige Änderung der Elektronenlokalisierung zu beobachten, wie wir an einem numerischen Beispiel verdeutlichen konnten. [1] S. Shin, H. Metiu, J. Chem. Phys. 1995, 102, 9285. [2] S. Shin, H. Metiu, J. Phys. Chem. 1996, 100, 7867.

Die vielfältigen isomeren Substanzen, die in dieser Arbeit getrennt wurden, zeigen, dass die cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese eine sehr leistungsfähige Technik für die Trennung von Enantiomeren darstellt. Als kritisch erweist sich jedoch das Auffinden des richtigen Cyclodextrins bzw. dessen optimale Konzentration. Die Vorhersagbarkeit dieser Parameter ist noch zu gering, um hier vor den ersten Versuchen alleine anhand der Struktur des Moleküls sichere Aussagen machen zu können. So sind zur Zeit noch Versuchsreihen mit verschiedenen Cyclodextrinen und Bedingungen nötig, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurden. Für die Zukunft wäre es wünschenswert, durch das Sammeln von mehr Erfahrungen und Ergebnissen, wie sie hier gezeigt wurden, schon möglichst direkt aus den Strukturen der zu trennenden Zielmoleküle eine Aussage über die Beschaffenheit des Cyclodextrins oder der CE-Methode machen zu können. Von sechs verschiedenen schwach basischen Thiobarbituratracematen konnten fünf erfolgreich in ihr Enantiomeren getrennt werden. Unter den fünf erfolgreich getrennt Barbituraten waren zwei am Stickstoff alkyliert und ein weiteres sowohl am Stickstoff als auch am Schwefel. Die Thiobarbiturate, die am Stickstoffatom keinen Substituenten tragen, konnten mit &#61543;-CD am besten getrennt werden (RS > 6). Hingegen konnte für die beiden nur am Stickstoff alkylierten Barbituratemit mit &#61538;-CD und HDMS jeweils Auflösungen über RS = 6 erzielt werden. Für den in der Erdbeere vorhandene Schlüsselaromastoff 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, Furaneol, konnte eine CE-Methode entwickelt werden, die es zum einen ermöglicht, die Enantiomere vollständig zu trennen, und zum anderen so beschaffen ist, dass es bei der Trennung selbst zu keiner Racemisierung kommt, wie es bei der bisher verwendeten Gaschromatographie der Fall war. Die CE-Methode machte es erstmalig möglich, die enantioselektive Biosynthese von Furaneol in Erdbeerproteinextrakten nachzuweisen. Zusätzlich wurde noch die Racemisierungsgeschwindigkeit von einem angereichertem Gemisch bei vier verschiedenen pH-Werte getestet, was für weitere Arbeiten mit Furaneol-Proben von Bedeutung ist. Die Racemisierungsgeschwindigkeit erwies sich für den pH-Bereich von 3.8 bis 5 am langsamsten. Im neutralen Bereich wurde die schnellste Racemisierung beobachtet. Bei den Experimenten mit Atropin und dem verwandten Homatropin sollte geprüft werden, ob der Einsatz sulfatierter Cyclodextrine von vier verschiedenen Herstellern zu identischen Ergebnissen führt. Es konnten anhand einer kritischen Trennung gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Die Trennleistung der Cyclodextrine in Bezug auf den Vergleich Atropin/Homatropin war hierbei sehr ähnlich. Ein bei diesen Arbeiten zusätzlich entstandener Peak konnte eindeutig einem Zerfallsprodukt des Atropins, der Tropasäure, zugeordnet werden. Mit Hilfe von Experimenten mit den Atropisomeren von 1,1&#8242;-Binaphthalin-2,2&#8242;-diyl-phosphat sollte erprobt werden, ob eine Charakterisierung von randomisiert substituierter CDs über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) ausreicht, um beim erneuten Einsatz eines vergleichbaren Produktes reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen. Die Trennleistung von unterschiedlich randomisiert substituierten acetylierten und methylierten Cyclodextrinen wurde hierzu getestet, und mit der von &#61538;-CD und Heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)-&#61538;-cyclodextrin, bzw. deren Gemischen in Verhältnis von 1:9 bis 9:1 verglichen. Der Vergleich dieser Messergebnisse führte zu dem Schluss, dass eine einfache Charakterisierung randomisiert substituierter Cyclodextrine über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) nicht ausreicht, um reproduzierbare Ergebnisse beim Einsatz solcher Cyclodextrine zu erreichen. Die Aufnahme von Massenspektren ermöglichte es hingegen, randomisiert substituierte CDs aussagekräftig zu charakterisieren. Will man eine CE-Methode validieren, in der ein randomisiertes Cyclodextrin zu Einsatz kommt, so sollte man dieses mittels Massenspektroskopie charakterisieren und sich dessen bewusst sein, das die Validierung nur für diese eine Charge des Herstellers bzw. für Chargen mit vergleichbaren Massenspektren Gültigkeit besitzt. Für das im Arbeitskreis Bringmann racemisch synthetisierte 2-Hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin sollte eine Trennmethode für die Atropisomere entwickelt werden, da für die Zukunft eine enantioselektive Synthese geplant ist. Unter Einsatz der chiralen Selektoren Heptakis-(6-sulfato)-&#61538;-CD (HS) und Heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)-&#61538;-cyclodextrin (HDAS) konnten zwei Trennmethoden gefunden werden, die bei einer jeweiligen Cyclodextrinkonzentration von 15 mM zu einer guten Trennung der Enantiomeren führte. Dies ermöglicht eine Quantifizierung des Enantiomerenüberschuß (ee) für eine nicht-racemische Syntheseroute. / The manifold of isomeric substances being separated within the frame of this thesis shows the power of cyclodextrin-modified capillary electrophoresis concerning to the separation of enantiomers. The major problem is still to find the appropriate cyclodextrin respectively the optimum concentration. The possibility to predict these parameters only on the basis of the molecule structure is still too small. Thus, it is still necessary, to perform experiments to find the suitable cyclodextrin. It would be desirable for the future, to make this possible by collecting more experiences and information. The enantiomers of five of six weakly basic thiobarbiturates could be successfully separated. Two of these five barbiturates were N-substituted, one N-substituted as well as S-substituted. The three N-substituted thiobarbiturates characterized by phenyl- and ethyl-substituent in five positions being the chiral centre. In the two other molecules the chiral centre is located in the side chain, bound at the five position. Furthermore the dependence of the cyclodextrin concentration on the resolution power of five commercial cyclodextrins could be shown. The concentration leading to the best resolution was varying from the smallest (1 mmol/l) to the highest (18 mmol/l) concentrations which were used. The thiobarbiturates without a substituent at the nitrogen atom could be separated best by using &#61543;-CD (RS > 6). Whereas the two barbiturates carrying a N-alkyl substituent reach their best resolution with &#61538;-CD and HDMS (both RS > 6). Beside the absolute maxima local maxima were observed. For the key flavouring substance of the strawberry, 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, furaneol, a CE-method was developed, which makes it possible to separate the enantiomers without racemisation, which happens when using gas chromatography. This makes it possible to verify enantioselective biosynthesis of furaneol in strawberry protein extract for the first time. Additional the rate of racemisation of enantiomeric enriched samples at four different pH-values were tested, which is important for further experiments with furaneol. The studies on atropine and the related homatropine were performed to show, whether four sulphated cyclodextrins of four different manufacturers lead to identical results. By means of a critical separation the differences of the resolution powers could be shown. It varies from no resolution over separation 1/3 of the peak to 2/3. The resolution power to the atropine enantiomeres was comparable to the one of homatropine. An additional peak, which was found in the tests, was assigned to a decomposition product of atropine being tropic acid. By means of a study with the atrop-isomers of 1,1&#8242;-binaphthalin-2,2&#8242;-diyl-phosphate it was checked, whether the characterisation of randomly substituted cyclodextrins via the average molecular degree of substitution (MS) is sufficient to obtain comparable results in CD-modified CE. The resolution power of different randomly substituted acetylated and methylated cyclodextrins were tested and compared to the one of &#61538;-CD and heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)-&#61538;-cyclodextrin and their mixtures in a ratio of 1:9 to 9:1. The comparison of these results shows, that a simple classification of randomly substituted cyclodextrins by the average molecular degree of substitution (MS) is not sufficient to reproduce the results of measurements done with such kind of cyclodextrins. To validate a CE-method, in which a randomly substituted cyclodextrin is used, a mass spectrum of this cyclodextrin should be recorded and it should be clear, that the validation is effective only for this batch of the producer or for batches which have comparable mass spectra. For 2-hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin, which was racemically synthesized in the group of Prof. Bringmann, a separation method for the atop-isomers was developed, because a enantioselective synthesis is planed in the future. Using either heptakis-(6-sulfato)-&#61538;-CD (HS) or heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)-&#61538;-cyclodextrin (HDAS) as chiral selectors at a cyclodextrin concentration of 15 mM a good separation was obtained. This makes a quantification of the enantiomeric excess (ee) for enantioselective synthesis routes possible.

Phosphorus and nitrogen containing ligands were examined in terms of their coordination flexibility. Combining these donor atoms of different hardness or softness in one molecule leads to the design of polyfunctional, ambidentate ligand systems with unique properties, because the different features associated with each donor atom confer unique reactivity to their metal complexes. The phosphane Ph2P(CH2Py) (Py = 2-pyridyl) is a very versatile starting material for the preparation of highly flexible, hemilabile, ambident ligands. C-deprotonation of this phosphane yields a Janus head, responding very sensitive to the Lewis-acidity and the charge concentration of the coordinated metal, adapting its coordination mode to the electronic requirements of the cation (electronic differentiation). Thus, bidentate (P,N)-chelating, tridentate (P,N)-chelating together with C-coordination and (C,N)-coordination is observed in the different metal complexes discussed in this work. Additionally, the oxidized derivative of the abovementioned phosphane, the iminophosphorane Ph2P(CH2Py)(NSiMe3), is discussed. The C-deprotonated anion of this iminophosphorane prefers (N,N’)-side arm- rather than C-coordination. The electron deficient pyridyl substituent at the C-atom leads to charge delocalization in the anionic [Ph2P(CHPy)(NSiMe3]-moiety. The bonding parameters of the iminophosphorane and all its derivatives, together with the almost fixed 15N-NMR resonances for the imino nitrogen atoms in these compounds prove that hypervalent central phosphorus is not required to describe the bonding situation in iminophosphoranes. / Liganden, die sowohl Phosphor- als auch Stickstoffatome enthalten werden hinsichtlich ihrer Koordinationsflexibilität untersucht. Eine Kombination dieser Donoratome unterschiedlicher Härte oder Weichheit in einem Molekül ermöglicht das Design von polyfunktionellen, ambidenten Ligandsystemen mit einzigartigen Eigenschaften, da die unterschiedlichen Eigenschaften, die mit jedem Donoratom verbunden sind, den Metallkomplexen eine einzigartige Reaktivität verleiht. Das Phosphan Ph2P(CH2Py) (Py = 2-pyridyl) ist ein sehr fruchtvolles Ausgangsmaterial zur Synthese von hoch flexiblen, hemilabilen, ambidenten Ligandsystemen. Durch C-Deprotonierung dieses Liganden wird ein Janus-Kopf erhalten, der äußerst sensitiv auf die Lewis-Azidität und Ladungskonzentration des koordinierten Metals reagiert, indem er den Koordinationsmodus den elektronischen Anforderungen des Kations anpasst (elektronische Differenzierung). So wird bidentates (P,N)-chelatisierendes, tridentates (P,N)-chelatisierendes zusammen mit C-Koordination und (C,N)-Koordination in den in dieser Arbeit dargestellten Komplexen beobachtet. Zusätzlich wird das oxidierte Derivat des oben angeführten Phosphans, das Iminophosphoran Ph2P(CH2Py)(NSiMe3) diskutiert. Das C-deprotonierte Anion dieses Iminophosphorans bevorzugt eher (N,N')-Seitenarm- als C-Koordination. Der elektronendefizitäre Pyridylsubstituent führt dabei zu einer Delokalisierung der Ladung in dem anionischen [Ph2P(CHPy)(NSiMe3]–Fragment. Die Bindungsparameter des Iminophosphorans und aller Derivate, in Verbindung mit den annähernd konstanten 15N-NMR Resonanzen der Iminostickstoffatome in diesen Verbindungen beweisen, dass ein hypervalentes zentrales Phosphoratom zur Beschreibung der Bindungssituation in Iminophosphoranen nicht nötig ist.

Die Cystein-Proteasen der Säuger und Parasiten wurden erst in den letzten zwei Jahrzehnten als pharmazeutisch/medizinisches Target erkannt. Die genauen Aufgaben der einzelnen Enzyme dieser sehr umfangreichen und ständig wachsenden Protease-Familie bleiben zwar teilweise noch unbekannt, es ist jedoch klar, dass ihre Aufgabe nicht nur der unspezifische Protein-Abbau ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Synthese einer Reihe peptidomimetischer Inhibitoren mit elektrophilem Aziridin-2,3-dicarbonsäure-Baustein und deren Testung an den Proteasen Cathepsin B (human), Cathepsin L (Paramecium tetraurelia), Falcipain-2 (Plasmodium falciparum) und Rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense). Die Verbindungen sind als irreversible Inhibitoren der Proteasen konzipiert. Der Aziridin-Baustein als Elektrophil wird durch den Cystein-Rest des aktiven Zentrums der Proteasen angegriffen, es erfolgt eine nucleophile Ringöffnung und damit die irreversible Alkylierung der Proteasen. Die Aziridin-Bausteine wurden entweder stereoselektiv aus Tartraten oder als Racemate aus Fumaraten dargestellt. Durch NMR-spektroskopische Versuche wurde der Mechanismus der Epimerisierung der als Intermediate der stereoselektiven Synthese auftretenden Azidoalkohole aufgeklärt. Die N-Acylierung des Aziridin-Bausteins mit den Aminosäuren bzw. Dipeptiden erfolgte über Segmentkopplungen oder über eine schrittweise Anknüpfung der Aminosäuren. Es wurden dabei verschiedenste Methoden der Peptidchemie eingesetzt. Die Hemmkonstanten der synthetisierten Substanzen wurden in einem kontinuierlichen fluorimetrischen Mikrotiterplatten-Assay bei Inhibitor-Konzentrationen von 0.35 - 140 µM ermittelt. Als Substrat diente für alle Enzyme Z-Phe-Arg-AMC. Der Nachweis der Irreversibilität der Hemmung wurde durch Dialyse-Versuche und die Affinitätsmarkierung von Cathepsin L und Falcipain 2 mit Hilfe eines Biotin-markierten Inhibitors erbracht. Bei Inhibitoren, die eine zeitabhängige Hemmung aufweisen, wurden die Alkylierungskonstanten (ki –Werte) ermittelt. Diese sind im Vergleich zu den Konstanten der Epoxysuccinyl-Peptide ca. 1000x kleiner, was frühere Untersuchungen bestätigt. Aus den ermittelten Dissoziationskonstanten (Ki) ist die Selektivität für Cathepsin-L-ähnliche Proteasen eindeutig. Dabei wird die Reihenfolge RD > CL > FP >>> CB gefunden. Der beste Inhibitor für alle Enzyme ist die Substanz 116C (BOC-(S)-Leu-(S)-Azy-(S,S)-Azi(OBn)2), für die Hemmkonstanten im unteren micromolaren bzw. sogar nanomolaren Bereich gefunden werden. Unter den Substanzen finden sich auch einige, die für einzelne Enzyme selektiv sind. Für CL sind es die Verbindungen 517C, 105G, Z-023B, 023A; für CB 034A und 013B und für RD 112C, 222C, 105B, 013A. Dabei gibt es zwei Inhibitoren (105A, 517G), die selektiv nur die parasitären Enzyme FP und RD hemmen. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass in Abhängigkeit von den Substituenten am Aziridinring (Benzylester, Ethylester, Disäure), von den Substituenten am Aziridin-Stickstoff (Phe-Ala, Leu-Xxx, Gly-Xxx, Xxx = cyclische Aminosäure) und der Stereochemie unterschiedliche Bindungsmodi vorliegen müssen. Erste Docking-Versuche, die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Baumann (Institut für Pharmazie und LMC, Universität Würzburg) durchgeführt wurden, bestätigen dies. Postuliert wird für Inhibitoren, die die Sequenz Leu-Pro enthalten, eine Bindung an die S`- Seite von Cathepsin L. Dies erklärt die Selektivität dieser Inhibitoren, denn innerhalb der S`-Substratbindungstaschen finden sich die größten strukturellen Unterschiede zwischen Cathepsin B und den Cathepsin-L-ähnlichen Proteasen. Im Gegensatz dazu wird für eines der Phe-Ala-Derivate eine Bindung an die S-Taschen postuliert, die zwischen den einzelnen Proteasen geringere strukturelle Unterschiede aufweisen. Dieser Inhibitor hemmt, wie fast alle Phe-Ala-Derivate, dementsprechend auch Cathepsin B besser als die Leu-Xxx-Derivate. In Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe Engels Institut für Organische Chemie, Universität Würzburg) wurden quantenchemische Rechnungen durchgeführt, die u.a. den Einfluss von Substituenten auf die Kinetik und Thermodynamik der nucleophilen Ringöffnung untersuchten. Vorhergesagt wurde, dass Substituenten am Aziridin-Stickstoff, die den Übergangzustand stabilisieren (N-Formyl), zu einer besseren Hemmung führen sollten. Das darauf hin synthetisierte N-Formylaziridin-2,3-dicarboxylat 008B weist eine etwa 5000x bessere Hemmung von CL auf als das nicht-formylierte Diethylaziridin-2,3-dicarboxylat. Die gezielt als "affinity label" entwickelte Biotin-markierte Verbindung 999C wurde zur Identifizierung von Cystein-Proteasen, die von Plasmodium falciparum exprimiert werden, eingesetzt (Kooperation mit der Arbeitsgruppe Gelhaus/Leippe, Institut für Zoologie, Universität Kiel). / Mammalian and parasitic cysteine proteases have been discovered as potential drug targets within the last two decades. The physiological and pathophysiological functions of this huge and growing family of proteases are not yet known in detail. However, their role is no longer considered to be only unspecific protein degradation. The goal of the present work was the syntheses of a series of peptidomimetic cysteine protease inhibitors containing aziridine-2,3-dicarboxylate as electrophilic fragment, and the testing of the synthesized compounds on the cysteine proteases cathepsin B (human), cathepsin L (Paramecium tetraurelia), falcipain 2 (Plasmodium falciparum), and rhodesain (Trypanosoma brucei rhodesiense. The compounds are designed as irreversible protease inhibitors. The aziridine ring represents an electophilic building block which is attacked by the cysteine residue of the proteases` active sites. As a consequence, the nucleophilic ring opening reaction leads to irreversible enzyme alkylation. The aziridine building blocks were synthesized stereoselectively in a chiral pool synthesis starting from tartrates, and as racemates starting from fumarates, respectively. NMR spectroscopic studies were used to clarify the mechanism of epimerization occurring during the synthesis of the azido alcohols which are intermediates of the stereoselective synthetic route. The N-acylation of the aziridines with amino acids or dipeptides was carried out via segment or subsequent peptide coupling. Various methods of peptide chemistry were used. The inhibition constants were determined in fluorimetric microplate enzyme assays with inhibitor concentrations between 0.35-140 µM. In all cases, the substrate Z-Phe-Arg-AMC was used. The irreversibility of inhibition was proven by dialysis assays, and by affinity labelling of CL and falcipain using a biotinylated inhibitor. The alkylation rate constant ki was determined in cases where time-dependent inhibition could be observed. In comparison to epoxysuccinyl peptides the ki -values are lower by three orders of magnitude confirming previous investigations. The Ki values unambiguously show that the compounds exhibit a selectivity for the CL-like enzymes. The order of inhibition potency is RD > CL > FP >>> CB. The most potent inhibitor is 116C (BOC-(S)-Leu-(S)-Azy-(S,S)-Azi(OBn)2) with inhibition constants in the submicromolar and even nanomolar range. Some compounds exhibit selectivity for single enzymes: CL: 517C, 105G, Z-023B, 023A; CB: 034A, 013B; RD: 112C, 222C, 105B, 013A. Compounds 105A and 517G selectively inhibit the parasitic proteases FP and RD. The analysis of the structure-activity-relationship led to the assumption that different binding modes have to exist in dependence on the aziridine ring substituents (benzyl ester, ethyl ester, diacid), of the aziridine nitrogen substituents (Phe-Ala, Leu-Xxx, Gly-Xxx, Xxx = cyclic amino acid), and of the stereochemistry, respectively. First docking experiments, performed in cooperation with Dr. Baumann`s group (Institue of Pharmay and Food Chemistry, University of Wuerzburg), confirm this assumption. Inhibitors containing a Leu-Pro sequence are predicted to bind into the S`-subsites of CL. Since the most striking structural difference between CB and CL-like proteases is found within these S`-subsites the selectivity between the enzymes may be due to binding into these subsites. In contrast, for a Phe-Ala derivative the docking postulates binding into the S-subsites which do not differ much between the enzymes. As a consequence, CB is inhibited much better by Phe-Ala-derivatives than by Leu-Xxx-derivatives. In cooperation with Prof. Engels` group (Institute of Organic Chemistry, University of Wuerzburg) quantumchemical computations were performed analyzing the influence of substituents on the thermodynamics and kinetics of the nucleophilic ring opening. These calculations predicted that substituents stabilizing the transition state (N-formyl) should improve inhibition potency. In order to proof this predicition the compound 008B (N-formyl aziridine-2,3-dicarboxylate) was synthesized and tested. Indeed, the compound is about 5000x more potent on CL than the non-formylated diethyl aziridine-2,3-dicarboxylate. The principal mechanism of inhibition - the nucleophilic ring opening - was proven in a model reaction by means of NMR spectroscopy and mass spectrometry. The biotinylated compound 999C was designed as an affinity labelling inhibitor usable to label and to identify cysteine proteases expressed by Plasmodium falciparum (cooperation with the group of Dr. Gelhaus, Prof. Leippe, Institute of Zoology, University of Kiel).

Die Initiation der DNA-Replikation ist in Eukaryonten ein hochkonservierter Prozess. Zuerst bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsstartpunkte chromosomaler DNA und stellt das Startsignal für die Assemblierung des präreplikativen Komplexes (pre-RC) dar. Anschließend assoziieren die Initiationsfaktoren CDC6 und CDT1 mit dem ORC. Durch die Rekrutierung des MCM-Komplexes wird der pre-RC schließlich vervollständigt. Die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase und die Anlagerung von CDC45 lizensiert den Origin für die DNA-Replikation. Ein Ziel dieser Arbeit war, den vollständigen murinen ORC rekombinant darzustellen. Um den gesamten Komplex durch Copräzipitation zu isolieren, wurden ORC1, 3, 4, 5 und 6 als Wildtyp-Proteine und ORC2 mit einer N-terminalen Poly-His-Domäne mit Hilfe von Baculoviren koexprimiert. Nach der Aufreinigung konnten, mit Ausnahme von ORC3, alle ORC-Untereinheiten in den Elutionsfraktionen immundetektiert werden. Eine Gelfiltration der Fraktionen ließ auf die Isolierung eines 450 kD großen Komplexes schließen, der mindestens fünf der sechs ORC-Untereinheiten enthielt. Dies zeigt, dass der murine ORC als Holokomplex rekombinant isoliert werden kann. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte die Rolle des MCM-Komplexes bei der Termination der DNA-Replikation am 3'-Ende muriner rDNA-Transkriptionseinheiten untersucht werden. Durch polare Replikationsgabelbarrieren im 3'-Bereich der ribosomalen Gene wird über die Kontrahelikaseaktivität von TTF-I die Bewegungsrichtung der Replikation auf die Richtung der Transkription limitiert. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob dies auch bei der murinen MCM4/6/7-Helikase der Fall ist. Um MCM4/6/7-Hexamere zu isolieren, wurden die Untereinheiten MCM4 und 7 in Wildtyp-Form und MCM6 mit einem N-terminal fusionierten HA-Tag mittels Baculoviren koexprimiert. Zur Durchführung der Kontrahelikasestudien musste die Helikaseaktivität der isolierten Komplexe ermittelt werden. Bereits mit kurzen partiell doppelsträngigen M13-Substraten (17 nt) zeigte sich eine geringere Entwindungsfähigkeit als in der Literatur beschrieben. Bei weiteren Helikasestudien wurden DNA-Substrate (30 nt) mit einem 5'-Überhang sowie SSB bzw. RPA eingesetzt. Zwar konnte so eine Steigerung der Helikaseaktivität von MCM4/6/7 verzeichnet werden, jedoch fand diese nicht in ausreichendem Maße statt. Zudem war das entwundene Oligonukleotid einem Abbau unterworfen, dessen Ursache nicht aufgeklärt werden konnte. Aufgrund der zu geringen Helikaseaktivität im Hinblick auf die TTF-I-Kontrahelikasestudien wurden diese Arbeiten eingestellt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Transport von MCM-Proteinen in den Zellkern. Der MCM-Komplex ist in fast allen Organismen konstitutiv im Zellkern lokalisiert. Die Überexpression einzelner exogener MCM-Proteine zeigte allerdings, dass nur MCM2 und 3 mit Hilfe ihrer ihrer NLS-Motive in den Kern transportiert werden, während dies bei MCM4 bis 7 nicht erfolgt. Two-Hybrid-Studien unserer Arbeitsgruppe ließen auf paarweise Wechselwirkungen der MCM4 bis 7-Untereinheiten mit MCM2 bzw. MCM3 schließen. Deshalb wurden EGFP-MCM-Proteine zusammen mit Wildtyp-MCM-Proteinen in Mauszellen koexprimiert. Dabei zeigte sich, dass MCM2 die Proteine MCM4, 6 und 7 in den Kern transportiert, während MCM3 nur MCM5 in den Zellkern einschleust. Weitere Interaktionen zwischen MCM6 und 4 sowie zwischen MCM6 und 7 konnten bei MCM4/6/7-Aufreinigungen beobachtet werden. Zuletzt wurde noch die Lokalisation von CDT1 in der OBR-Region des murinen rDNA-Cistrons untersucht. Bislang wurde nur in S. cerevisiae eine sequenzspezifische ORC-Bindung an ACS-Bereiche identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe konnte im murinen rDNA-Cluster stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes ein Origin charakterisiert und die Bindungstelle verschiedener Initiatorproteine um die Position -2500 eingegrenzt werden. Die Assoziation von CDT1 mit derselben Region würde die Assemblierung eines pre-RC in dem untersuchten Bereich zusätzlich bestätigen. Zur Umsetzung von ChIP-Studien wurden CDT1-Antikörper hergestellt. Um die Assemblierung von CDT1 mit dem Origin in Abhängigkeit des Zellzyklus zu untersuchen, wurden FM3A-Mauszellen in früher G1-, später G1-, G1/S-, S- und in der G2/M-Phase arretiert. Die Auswertung der ChIP-Analysen, die den zu analysierenden Bereich von -2837 bis -1820 umspannten, zeigte, dass CDT1 ausschließlich während der G1-Phase mit dem Chromatin assoziiert ist. Dies ist konsistent mit der Aktivität von CDT1 während des Zellzyklus in Säugern. Der höchste Anteil an DNA-gebundenem CDT1 konnte in dem Bereich -2519 bis -2152 festgestellt werden. Eine Sequenzanalyse des OBR der murinen rDNA lieferte keine Homologie zu anderen bekannten Origins. Jedoch wurden diverse DNA-Strukturelemente, wie z.B. HSS, DUEs oder CpG-Inseln, sowie verschiedene Protein-Bindungsstellen gefunden, die potentiellen Einfluss auf die Festlegung des murinen OBR haben könnten. / The eukaryotic initiation of DNA replication is a highly conserved process. In the first step the binding of the "origin recognition complex" (ORC) to replication origins of chromosomal DNA acts as a start signal for the assembly of the pre-replicative complex (pre-RC). Subsequently the initiation factors CDC6 and CDT1 associate with ORC. The following recruitment of the MCM complex finally completes the pre-RC. The activity of the CDC7/DBF4 kinase and the binding of CDC45 license the origin and allow the initiation of DNA replication. One aim of this work was to purify a recombinant murine ORC. In order to isolate the entire complex by co-precipitation, wild-type ORC1, 3, 4, 5 and 6 and ORC2 that contained a His6 epitope tag at its N-terminus were co-expressed by means of baculoviruses. After the following purification, all ORC subunits with the exception of ORC3 were detected in the isolated fractions by immunoplotting. Analysis of the fractions after gel filtration indicated the isolation of a large complex corresponding to a molecular mass of 450 kD, which contained at least five of the six ORC subunits. Therefore, we assume that the recombinant murine ORC was isolated as a holo-complex. A further part of this work deals with the role of the MCM complex in the termination of DNA replication at the 3' end of murine rRNA transcription units. Polar replication fork barriers in the 3' region of ribosomal genes limit progression of DNA replication to the same direction as rDNA transcription by the contrahelicase activity of TTF-I. In this study it should be determined whether murine MCM4/6/7 helicase activity is impaired in the same manner. In order to isolate hexameric MCM4/6/7 complexes wild-type MCM4 and MCM7 proteins and MCM6 with an N-terminal fused HA epitope tag were coexpressed by means of baculoviruses. For contrahelicase experiments, the helicase activity of the isolated complexes had to be obtained. The unwinding activity of short partial duplex M13-substrates (17 nt) was lower than described in literature. For subsequent contrahelicase studies DNA substrates (30 nt) with a 5' tail as well as SSB or RPA were applied. Though it was possible to increase the helicase activity of MCM4/6/7 by forked DNA substrates, this was not sufficient for our studies. Moreover, the unwound oligonucleotide was subjected to degradation, the cause of which could not be explained. The work on this topic was stopped since the helicaseactivity of MCM4/6/7 was insufficient regarding further TTF-I contrahelikase studies. A further aspect of this work was the transport of MCM proteins into the nucleus. The MCM complex is constitutively located in the nucleus of almost all organisms. However, the overexpression of individual ectopically expressed MCM proteins showed that only MCM2 and 3 are transported into the nucleus due to their NLS motives, while this is not possible for MCM4 to 7. Two-hybrid studies of our group suggested pairwise interactions of MCM4, 6, 5 and 7 with MCM2 and/or MCM3. Therefore, various EGFP-MCM proteins were coexpressed together with wild-type MCM proteins in mice cells. It was shown that MCM2 directs MCM4, 6 and 7 into the nucleus, whereas MCM3 transfers only MCM5 into the nucleus. This behaviour reflects possible pairwise interactions within MCM subcomplexes. Further interactions of MCM6 with MCM4 and MCM7 were observed at MCM4/6/7 purifications described above. Further the cell cycle-dependent localization of CDT1 in the OBR region of the murine rRNA transcription unit was examined. So far only in S. cerevisiae a sequence-specific ORC assembly at the ACS region has been identified. In our group a murine OBR has been characterized upstream to the rDNA transcription start site und the binding site of various initiation factors has been localized around position -2500. The association of CDT1 within the same region would confirm the assembly of a pre-RC. For ChIP studies monospecific antibodies against CDT1 have been produced. In order to examine the cell cycle-dependent assembly of CDT1 within the initiation site, FM3A cells were arrested in early G1 phase, in late G1 phase, at the G1/S transition, in S phase and in the G2/M phase. The evaluation of the ChIP studies, which encompassed the range from -2837 to -1820 revealed, however, that CDT1 is associated with the chromatin exclusively during the G1-Phase. This is consistent with the activity of CDT1 during the cell cycle in mammalian cells. The major part of DNA-bound CDT1 was observed within the range -2519 to -2152. The sequence of the murine OBR exhibits no homology to other origins described in the literature. But sequence analysis revealed various DNA structure elements, e.g. HSS, DUEs or CpG islands, as well as several protein binding sites of potential importance for determination of the murine OBR.

Cystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und für das Überleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, könnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-ungesättigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einer Michael-Reaktion addieren. Als Leitstruktur diente das Diuretikum Etacrynsäure, dessen Struktur an verschiedenen Positionen modifiziert wurde. Der Hauptsyntheseweg kann wie folgt beschrieben werden: Die Acylseitenkette gewünschter Kettenlänge wurde durch Friedel-Crafts-Acylierung in entsprechend substituierte Anisole eingeführt. Diese wurden in einer unmittelbar anschließenden Reaktion zu acylierten Phenolen gespalten, die in einem Folgeschritt mit Bromessigsäureethylester zu acylierten Phenoxyessigsäureethylestern verethert wurden. In diese wurde in a-Position zum Keton eine Doppelbindung eingeführt. Über eine Mannich-Reaktion mit N,N,N’,N’-Tetramethyldiaminomethan/Acetanhydrid oder Urotropin/Acetanhydrid erhält man so die acylierten Phenoxyessigsäureethylester mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Zur Darstellung der entsprechenden ungesättigten Säuren aus den acylierten Phenoxyessigsäureethylestern bedient man sich einer basenkatalysierten Aldokondensation mit Formaldehyd, unter deren Bedingungen der Ethylester zur Säure gespalten wird. Kupplung von Etacrynsäure mit Aminen unter Aktivierung mit DCC/N-Hydroxysuccinimid führte zu den Etacrynsäureamiden. Methylierung der acylierten Phenole und anschließende Mannich-Reaktion dient der Darstellung der acylierten Anisole mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Auf diesem Syntheseweg wurden 28 Derivate mit Michael-System synthetisiert. Diese wurden an den Cystein-Proteasen Papain, Cathepsin B (CB), Falcipain (FP) und Rhodesain (RD) getestet. Gegen Serin-Proteasen wurde keine Hemmung festgestellt. Die meisten Inhibitoren zeigten bei CB, FP und RD eine nicht-zeitabhängige Kinetik der Enzyminaktivierung. Nur bei Papain wurde eine zeitabhängige Kinetik beobachtet. Die Substanzen wurden zwar als irreversible Inhibitoren konzipiert, Dialyseversuche beweisen jedoch eine reversible Hemmung. Da eine Vergleichssubstanz ohne aktivierte Doppelbindung unwirksam ist, kann von einer kovalenten Reaktion mit den Cystein-Proteasen ausgegangen werden. Bestimmt wurden die Dissoziationskonstanten Ki der Enzym-Inhibitor-Komplexe EI als Maß für die Affinitäten der Inhibitoren zum Enzym und, soforn möglich, auch die Alkylierungsgeschwindigkeitskonstanten ki der Reaktion zu modifiziertem Enzym E-I. Eine allgemeine Selektivität für einzelne Enzyme konnte nicht gefunden werden. Die besten Inhibitoren (Ki = 3.2 - 57.5 µM) waren die Etacrynsäureamide. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass wie erwartet das a,b-ungesättigte System essentiell für die Wirksamkeit an Cystein-Proteasen ist, ebenso ein aromatischer Ring. Eine längere Seitenkette an der Doppelbindung, die mindestens einen Ethylrest trägt, sowie zwei benachbarte Halogenatome am aromatischen Ring erwiesen sich als wirkungssteigernd. Ester und Amide zeigten generell bessere Hemmeigenschaften als die freien Säuren. Methoxy-Gruppen am Aromaten hatten keinen Wirkungsverlust zur Folge, senken aber die Löslichkeit in wässrigem Medium. Viel versprechend ist auch der [5-Chlor-2-(2-methylenbutyryl)-phenoxy]-essigsäureethylester, der das a,b-ungesättigte Doppelbindungs-System in ortho-Position zum phenolischen Sauerstoffatom trägt. Innerhalb der Amide sind kurze, voluminöse Reste wie der tertButylrest von Vorteil, eine gewisse Selektivität wird mit langkettigen Amiden wie dem n-Hexylamid für FP gegenüber CB und RD erreicht. Die Verbindungen wurden auf die Wachstumshemmung von grampositiven und gramnegativen Problemkeimen, sowie auf die Hemmung der Biofilmbildung grampositiver Erreger getestet. Bei gramnegativen Keimen wurde das Wachstum nicht gehemmt. Bei den grampositiven Keimen Staphylococcus aureus und S. epidermidis wirkten ebenfalls der Etacrynsäureethylester und das Hexylamid, Benzylamid, Anilid der Etacrynsäure am besten (MHK = 5 - 20 µM). Die genannten Verbindungen zeigten auch die stärkste Hemmwirkung auf die Biofilmbildung (100 % bei 20 - 40 µM bis zu 95 % bei 2.5 - 5 µM an S. aureus). Aufgrund positiver Screeningergebnisse in einem enzymatischen HPLC-Assays an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) wurden Docking-Experimente mit Etacrynsäure-tertbutylamid an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) durchgeführt. Die Ergebnisse führten zur Synthese einer modifizierten Verbindung, die eine geringe Verbesserung der Enzyminhibition im fluorimetrischen Assay zeigte. / Cysteine proteases are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. They are wide-spread in pathogenic parasites as well and are essential for the survival of the pathogens. Compounds which inhibit these proteases could serve as new pharmaceuticals for many therapeutic indications. In the present work non-peptidic cysteine protease inhibitors, which contain an a,b-unsaturated ketone as electrophilic group and which are able to add the cysteine residue of the proteases’ active site in a Michael-type reaction, were synthesized. The diuretic etacrynic acid was used as lead compound, its structure was modified in several positions. The main synthetic pathway is as follows: the acyl side chain of the desired length was introduced in correspondingly substituted anisoles via a Friedel-Crafts acylation. The yielded acylated anisols were cleaved to the acylated phenols in a consecutive reaction. They were transferred to the acylated phenoxy acetic acid esters in a following step with bromo acetic acid ethyl ester. A double bond was introduced into the acylated phenoxy acetic acid esters in a-position of the ketone. The acylated phenoxy acetic acid ethyl esters with an a,b-unsaturated ketone moiety are yielded via a Mannich reaction with N,N,N’,N’-tetramethyl-diaminomethane/acetic acid anhydride or urotropine/acetic acid anhydride. To synthesize the corresponding unsaturated acids out of the acylated phenoxy acetic acid esters a base-catalyzed aldol condensation with formaldehyde in aqueous ethanol is used. Under these conditions the ethyl ester is cleaved to give the free acid. Coupling of etacrynic acid with amines by activation with DCC/N-hydroxy succinic imide led to the etacrynic acid amides. Methylation of the acylated phenols and consecutive Mannich reaction, as described above, leads to the acylated anisols with a,b-unsaturated ketone moiety. Following this synthetic pathway 28 derivatives with a Michael system were synthesized. These compounds were tested in the cysteine proteases papain, cathepsin B (CB), falcipain (FP) and rhodesain (RD). No inhibition of serine proteases was detected. Most of the inhibitors showed non-time-dependent kinetics for enzyme inactivation of CB, FP and RD. Only with papain time-dependent kinetics are observed. Although the compounds were planned as irreversible inhibitors, dialysis assays proved a reversible inhibiton. Since a comparative compound without a double bond is inactive, a covalent reaction with the cystein proteases can be assumed. Dissociation constants Ki of the enzyme-inhibitor-complexes EI were determined as a measurement of the affinities of the inhibitors towards the enzymes, as well as the alkylation velocity constants ki of the reaction yielding the modified enzyme E-I. The latter could be determined only in cases of a time-dependent inhibition. A general selectivity for single enzymes could not be found. The etacrynic acid amides were the best inhibitors (Ki = 3.2 - 57.5 µM). The analysis of the structure-activity relationship showed, as expected, the a,b-unsaturated system being essential for activity in cysteine proteases. The same fact is true for the aromatic ring. A longer side chain next to the double bond, which contains at least an ethyl moiety, as well as two vicinal halogen atoms at the aromatic ring proved to enhance the activtity of the inhibitors. Generally, esters and amides showed better inhibition properties than the free acids. Methoxy groups at the aromatic ring did not result in a loss of inhibition but in a reduced solubility in aqueous media. Compound [5-Chloro-2-(2-methylenebutyryl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester, which carries the a,b-unsaturated double bond system in ortho position to the phenolic oxygen atom, is also promising. Within the amides short voluminous moieties such as the tertbutyl moiety are advantageous. A distinct selectivity for FP against CB and RD can be achieved with long-chain amides such as the n-hexyl amide. The compounds were examined for growth inhibition of gram-positive and gram-negative pathogens as well as for inhibition of biofilm formation of gram-positive pathogens. The growth of gram-negative germs was not inhibited. The gram-positive germs Staphylococcus aureus and S. epidermidis were inactivated best by etacrynic acid ethyl ester and by the n-hexyl amide, the benzyl amide and the anilide of etacrynic acid (MHK = 5 - 20 µM). The mentioned compounds also showed the highest inhibition rate for biofilm formation (100 % at 20 - 40 µM to 95 % at 2.5 - 5 µM in S. aureus). Due to positive screening results in a enzymatic HPLC-assay of human SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro) docking experiments were conducted on etacrynic acid tertbutyl amide. The results led to the synthesis of a modified compound which showed weak improvement of enzyme inhibition in a fluorimetric assay.

Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des für die DNA-Replikation essentiellen präreplikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden. Darüberhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten häufig multinukleäre Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabhängigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Darüberhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli läßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden. / The identification of proteins, which interact with members of the for the initiation of DNA replication necessary prereplicative complex in murine cells was of greatest interest for this work. Thereby, interactions of the heterochromatin protein 1a with the replication proteins ORC1, ORC2 and CDC6 were demonstrated in the two-hybrid system as well as in immunoprecipitations. Furthermore, significant colocalisation of these proteins with HP1a could be observed at heterochromatic regions in murine NIH3T3 cells. In NIH3T3 cells HP1a is also localisized on the centrosome. Knock down of HP1a by siRNAs showed however no direct influence on DNA- replication. Though, a knock down of HP1a resulted in significant defects in cytokinesis and reduced cell proliferation. Thus, frequntly cells with several nuclei and an arrest of the cells in G1 phase could be observed. Furthermore, the influence od phosphorylation of HP1a by Casein kinase II was analysed with phosphorylationssite In contrast to Drosophila cells there were no differences of the localization of Hp1a on heterochromatin in murine NIH3T3 cells. Also interactions of the replication inhibitor Geminin with the replication factors ORC1, ORC2 und CDC7 were found in two-hybrid analyses as well as in immunoprecipitations, which showed several cell cycle dependence. However, in murine NIH3T3 cells a knock down of Geminin showed in contrast to several other cell lines no influences on DNA replication. In a furthe part of this work interactions of the Retinoblastoma protein with ORC2 and MCM7 were observed in two-hybrid experiments as well as in immunoprecipitations.Furthermore, Pescadillo showed interaction with the replication proteins ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 and CDC45 in the two-hybrid system as well as interactions with MCM2 and MCM3 in bioluminescence resonance energytransfer experiments. The coloalization of Pescadillo and ORC6 in nucleoli points to a function of these proteins in ribosome biogenesis. In a further part of this work there were also interactions of the protein E1 of the human Papilloma virus 11 with the replication proteins ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb and Pescadillo observed in two-hybrid screenings.

Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von gespeicherten Nanopartikeln mit weicher Röntgenstrahlung. Dafür wurde eine neue Apparatur aufgebaut. In dieser befindet sich ein dreidimensionaler elektrodynamischer Quadrupolspeicher, mit dem die positiv geladenen Nanopartikel berührungsfrei und ortsfest gespeichert werden. Mit Hilfe eines Streulichtnachweises werden die Eigenbewegungen der Partikel gemessen und daraus das Ladungs- zu Masseverhältnis ermittelt. Durch gezielte Umladung können die absolute Ladung und die Masse der Partikel mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Die gespeicherten Partikel wurden mit Synchrotronstrahlung am Elektronenspeicherring BESSY II untersucht. Bei niedrig geladenen Partikeln wurden Aufladungsexperimente mit variabler Photonenenergie durchgeführt. Dabei kann die Emission von einzelnen Elektronen beobachtet werden. Die totale Sekundärelektronenausbeute wurde für verschiedene Photonenenergien ermittelt. Sie gleicht den Werten, die durch Messungen mit Elektronenbeschuss bekannt sind. Die Partikel wurden weiterhin bis zum maximal erreichbaren Ladungszustand aufgeladen. Dieser Gleichgewichtszustand liegt unterhalb der theoretischen Erwartungen. Bei den hochgeladenen Partikeln wurden nach Abschalten der Synchrotronstrahlung Entladevorgänge beobachtet, die für das verminderte Ladungsgleichgewicht verantwortlich sind. Die Entladung wird als Ionen-Feldemission interpretiert, möglicherweise hervorgerufen durch den elektrischen Durchschlag im Teilchenmaterial. Das Aufladungsverhalten der Partikel bei verschiedenen Ladungszuständen wurde mit Hilfe von Messungen an der O 1s-Kante untersucht. Bei niedrigen Ladungszuständen liefert der Ladestrom die bekannten Röntgenabsorbtionsstrukturen von Siliziumdioxid. Stark geladene Partikel werden dagegen vor allem im Bereich der resonanten O 1s-Anregung durch schnelle Augerelektronen aufgeladen, während Photoelektronen aus dem O 1s-Kontinuum nicht mehr zur Aufladung beitragen. Deren kinetische Energie ist zu gering, um dem Coulombfeld des Partikels zu entkommen. / Subject of this thesis is the investigation of single trapped nanoparticles using soft X-rays. For this purpose a new apparatus has been developed and characterized. The heart of this apparatus is a three-dimensional electrodynamic quadrupole trap that allows us to store charged nanoparticles well located and without any contact to a substrate. The detection of scattered light, which is modulated by the secular motion frequencies of the stored particle, is used to derive the charge-to-mass ratio. The determination of changes in the charge state due to electron emission is used to determine the absolute charge and mass with high accuracy. The particles were studied using synchrotron radiation at the electron storage ring BESSY II. A set of charging experiments were performed, where particles at low charge state were irradiated with different photon energies in the soft X-ray regime. In these experiments the emission of single electrons is observed. The total secondary-electron emission yield is determined at several photon energies. The values are comparable to the secondary emission after electron impact. Other experiments were performed at highest achievable charge state of the particles. This equilibrium state was found to be far below theoretical predictions. For highly charged particles we found a discharge current after the illumination with synchrotron radiation is terminated. This current is responsible for the low equilibrium charge state. The discharge is assumed to result from ion field emission potentially due to the electric breakdown in the particle material. Charging curves at different charges states of the particle in the regime of the oxygen 1s-edge were recorded. At low charge states the characteristic X-ray absorption fine structure of silicon dioxide is observed. Highly charged particles are efficiently charged by resonant Auger processes in the regime of the resonant O 1s-excitation, whereas there is no charging in the regime of the O 1s-continuum. Evidently, the kinetic energy of these electrons is too small to escape from the attractive Coulomb field of the particle.