Einleitung: Die Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GFE 2014) schlägt ein neues Proteinbewertungssystem für Pferdefutter vor, welches eine ausschließlich praecaecale Absorption von Aminosäuren beim Pferd unterstellt. Es nutzt eine futtermittelkundlich-chemische Fraktionierung des Rohproteins (XP). Die Fraktion des fasergebundenen Proteins (NDIXP = Neutral-Detergenzien-unlösliches Rohprotein) repräsentiert den postileal abbaubaren Proteinanteil. Das praecaecal verdauliche Protein (pcvXP) wird aus dem nicht faserassoziierten Protein (NDLXP = Neutral-Detergenzien-lösliches Rohprotein) geschätzt. Das System ermöglicht auf gleiche Weise die Schätzung der praecaecal verdaulichen Aminosäuren. Das neue System basiert auf der Auswertung von Literaturdaten, weshalb eine In-vivo-Validierung bislang ausstehend ist. Ziele der Untersuchungen: Die Arbeit gibt im ersten Teil einen Überblick über die Gehalte von pcvXP in Futtermitteln der täglichen Fütterungspraxis aus den Gruppen Raufutter, Getreide, Leguminosen und fettreiche Samen, sowie Ergänzungsfuttermitteln für Pferde. Die futtermittelkundliche Betrachtung soll die Frage beantworten, ob der Anteil an pcvXP in Abhängigkeit von Protein- und/oder Fasergehalt der Futtermittel zu erwarten ist. Für die In-vivo-Fütterungsstudie im zweiten Teil der Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Unterschiede in der Proteinbewertung von Futtermitteln nach GFE (2014) im Plasma anhand von Unterschieden im postprandialen (ppr) Verlauf der Aminosäure Lysin nachvollzogen werden können, um die futtermittelkundlich-chemische Bewertung in vivo validieren zu können. Tiere, Material und Methoden: Im ersten Teil der Arbeit wurden 71 Futtermittel mittels Weender-Analyse und Faserfraktionierung nach van Soest analysiert und nach dem neuen Proteinbewertungssystem bewertet. Im zweiten Teil der Arbeit wurden 4 der analysierten Futtermittel (LUC = Luzerne, KF = Ergänzungsfutter für Sportpferde, SES = Sojaextraktions-schrot, sAS = kommerzieller Aminosäurenergänzer mit synthetischen Aminosäuren) in einer Fütterungsstudie (Tierversuch TVV 18/15) auf die ppr Veränderungen von Lysin im Plasma von Pferden hin untersucht. Dazu wurde 8 genüchterten, adulten Wallachen randomisiert eine von drei auf Lysin standardisierten Rationen (LUC, KF + SES, KF + sAS) und eine Kontrollration (KF) gefüttert. Bei gleichem Lysin-Gehalt unterschieden sich die Rationen in der Menge an NDIXP. Lysin wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie im Plasma der Pferde zu den Zeitpunkten 0 und 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 und 480 min ppr, sowie in den Fraktionen NDIXP und NDLXP untersucht. Zur statistischen Auswertung kamen nur Werte von Pferden, welche die komplette Ration gefressen hatten. Alle Daten wurden auf Normalverteilung überprüft (Shapiro-Wilks-Test). Futtermittelkundliche Daten wurden auf lineare Regressionen getestet. Das mittlere pcvXP der Gruppen wurde mittels einfacher ANOVA und Bonferroni Korrektur ausgewertet. Die Plasma Lysin-Werte wurden auf die Einflussfaktoren Zeit und Behandlung (ANOVA und Least Significant Difference Test) getestet und die Flächen unter der Kurve verglichen. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Die pcvXP-Gehalte der 71 Futtermitteln korrelierten mit den Gehalten an XP (r = 0,967; p < 0,01), NDLXP-Gehalten (r = 0,701; p < 0,01) und der Faserfraktion der aschefreien Neutral-Detergenzien-Fasern (aNDFom, r = – 0,573; p < 0,01). Im Fütterungsversuch kam es teilweise zur Verweigerung von Testrationen. In vivo konnte ein alimentärer Effekt auf Lysin im Plasma für KF + sAS und KF + SES im Vergleich zur Kontrolle KF gezeigt werden. Der mittlere Anstieg (± SD) vom Nüchternwert (LysX0) zum Maximalwert für Lysin im Plasma (LysMax) fiel für die Fütterung der Kontrollration KF geringer aus (14,4 ± 13,5 %) als für die 3 anderen Testrationen. Der höchste mittlere Anstieg (± SD) von LysX0 zu LysMax war nach der Fütterung von KF + sAS (110 ± 37,6 %) und KF + SES (92,3 ± 47,7 %) zu verzeichnen. LUC führte mit 75,1 ± 33,6 % ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg, der jedoch geringer ausfiel als für KF + sAS und KF + SES. Der LysMax dieser beiden Rationen wurde 60 min ppr detektiert. Für LUC wurde das LysMax jeweils 120 min ppr ermittelt werden. Die mittlere Fläche unter der Kurve (AUC) (± SD) war am geringsten für KF (n = 7; 22.944 ± 9940 µmol × min/l). Die höchste AUC wurde für KF + sAS gemessen (n = 4; 46.262 ± 18.858 µmol × min/l), welche signifikant höher war als für KF (p = 0,042). KF + SES (n = 8; 40.768 ± 15.399 µmol × min/l) ergab eine signifikant höhere mittlere AUC als KF (p < 0,01). Die AUC für LUC (n = 2, 41.809 ± 11.871 µmol × min/l) war der von KF + SES vergleichbar. Schlussfolgerungen: Bekannte „Proteinträger“ wie z.B. Sojaprodukte, werden auch nach dem neuen System als hochwertige Proteinlieferanten bewertet. Die In-vivo-Ergebnisse zweier Pferde nach Fütterung von Luzerne zeigen hohe ppr Lysin-Anstiege im Blut an. Dies lässt auf eine gute Verfügbarkeit des Lysins aus der Luzerne schließen. Das Proteinbewertungssystem stuft jedoch die Luzerne deutlich schlechter ein, als die In-vivo-Ergebnisse vermuten lassen. In vivo gilt ein Einfluss von Kauprozess und Mikrobiota auf die Lysin-Verfügbarkeit aus der Luzerne als wahrscheinlich. Die Erarbeitung von Korrekturfaktoren für Raufutter wie Luzerne im neuen Proteinbewertungssystem (GFE 2014) erscheint sinnvoll.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108 / Introduction: The Society of Nutrition Physiology (GFE 2014) proposed a new protein evaluation system for horsefeeds, assuming solely a preceacal absorption of amino acids in horses. Therefore, the crude protein (CP) is divided into two different chemical fractions. The fraction of the fibre-bound protein (NDICP = Neutral detergent insoluble crude protein) represents the postileal degradable protein fraction. The precaecal digestible protein (pcdCP) is estimated from the non-fibre-bound protein (NDSCP = Neutral detergent soluble crude protein). Similarly, the system allows the estimation of the precaecal digestible amino acids from chemical analysis. Since in vivo validation is still lacking, the new system is still based on the evaluation of literature data. Aim of the study: In the present study, typical feedstuffs such as roughage, grains, legumes and high-fat seeds, as well as complementary feeds for horses were analyzed for the pcdCP content. The aim of the chemical analysis was to answer the question whether the content of pcdCP depended on the protein and/or fibre content of the feeds. In the second part, an in vivo trial should verify the hypothesis, that the differences in the protein evaluation of feeds according to GFE (2014) are reflected in differences in the postprandial (ppr) kinetics of plasma lysine, in order to validate the prediction of pcdCP based on chemical analysis. Animals, material and methods: The 71 feeds were analysed by Weende analysis and fibre analysis according to van Soest. The feeds were evaluated according to the new protein evaluation system. In the second part of the study 4 selected feeds (LUC = lucerne, CF = complementary feed for sport horses, SES = soybean meal solvent extracted, sAS = supplement with synthetic amino acids) were examined in a feeding trial (animal experiment TVV 18/15) for ppr changes of plasma lysine in horses. After an overnight fasting period, 8 adult geldings were randomly fed one of three rations that were standardized according to the lysine content (LUC, SES, sAS) or a control ration (CF). The meals differed in the amounts of NDICP. Before feeding the test meals and 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 and 480 min ppr plasma was analysed for lysine by high performance liquid chromatography, as well the NDICP and NDSCP fractions of the components of the test meals were analyzed for lysine. All data were statistically assessed by a commercial software package (Statistica®). Data were assessed for normal distribution (Shapiro-Wilks test). The nutrient values of the feedstuffs were tested for linear regression to NDICP, NDSCP and pcdCP. Feedstuffs groups were evaluated by one-way ANOVA with Bonferroni correction. Plasma lysine values were analyzed for variance factoring in the effects of diet and postprandial time (ANOVA). Only data from horses who finished the complete test meals were included in the statistical assessment. The Least Significant Difference test was used for post hoc comparison. The areas under the curve (AUC) were calculated and compared (Mann-Whitney-U test). Level of significance was set at p < 0.05. Results: The pcdCP content correlated with the content of CP (N = 71, r = 0.96712; p < 0.001), NDSCP (r = 0.701; p < 0.001) and the fraction of neutral detergent fibres (aNDFom, r = – 0.5733; p < 0.001). In the feeding trial, some test meals were refused by the horses due to a low palatability. In vivo, a feeding effect on plasma lysine could be shown for sAS and SES compared to the control group. The mean increase (± SD) from the basal value LysX0 to the maximum level for plasma lysine LysMax was lower (14.4 ± 13.5 %) after feeding the control diet CF compared to the other 3 diets. The highest increase (mean ± SD) from LysX0 to LysMax was observed after feeding sAS (110 ± 37.6 %) and SES (92.3 ± 47.7 %). LUC also led to a notable increase (75.1 ± 33.6 %) from LysX0 to LysMax, although, less than for sAS and SES. The LysMax of these two diets were detected 60 min ppr. For LUC the LysMax was determined 120 min ppr. The AUC (mean ± SD) was lowest for CF (n = 7; 22,944 ± 9,940 µmol × min/L). The highest AUC was determined for aAS (n = 4; 46,262 ± 18,858 µmol × min/L), which was significantly higher than for CF (p = 0.042). Also, SES (n = 8; 40,768 ± 15,399 µmol × min/L) led to a significantly higher AUC than CF (p < 0.01). The AUC for LUC (n = 2; 41,809 ± 11,871 µmol × min/L) was comparable to SES. Conclusion: Feeds for horses, well-known as 'protein-rich feeds' such as soybean byproducts, have been confirmed as high-quality protein suppliers under the new evaluation system. Since the in vivo results of two horses fed LUC showed a marked increase in ppr plasma lysine in blood, a high availability of lysine from LUC can be assumed. However, the new protein evaluation system estimates the availability of lysine from LUC considerably lower than suggested by the in vivo results. Most likely, the influence of the chewing process and microbiota on lysine availability from LUC needs to be considered in horses. In conclusion, correction factors for roughages such as LUC with respect to the new protein evaluation system for horsefeeds (GFE 2014) seem to be necessary.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Grundlagen der Proteinverdauung beim Pferd 2 2.1.1 Magen 2 2.1.2 Dünndarm 3 2.1.3 Dickdarm 4 2.2 Proteinbewertung von Futtermitteln für Pferde 6 2.2.1 Stickstoffquellen in Pflanzen 6 2.2.2 Analytische Verfahren zur Proteinbewertung 7 2.2.2.1 Rohprotein 7 2.2.2.2 Bewertung des verdaulichen Rohproteins 7 2.2.2.3 Das Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) des Wiederkäuers 7 2.2.2.4 Bewertung des praecaecal verdaulichen Rohproteins 8 2.2.3 In-vivo-Verfahren zur Proteinbewertung 11 2.2.3.1 Verdauungsversuche 11 2.2.3.2 Postprandiale Messung von Aminosäuren im venösen Blut 15 3 Material und Methoden 20 3.1 Versuchsziel 20 3.2 Analytische Proteinbewertung 20 3.2.1 Probenumfang und Probenahme 20 3.2.2 Trockensubstanz und Rohnährstoffe 21 3.2.3 Faserfraktionen nach van Soest 22 3.2.4 Neutral-Detergenzien-unlösliches Protein (NDIXP) und Proteinbewertung nach GFE (2014) 23 3.2.5 Aminosäuren in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP 25 3.3 In-vivo-Proteinbewertung durch Messung postprandial freien Lysins im Plasma 28 3.3.1 Versuchstiere und allgemeine Haltungsbedingungen 28 3.3.2 Versuchsdesign 28 3.3.3 Adaptation und Grundration 29 3.3.4 Testfuttermittel 30 3.3.5 Versuchsrationen 31 3.3.6 Blutentnahmetage 32 3.3.7 Analyse von Totalprotein und freiem Lysin im Plasma 33 3.4 Statistische Methoden 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Futtermittelkundliche Untersuchungsergebnisse 36 4.1.1 Rohnährstoffe der Futtermittelgruppen 36 4.1.2 Proteinbewertung der Futtermittelgruppen 39 4.1.3 Korrelationen ausgewählter Parameter 42 4.1.4 Protein- und Lysin-Bewertung der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 44 4.1.5 Lysin-Gehalte in den Proteinfraktionen NDLXP und NDIXP der Testfuttermittel für den In-vivo-Versuch 45 4.1.6 Protein- und Lysin-Bewertung der Versuchsrationen 46 4.2 In-vivo-Untersuchungsergebnisse 48 4.2.1 Allgemeine Beobachtungen 48 4.2.1.1 Gesundheitszustand der Pferde 48 4.2.1.2 Gewichtsentwicklung 48 4.2.2 Futteraufnahme der Testrationen 48 4.2.2.1 Futteraufnahmezeit 49 4.2.2.2 Lysin-Aufnahme 49 4.2.3 Lysin-Konzentrationen im Plasma 52 4.2.3.1 Nüchternwerte X0 von Lysin im Plasma 52 4.2.3.2 Postprandiale Lysin-Gehalte im Plasma der Pferde nach vollständiger Aufnahme der Testmahlzeiten 53 4.2.3.3 Gehalte im Plasma in Abhängigkeit der Lysin-Aufnahme 56 4.2.3.4 Lysin-Konzentration im Plasma von Pferd 8 58 5 Diskussion 60 5.1 Kritik der Methoden 60 5.1.1 Auswahl der Futtermittel 60 5.1.2 Versuchsaufbau und Untersuchungsmethoden 61 5.1.3 Futteraufnahme 64 5.2 Diskussion der Ergebnisse 64 5.2.1 Analytische Proteinbewertung 64 5.2.2 In-vivo-Untersuchungen 68 5.3 Schlussfolgerungen 73 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 91 9.1 TABELLENVERZEICHNIS 91 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 9.3 TABELLENANHANG 94 10 Danksagung 108

Das Chemokine SDF-1α und sein Rezeptor CXCR4 sind in eine Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Organogenese, der Hämatopoese und der Immunantwort involviert. Die Entdeckung des alternativen SDF-1α-Rezeptors CXCR7 bewirkte eine erneute Untersuchung der Funktion des SDF-1-Systems in diesen Vorgängen. CXCR7 ist in der Lage, je nach Gewebe- oder Zelltyp, als \'Scavenger\'-Rezeptor, Modulator des CXCR4 oder selbstständig aktiver Rezeptor zu agieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern beide Rezeptoren im Verlauf der Entwicklung der Muskulatur exprimiert werden, welche Aufgabe sie dabei übernehmen und ob sich Rückschlüsse auf die Muskelregeneration daraus ableiten lassen. Hierfür erfolgten in vitro-Untersuchungen an C2C12-Zellen und die anschließende Analyse der Expression von CXCR4, CXCR7 und SDF-1α in der sich entwickelnden Gliedmaßenmuskulatur von Wildtyp- und mdx-Mäusen. Die Untersuchung von C2C12-Zellen zeigte in allen Differenzierungsstadien eine detektierbare Menge von CXCR4 und eine zunehmende Expression des CXCR7. Die Behandlung der Zellen mit SDF-1α führte zu einer Phosphorylierung von Erk1/2 und PKCζ/λ und hemmte gleichzeitig deren Differenzierung. Nach einer Blockierung des CXCR4 mit seinem pharmakologischen Antagonist AMD3100 oder nach Hemmung der Expression durch spezifische siRNA blieb die Aktivierung des Signalweges aus und der hemmende Einfluss des SDF-1α auf die Differenzierung verschwand vollständig. Im Gegensatz dazu blieben nach der pharmakologischen Blockierung oder durch siRNA vermittelten Expressionshemmung des CXCR7 alle SDF-1α induzierten Effekte vollständig erhalten. Eine Untersuchung des Signalweges am dritten Tag der Differenzierung zeigte keine Aktivierung von Erk1/2. Ebenso blieb Erk1/2 nach einer Hemmung der Expression des CXCR4 unphosphoryliert. Im Gegensatz dazu fand nach einer Hemmung der Expression des CXCR7 mit spezifischer siRNA erneut eine Aktivierung des Signalweges statt. Weiterhin konnte in vivo festgestellt werden, dass die Expression des CXCR4 in der Muskulatur während der embryonalen Entwicklung am höchsten ist und bereits kurz nach der Geburt stark abnimmt, wenn die sekundäre Muskelentwicklung abgeschlossen ist. Die Expression des CXCR7 hingegen steigt perinatal an und bleibt bis zum Erwachsenenalter bestehen. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass CXCR4 aktiv das Signalgeschehen von SDF-1α in der Myogenese vermittelt und somit zur Differenzierungshemmung von Myoblasten beiträgt. CXCR7 hingegen wirkt als passiver SDF-1α-Scavenger und induziert somit durch eine Modulierung der extrazellulären SDF-1α-Konzentration die Differenzierung. In Übereinstimmung mit der Rolle des SDF-1α-Systems bei der Muskelentwicklung, konnte eine kontinuierliche SDF-1α- Expression im Bindegewebe um pränatale und im Endomysium von postnatalen und adulten Muskelfasern festgestellt werden. Diese SDF-1α-Expression stieg ebenso wie die CXCR4-Expression bei der Analyse der Muskulatur von dystrophin-defizienten Mäusen an und zeigte somit, dass dieses System auch für die Proliferation von Muskelvorläuferzellen in der regenerativen Muskulatur eine wichtige Rolle spielt. Bemerkenswerter Weise hatte diese Muskeldystrophie keinen Einfluss auf die Expression des CXCR7 und beeinflusst vermutlich dessen Funktion über einen anderen Mechanismus. Durch die offensichtlich enge Kontrolle von Muskelentwicklung und Regeneration durch CXCR4, CXCR7 und deren Liganden SDF-1α, bilden diese ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für bestimmte Muskelerkrankungen. / The chemokine, SDF-1α, and its receptor, CXCR4, are assumed to control a multitude of biological processes such as organogenesis, haematopoesis, and immune responses. The previous demonstration that SDF-1α additionally binds to the chemokine receptor, CXCR7, currently urges a re-evaluation of the function of the SDF-1 system in these processes. In fact, depending on the tissue and cell type, CXCR7 either acts as a scavenger receptor, a modulator of CXCR4 or an independent active receptor. This thesis is dedicated to answer the following questions: Are both SDF-1α receptors expressed during muscle development? What is the actual function of these receptors during myogenesis? Is there a role of the SDF-1 system in muscle regeneration? To adress these issues both in vitro studies with the myoblast cell line, C2C12, as well as in vivo analyses on the expression of CXCR4, CXCR7 and SDF-1α in developing and regenerating limb muscles have been performed. At all stages of differentiation, C2C12 cells exhibited measurable amounts of CXCR4. In addition, in the course of differentiation C2C12 cells showed increasing expression levels of CXCR7. Treatment of the cells with SDF-1α resulted in the phosphorylation of Erk1/2 and PKCζ/λ and subsequently blocked their myogenic differentiation. Following inactivation of CXCR4 either by its antagonist, AMD3100, or by specific siRNA, SDF-1α failed to activate both pathways and in addition no longer inhibited the myogenic differentiation of C2C12 cells. By contrast, inactivation of CXCR7 remained without effects on SDF-1α-induced cell signalling and resulting inhibitory effects on myogenic differentiation. Interestingly, SDF-1α also failed to activate Erk1/2 signalling in differentiated C2C12 cells. Cell signalling in differentiated C2C12 cells was, however, restored following inhibition of CXCR7 expression, but not following inhibition of CXCR4 expression. The in vivo analysis further revealed that in limb muscles expression of the CXCR4 is highest during embryonic development with a decrease in expression levels shortly after birth when secondary muscle development is completed. Vice versa, expression levels of CXCR7 increased perinatally and remained high into adulthood. In summary, these findings unravel that CXCR4 actively mediates SDF-1α-signalling during myogenesis. The findings further provide evidence that CXCR7 acts as a scavenger receptor during myogenesis which controls myogenic differentiation by modulating extracellular SDF-1α concentration. In further agreement with a major role of SDF-1α in muscle development, SDF-1α is continously expressed by the endomysium of postnatal and adult muscle fibers. Moreover, expression of SDF-1α as well as CXCR4 is massively increased in muscles of dystrophin-deficient mice further implying that the SDF-1 system plays an equally important role during muscle development and regeneration. The pivotal role of SDF-1α in muscle development and regeneration points to the SDF-1 system as a promising therapeutical target for certain muscle diseases.

Bei der Infrarot-Thermographie handelt es sich um eine nicht invasive, schnelle, berührungslose, bildgebende Methode zur Messung der Wärmestrahlung von Oberflächen, die bereits bei einigen veterinärmedizinischen Fragestellungen zum Einsatz gekommen ist. Ziel der Studie war es, die Oberflächentemperaturen im Kopfbereich von weiblichen Deutsch-Holstein Kälbern um den Enthornungszeitraum mittels Thermographie darzustellen und zu prüfen, welchen Einflussfaktoren die thermographischen Messungen unterlegen sind. Hierfür wurden acht Lokalisationen im Kopfbereich (linkes Auge (liAu), rechtes Auge (reAu), linke Hornanlage (liHa), rechte Hornanlage (reHa), Flotzmaul (FM), Schleimhaut des Flotzmauls (SHFM)) von gesunden, weiblichen Deutsch-Holstein Kälbern mit einer High-End Wärmebildkamera (ThermoPro TP8, Firma DIAS Infrared GmbH) im Rahmen eines standardisierten Studienprotokolls thermographisch untersucht. Die statistische Auswertung pro Merkmal erfolgte mit SAS, Vers.9.4. Die Umgebungstemperatur hatte den größten Einfluss auf die Oberflächentemperaturen (Regressionskoeffizienten von 0,10 bis 0,32; p < 0,01). Die Luftfeuchtigkeit wirkte sich nicht auf die Messergebnisse aus (p > 0,33). Die rektal erfasste Körperinnentemperatur korrelierte nur schwach mit den thermographisch ermittelten Oberflächentemperaturen. Hingegen konnte mit zunehmendem Alter der Tiere ein Abfall der Oberflächentemperaturen beobachtet werden (Regressionskoeffizienten von – 0,42 bis – 0,14; p < 0,01). Die Wiederholbarkeit der unmittelbar aufeinanderfolgenden thermographischen Doppelmessungen pro Lokalisation war sehr gut (r > 0,95). An den verschiedenen Lokalisationen wurde Wärme in unterschiedlichem Maße emittiert, wobei die Augen die höchsten und das Flotzmaul die niedrigsten Oberflächentemperaturen aufwiesen. Die paarigen Lokalisationen (liAu:reAu, liHA:reHa) wiesen ein symmetrisches Wärmestrahlungsmuster auf. Unter Beachtung der genannten Einflussfaktoren konnte direkt nach Abnahme des Brenners an den Ha der Kälber nach thermE eine Maximaltemperatur von ca. 67 °C ermittelt werden. Fünf und 30 Minuten nach dem Eingriff kam es zu einem signifikanten Temperaturabfall an den Ha der Tiere nach thermE, während die Oberflächentemperaturen der anderen Lokalisationen bei den Kälbern beider Gruppen im Vergleich zum Ruhewert anstiegen (p < 0,01). Zu den Messungen 60, 90 und 120 Minuten kam es weiterhin zu einem stetigen Temperaturanstieg (UliHa, liAu, FM, SHFM, reAu, UreHa) bzw. einem Temperaturplateau (liHa, reHa). Vier, spätestens acht Stunden nach Enthornung war das Niveau des Ruhewertes an allen Lokalisationen (exkl. FM, SHFM) wieder erreicht. Aufgrund des analogen Verlaufs der Oberflächentemperaturen der vorliegenden Studie mit dem Verlauf der Kortisolkonzentration im Blut von thermisch enthornten Kälbern ähnlich angelegter Studien lässt sich vermuten, dass es sich dabei um eine perioperative Stressantwort handeln könnte. Weitere Untersuchungen sind nötig, um einen möglichen Einsatz der Thermographie zur nicht invasiven Stressevaluierung zu prüfen.:1. Einleitung 1 2. LITERATURÜBERSICHT 3 2.1. Hornwachstum und Unterschiede in der Hornausbildung 3 2.2. Innervation der Hornanlagen 3 2.3. Enthornung 4 2.3.1. Definition und Methoden der Enthornung 4 2.3.2. Gründe für Enthornung 5 2.3.3. Alternativen zur Enthornung 6 2.3.3.1. Haltung behornter Rinder 6 2.3.3.2. Zucht auf Hornlosigkeit 6 2.4. Schmerz und Stress 7 2.4.1. Schmerz und Stress bei Rindern 7 2.4.2. Stress ausgelöst durch den Umgang mit Menschen 8 2.4.3. Durch den Stressor Enthornung ausgelöste Schmerz- und Stressantwort 9 2.4.4. Schmerz- und Stressevaluierung während der thermischen Enthornung 9 2.5. Thermographie 11 2.5.1. Prinzip der Thermographie 11 2.5.2. Einflussfaktoren auf die Thermographie unter Stallbedingungen 12 2.5.2.1. Vom Tier ausgehende Einflussfaktoren 13 2.5.2.2. Von außen einwirkende Einflussfaktoren 13 2.5.2.3. Einfluss der Aufnahmetechnik 13 2.5.3. Thermographie in der Veterinärmedizin 14 2.5.4. Thermographie bei Rindern 14 2.5.5. Thermographie zur Überwachung der thermischen Enthornung 16 2.5.6. Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 16 3. Material und Methoden 18 3.1. Auswahl der für die Durchführung der Studie zu verwendenden Wärmebildkamera 18 3.1.1. Kriterien für den Einsatz einer Wärmebildkamera am Tier unter Stallbedingungen 18 3.1.2. Pro- und Contra-Kriterien 19 3.1.3. Technische Daten der Wärmebildkameras testo882 und ThermoPro TP8 21 3.1.4. Vorversuch mit den Wärmebildkameras testo882 und ThermoPro TP8 22 3.1.5. Schlussfolgerung und Entscheidung 23 3.2. Protokoll für die standardisierte Erstellung qualitativ hochwertiger Thermogramme 23 3.2.1. Position von Wärmebildkamera und Kalb 23 3.2.1.1. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen an den Augen 24 3.2.1.2. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen am Flotzmaul und der Maulschleimhaut 25 3.2.1.3. Standardisierte Erstellung von Thermogrammen an den Enthornungsstellen und deren Umgebung 25 3.2.2. Optimale Fokussierung 26 3.2.2.1. Thermogramme der Augen 26 3.2.2.2. Flotzmaul und Maulschleimhaut 26 3.2.2.3. Enthornungsstellen und deren Umgebung 26 3.2.3. Schlussfolgerung zur Erstellung qualitativ hochwertiger Thermogramme 26 4. Publikation 1 27 5. Publikation 2 38 6. Diskussion 50 6.1. Diskussion des Studienprotokolls 50 6.1.1. Auswahl der Lokalisationen 50 6.1.1.1. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen an den Augen 50 6.1.1.2. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen am Flotzmaul und der Maulschleimhaut 51 6.1.1.3. Thermographische Erfassung der Oberflächentemperaturen an den Hornanlagen und deren Umgebung 51 6.1.1.4. Abschließende Beurteilung der Messbarkeit der Oberflächentemperaturen an den Lokalisationen 52 6.1.2. Auswahl der Messzeitpunkte 52 6.1.2.1. Ruhewerte vor der thermischen Enthornung 53 6.1.2.2. Kurzfristige Auswirkungen der thermischen Enthornung 53 6.1.2.3. Langfristige Auswirkungen der thermischen Enthornung 54 6.1.2.4. Schlussfolgerung 54 6.1.3. Einflussfaktoren 55 6.1.3.1. Einfluss der Aufnahmetechnik 55 6.1.3.1.1. Abstand zwischen Kamera und Lokalisation am Kopf des Kalbes 55 6.1.3.1.2. Winkel zwischen Kamera und Lokalisation am Kopf des Kalbes 55 6.1.3.2. Von außen einwirkende Faktoren 55 6.1.3.2.1. Umgebungstemperatur 55 6.1.3.2.2. Luftfeuchtigkeit 56 6.1.3.2.3. Sonneneinstrahlung 56 6.1.3.3. Vom Tier ausgehende Einflussfaktoren 57 6.1.3.3.1. Stress 57 6.1.3.3.2. Zirkadiane Rhythmik 57 6.1.3.3.3. Alter der Tiere 57 6.1.3.3.4. Innere Körpertemperatur (IKT) 58 6.1.3.4. Schlussfolgerung 58 6.2. Hitzeentwicklung im Kopfbereich 59 6.2.1. Hitzeeinwirkung durch die thermische Enthornung 59 6.2.2. Evaluierung hitzebedingter Schmerzen 59 6.2.3. Thermische Enthornung und Schmerzmanagement 60 6.2.3.1. Hintergrund zur Entscheidung der thermischen Enthornung ohne multimodales Schmerzmanagement 60 6.2.3.2. Ergebnisse, die durch die Einbeziehung einer Kontrollgruppe generiert werden konnten 60 6.3. Negative Auswirkungen durch fehlerhafte thermische Enthornung 61 6.4. Potentielle Möglichkeiten des Einsatzes der Wärmebildkamera in der Kälberhaltung 62 6.4.1. Stressmonitoring 62 6.4.2. Gesundheitsmonitoring 63 7. Zusammenfassung 66 7.1. Einleitung 66 7.2. Ziele der Untersuchungen 66 7.3. Tiere, Material und Methoden 66 7.4. Ergebnisse 67 7.5. Schlussfolgerung 67 8. Summary 68 8.1. Introduction 68 8.2. Objectives 68 8.3. Animals, Materials and Methods 68 8.4. Results 69 8.5. Conclusions 69 9. Literaturverzeichnis 70 10. Danksagung 82

Einleitung
 Defekte des hyalinen artikulären Knorpels führen häufig zur Ausbildung einer Arthrose, weshalb deren Therapie überaus wichtig ist. Ein vielversprechender Ansatz dafür ist das Tissue Engineering (T.E.) eines zonal aufgebauten Knorpelkonstrukts. Für die Verbindung eines solchen Konstrukts mit dem subchondralen Knochen des nativen Gewebes ist eine untere mineralisierte Knorpelzone von besonderer Bedeutung. Bisher ist es nicht gelungen die Mineralisation in vivo ohne Bildung von Knochengewebe und ohne längere In-vitro-Vorkultivierung auf die untere Zone zu beschränken. Um eine ausreichende Produktion von Extrazellularmatrix (EZM) bis zur Defektfüllung gewährleisten zu können ist die Formstabilität eines solchen Konstrukts ebenfalls wichtig. Ziele der Untersuchung
 Ziel dieser Studie war es, ein formstabiles bizonales Knorpelersatzgewebe mit einer oberen hyalinartigen Zone und einer unteren hypertrophen Knorpelzone zu generieren, bei dem sich die Mineralisation in vitro und in vivo auf die untere Zone beschränkt und die Bildung von Knochengewebe verhindert wird. Außerdem sollte die zonale Entwicklung so weit wie möglich in vivo ohne längere vorherige In-vitro-Kultivierung von statten gehen. Tiere, Material und Methoden
 Für die Herstellung von Knorpel-T.E.-Konstrukten wurde das Bioprinting von porzinen artikulären Chondrozyten (pACs) und porzinen Mesenchymalen Stromazellen (pMSC) etabliert (pAC: n=3, pMSC: n=4). Anschließend wurden nicht-zonale und zonale gedruckte Konstrukte mit gegossenen Konstrukten verglichen. Als Trägermaterial wurde starPEG/Heparin- (7,5x106 Zellen/ml, 50 % abbaubar, gedruckt: 19 μl, gegossen: 30μl) bzw. Fibrin-Hydrogel (7,5x106 Zellen/ml, gegossen: 30 μl) verwendet (nicht-zonal: n=2, zonal: n=3 bzw. 6). Als Alternative zum Einsatz eines Hydrogels für die untere Zone wurde die Herstellung Hydrogel-freier selbstkondensierter pMSC-Knorpelscheiben in der Transwellkultur (TWK) etabliert und ihr Potential zur hypertrophen Differenzierung untersucht. Anschließend wurde die In-vitro-Mineralisationskapazität der Knorpelscheiben (0,5x106 pMSC) mittels 5 verschiedenen Mineralisationsmedien über 4, 6 und 8 Wochen hinsichtlich der Mineralablagerung und des Erhalts der knorpeligen EZM getestet (n=6). Das Medium mit den besten Ergebnissen wurde für die In-vitro-Kultivierung der unteren Zone der zonalen Konstrukte verwendet. Zur Etablierung der In-vitro-Herstellung der oberen Zone wurden pAC-haltigen starPEG-Heparin- und Fibrin-Hydrogele in konventioneller und TW-Kultur über 6 Wochen chondrogen kultiviert (n=8/9). Zusammenfassung Zonale Konstrukte, bestehend aus einer unteren Knorpelscheibe (0,5x106 pMSC) und einem oberen pAC-haltigen Hydrogel (45μl, 20x106 pACs) aus gegossenem starPEG/Heparin (100 % abbaubar) bzw. Fibrin reiften anschließend über 6 Wochen sowohl unter In-vitro-Bedingungen in der TWK als auch nach subkutaner Implantation in 9 Mäusen (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl) aus (n=9). Dabei wurde die Formstabilität, die Ablagerung von Kollagen Typ II, die Hypertrophie, der Mineralisationsgrad sowie die Beschränkung der Mineralisation auf die untere Zone mittels Vermessungen der Form, histologischen Färbungen und μCT-Scans untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U Test mit anschließender Bonferroni-Korrektur (SPSS 22.0.0.0). Als statistisch signifikant wurden dabei Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 angesehen. Ergebnisse
 Mittels Bioprinting von pMSC und pACs in starPEG/Heparin konnten stabile Hydrogele hergestellt werden. Das Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogel zeigte allerdings keinen Vorteil gegenüber dem Gießen. Sowohl die gedruckten als auch gegossenen zonalen und nicht-zonalen Konstrukte zeigten eine mangelhafte Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC in starPEG/Heparin-Hydrogel. Fibrin-Hydrogel förderte die Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC, zeigte allerdings eine Kontraktion während der Kultivierung. Für die Herstellung von selbstkondensierten Knorpelscheiben aus pMSC als Alternative für die untere Zone hat sich das Waschen der Zellen in Phosphat- gepufferter Salzlösung (PBS) nach Monolayerkultur, die Verwendung von 0,5x106Zellen pro Transwell-Insert gelöst in PBS, die Kultivierung in 0,5 ml chondrogenem Medium (CHO) ohne TGF- β1 über die ersten 3 Tage im unteren Kompartiment und anschließender Kultivierung in 2 ml CHO mit 10 ng/ml TGF-β1 für weitere 18 Tage als optimal erwiesen. Mittels Kultivierung der Knorpelscheibe in Hypertrophen Medium konnte ein hoher Proteoglykangehalt und eine homogene Kollagen Typ X-Verteilung innerhalb der Knorpelscheiben erreicht werden. Für die in-vitro- Kultivierung der pAC-haltigen starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogele wurde in der TWK eine bessere Formstabilität erreicht als in der konventionellen Kultur. Innerhalb der zonalen Konstrukte erreicht das Fibrin-Hydrogel eine bessere Formstabilität sowie eine höhere Mineralisationsstärke der unteren Zone unter In-vitro-Bedingungen als das starPEG/Heparin. Unter In-vivo-Bedingungen blieb die Mineralisation nur bei den starPEG/Heparin-Konstrukten auf die untere Zone beschränk. Die obere Zone der Fibrin-Hydrogele wurde unter In-vivo-Bedingungen vor der Explantation zu einem Großteil abgebaut. Die Mineralisation der unteren Zone sowie die Matrixablagerung in der oberen Zone eines bizonalen Knorpelersatzgewebes ist ohne vorherige In-vitro-Vorkultur unter der Verwendung des starPEG/Heparin-Hydrogels in dieser Arbeit gelungen. Schlussfolgerung
 Die Herstellung eines relativ formstabilen bizonalen Knorpelersatzgewebes mit einer oberen hyalinartigen nicht-mineralisierten und einer unteren mineralisierten Zone ohne Ausbildung von Knochengewebe konnte in dieser Studie erreicht werden. Dabei eignet sich die aus pMSC generierte Knorpelscheibe als untere Zone. Für die obere Zone ist ein pAC-haltiges starPEG/Heparin-Hydrogel aufgrund seiner Eigenschaft, die eine Mineralisation unterbindet, besonders vielversprechend. Fibrin-Hydrogel erwies sich, aufgrund des zu schellen Abbaus in vivo, als ungeeignet für die obere Zone zonaler Konstrukte. Da die Mineralisation der unteren Zone und die Matrixablagerung der oberen Zone nachweislich komplett in vivo stattfinden kann, ist eine vorherige In-vitro-Kultur der zonalen Konstrukte nicht notwendig.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Knorpelgewebe 2.1.1 Histogenese von Knorpelgewebe 2.1.2 Aufbau des Knorpelgewebes 2.1.3 Arten von Knorpelgewebe 2.2 Knorpeldefekte im Gelenk 2.2.1 Ursache, Einteilung und Auswirkung von Knorpeldefekten 2.2.2 Therapie von Knorpeldefekten 2.3 Knorpel-Tissue Engineering 2.3.1 Zellen im Knorpel-Tissue-Engineering 2.3.2 Trägermaterialien 2.3.3 Wachstumsfaktoren 2.3.4 Bioprinting 2.3.5 Zonales Knorpel-Tissue-Engineering 2.4 Tiermodell Maus 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 2.5.1 Problemstellung 2.5.2 Zielsetzung 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung 3.1.2 Ektope Konstruktimplantation 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Zellbiologische Methoden 3.3.2 Bestimmung des Mineralisierungsgrades der Konstrukte (Micro-CT) 3.3.3 Bestimmung von Durchmesser und Dicke der Konstrukte 3.3.4 Histologische Untersuchungen 3.3.5 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Differenzierungspotential porziner mesenchymaler Vorläuferzellen (pMSC) 4.2 Etablierung des Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 4.3 Matrixablagerung von pACs in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen 4.4 Chondrogenes Differenzierungspotential von pMSC in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen unter verschiedenen Medien- Supplementierungen 4.5 Vergleich gedruckter und gegossener zonaler starPEG/Heparin-Hydrogele mit gegossenen zonalen starPEG/Heparin-Fibrin-Hydrogelen 4.6 Etablierung der Herstellung der unteren Knorpelzone aus pMSC durch Selbstkondensation in Transwellkultur 4.7 In-vitro-Mineralisation von pMSC-haltigen Knorpelscheiben in verschiedenen Mineralisationsmedien 4.8 Etablierung der Herstellung der oberen Knorpelzone: EZM-Ablagerung und Formstabilität 4.9 Charakterisierung von in vitro generierten zonalen Knorpelkonstrukten 4.10 Charakterisierung zonaler starPEG/Heparin- und Fibrin-Konstrukte nach In-vivo-Reifung 5 Diskussion 5.1 Bioprinting nicht-zonaler und zonaler starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 5.2 Etablierung der Herstellung selbstkondensierender formstabiler Knorpelscheiben aus pMSC 5.3 Effekte verschiedener Mineralisationsmedien auf die Matrixablagerung von pMSC in Knorpelscheiben 5.4 Etablierung der Herstellung und In-vitro-Kultivierung der oberen Knorpelzone: EZM- Ablagerung und Formstabilität 5.5 In-vitro-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.6 In-vivo-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.7 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Methoden Bioprinting (zusätzliche Informationen) 9.2 Übersicht der Teilversuche zur Etablierung von Knorpelscheiben aus pMSC 9.3 Materialien 10 Danksagung

Einleitung: Aliarcobacter (A.) cryaerophilus und Aliarcobacter butzleri gelten weltweit als lebensmittelbedingte und zoonotische Krankheitserreger, die vorrangig über kontaminierte Lebensmittel oder Trinkwasser übertragen werden. Beim Menschen stellt sich die Infektion meist als selbstlimitierende Enteritis dar, wohingegen sie bei Tieren neben gastrointestinalen Erkrankungen mit Mastitiden, Aborten und Reproduktionsstörungen assoziiert wird. Aufgrund der engen Verwandtschaft mit den thermophilen Campylobacter spp., deren antimikrobielle Resistenz in den letzten Jahren einen starken Anstieg verzeichnet, ist es wichtig, das Resistenz- und Virulenzprofil dieser beiden Spezies zu untersuchen. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Antibiotikaresistenz sowie die Ermittlung der Virulenzprofile von Aliarcobacter cryaerophilus- und Aliarcobacter butzleri-Stämmen, die aus Kotproben von Wassergeflügel aus Thüringen isoliert worden waren. Tiere, Material und Methoden: In die Untersuchung gingen insgesamt 250 Kotproben von 135 Gänsen, 45 Flugenten, 40 Mularden und 30 Pekingenten ein, die in den Jahren 2016 und 2017 von zehn verschiedenen Wassergeflügel-Betrieben in Thüringen, Deutschland, gesammelt und auf Aliarcobacter spp. untersucht wurden. Die mit MALDI-TOF MS und multiplex-PCR identifizierten Aliarcobacter-Isolate wurden anschließend mithilfe des Epsilometertest (E-Test) auf ihre antimikrobielle Empfindlichkeit gegenüber acht verschiedenen Antibiotika getestet. Nach der DNA-Isolierung und Gesamtgenom-Sequenzierung wurde die phylogenetische Verwandtschaft sowie die Anwesenheit von potentiellen Resistenz- und Virulenzgenen mit Hilfe bioinformatischer Programme untersucht. Ergebnisse: Aus 55 Aliarcobacter-positiven Kotproben wurden mittels MALDI-TOF MS und multiplex-PCR 27 A. cryaerophilus- und 47 A. butzleri-Isolate identifiziert. Die hier untersuchten A. cryaerophilus-Stämme gehören dem Cluster I und somit dem Genomovar A. cryaerophilus gv. pseudocryaerophilus an. Zusätzlich wurde durch die phylogenetischen Untersuchungen deutlich, dass beide Aliarcobacter-Spezies eine hohe genetische Diversität aufweisen. Gleichzeitig bildeten einige A. cryaerophilus- und A. butzleri-Isolate Untergruppen. In diesen waren die einzelnen Bakterienstämme, welche zum Teil aus unterschiedlichen Betrieben stammten, nur wenige Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) voneinander entfernt. Die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit offenbarte, dass allen 74 Aliarcobacter-Isolaten die Cefotaxim-Resistenz gemein war. Ferner waren mehr als drei Viertel der Aliarcobacter-Stämme resistent gegen Streptomycin. Die 27 A. cryaerophilus-Stämme zeichneten sich durch eine Empfindlichkeit gegenüber Erythromycin, Gentamicin sowie Ampicillin und somit durch ein homogenes Resistenzprofil aus. Im Gegensatz dazu zeigten die 47 A. butzleri-Stämme ein heterogenes Resistenzprofil. Während die A. butzleri-Stämme eine deutlich höhere Resistenzrate gegenüber den Tetracyclinen aufwiesen, waren die A. cryaerophilus-Stämme vermehrt gegen Ciprofloxacin resistent. In beiden Aliarcobacter-Spezies wurde ein großes Arsenal an potentiellen Resistenzgenen identifiziert. Neben mehreren Effluxpumpen wurden verschiedene β-Laktamase-Gene sowie die bekannte Ciprofloxacin-Resistenz vermittelnde Punktmutation an Position 254 in der Chinolon-Resistenz-bestimmenden Region im gyrA-Gen detektiert. Des Weiteren wurde eine Vielzahl an potentiellen Virulenzgenen in beiden Aliarcobacter-Spezies ermittelt. Zum Repertoire gehören unter anderem ein komplettes Chemotaxis-System, ein Urease-Cluster, mehrere Flagellum-Gene sowie ein Lipid-A-Cluster. Schlussfolgerungen: Obwohl die untersuchten Isolate auf eine Region (Thüringen), einen bestimmten Wirtstyp (Wassergeflügel) und eine kurze Studienzeit (2 Jahre) begrenzt waren, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf ein hohes Maß an genetischer Diversität unter den A. cryaerophilus- und A. butzleri-Stämmen hin. Dabei ist die Stammdiversität innerhalb beider Spezies unabhängig von der geographischen Lage, dem Ursprung der Isolate und der Wirtsart. Aliarcobacter-Isolate, die aus dem selben Betrieb stammen, wurden aufgrund ihrer klonalen Verwandtschaft der gleichen Untergruppe zugeordnet. Die Existenz phylogenetisch ähnlicher Stämme aus mehreren Betrieben, weist auf eine mögliche epidemiologische Verbindung zwischen den einzelnen Betrieben hin. Durch die Untersuchungen wurde deutlich, dass auf die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit zugunsten der genotypischen Resistenzbestimmung nicht verzichtet werden kann, da der Genotyp nur in einem beschränken Umfang mit der phänotypischen Charakterisierung übereinstimmt. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit einer bekannten Mutation im gyrA-Gen und der phänotypischen Ciprofloxacin-Resistenz konnte nur bei den A. butzleri-Stämmen festgestellt werden. Die im Rahmen dieser Studie erstellte Resistenz- und Virulenzdatenbank, ermöglicht eine unkomplizierte Bestimmung des genotypischen Resistenz- und Virulenzprofiles von A. butzleri-Stämmen.

Einleitung: Coxiella burnetii ist ein gramnegatives und obligat intrazelluläres Bakterium und Erreger der meldepflichtigen Zoonose Q-Fieber. Den Hauptübertragungsweg stellt die Inhalation infizierter Stäube dar, aber auch Zecken werden seit der Isolation des Pathogens aus der Spezies Dermacentor andersonii als Vektoren diskutiert. Es liegen jedoch keine gesicherten Berichte über Infektionen des Menschen durch Zecken oder eine Beteiligung von Vektoren bei Q-Fieber-Ausbrüchen vor. Zudem steht durch die genetische Nähe zu überwiegend apathogenen Endosymbionten die Spezifität molekularer Untersuchungsmethoden in Frage, wodurch die Relevanz von Zecken in der Übertragung von Q-Fieber in der Literatur kontrovers diskutiert wird. Ziele der Untersuchung: Es sollten mithilfe einer systematischen Literaturanalyse die Daten zur Prävalenz von C. burnetii in Zecken in Europa dargelegt werden. Zudem sollte mittels eines in-vitro-Fütterungssystems untersucht werden, inwieweit die heimischen Spezies Ixodes ricinus und Dermacentor marginatus den Erreger aus dem Blut aufnehmen und ausscheiden, sowie ob das Bakterium transstadial in I. ricinus übertragen wird, wodurch Aussagen über die Vektorkompetenz dieser Arten möglich sind. Tiere, Material und Methoden: Im experimentellen Ansatz wurde die Infektion der Zecken in einem Silikonmembran-basierten Fütterungssystem mit heparinisiertem Rinderblut vorgenommen. Die Gruppengrößen betrugen 7-9 Weibchen mit fünf Männchen oder 50-60 Nymphen. Es wurden verschiedene Konzentrationen C. burnetii Nine Mile RSA439 Phase II eingesetzt: 10^4 (zwei Gruppen adulte I. ricinus), 10^5 (zwei Gruppen adulte I. ricinus) und 10^6 (fünf Gruppen adulte I. ricinus, vier Gruppen adulte D. marginatus, drei Gruppen I. ricinus Nymphen) Genomäquivalente (GE)/ml Blut sowie insgesamt sieben Negativkontrollgruppen. Zudem wurden vier Gruppen adulte I. ricinus für 36 Stunden zu Beginn der Fütterung mit 10^6 GE C. burnetii/ml infiziert und anschließend mit sterilem Blut gefüttert. Täglich wurde Zeckenkot entfernt, zudem wurden adulte I. ricinus zu unterschiedlichen Zeitpunkten während oder nach der Fütterung entnommen. Die Proben wurden nach DNA-Extraktion mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) auf das C. burnetii-Gen icd untersucht. Ein Teil (n = 46) der infizierten Nymphen wurde vor bzw. nach der Häutung mittels qPCR untersucht. Ein anderer Teil (acht Weibchen in zwei Gruppen) wurde nach der Häutung erneut auf sterilem Blut gefüttert. Dabei wurden Kot sowie Blut getestet. Weiterhin fand in L929-Zellen und axenischem Medium eine Anzucht von C. burnetii aus einem Filtrat des Zeckenkots sowie aus dem Filtrat eines qPCR-positiven Weibchens statt, welches sich von einer zuvor infizierten Nymphe gehäutet hatte. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SPSS V 22.0, wobei je nach Voraussetzung der t-Test, der Mann-Whitney-U-Test sowie der Chi²-Test nach Pearson verwendet wurden. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p < 0,05 festgelegt. Ergebnisse: Im Fütterungssystem haben 49 % der adulten I. ricinus und 29 % der D. marginatus vollständig gesaugt. Die Häutungsrate der I. ricinus Nymphen betrug 92 %. I. ricinus-Weibchen nahmen den Erreger auf, welcher innerhalb von sieben Wochen in einer Konzentration von ca. 10^3 GE/mg in den Zecken nachweisbar war. Eine Ausscheidung von infektiösen C. burnetii mit dem Kot wurde bei adulten Zecken ab einer Konzentration von 10^5 GE/ml im verfütterten Blut festgestellt. Dabei erfolgte in allen Versuchen mit beiden Zeckenspezies eine signifikant höhere Ausscheidung von C. burnetii an den Tagen 10-13, welche bis zu 10^5 GE/mg erreichte. Es wurde eine transstadiale Übertragung bei I. ricinus mit einer Rate von 25 % nach-gewiesen. Infizierte Nymphen, die nach der Häutung steriles Blut bekamen, schieden ebenfalls C. burnetii im Kot aus; im Blut wurde hingegen keine DNA von C. burnetii nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Das genutzte Fütterungssystem eignet sich für die Untersuchung der Vektorkompetenz von Zecken. Beide Zeckenspezies sind in der Lage, infektiösen Zeckenkot auszuscheiden, wodurch eine Gefahr einer möglichen aerogenen Übertragung entsteht. Dabei muss jedoch eine hohe Erregerkonzentration im Blut des Wirts erreicht werden. Es wurde eine transstadiale Übertragung von C. burnetii in I. ricinus von Nymphen zu Adulten und damit die Möglichkeit der Bildung eines Reservoirs nachgewiesen. Die Ergebnisse legen eine Vermehrung von C. burnetii im Mitteldarm der Zecken nahe. Dadurch konnten historische Aussagen aus der Literatur über andere Zeckenspezies zur Ausscheidung von C. burnetii mittels Zeckenkot bestätigt werden. In der Studie konnte weiterhin gezeigt werden, dass heimische Zecken unter Laborbedingungen zur Verbreitung von Q-Fieber beitragen können. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um die tatsächliche Bedeutung der Vektorkompetenz von Zecken unter natürlichen Bedingungen abschätzen zu können.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Coxiella burnetii 2.1.1 Historischer Ursprung und taxonomische Einordnung 2.1.2 Morphologie und Replikation 2.1.3 Coxiella burnetii als Krankheitserreger 2.1.3.1 Epidemiologie 2.1.3.2 Coxiellosen der Tiere 2.1.3.3 Q-Fieber des Menschen 2.1.3.4 Nachweis und Therapie 2.2 Zecken 2.2.1 Taxonomie 2.2.2 Verbreitung und Habitat 2.2.3 Morphologie 2.2.4 Lebenszyklus 2.2.5 Wirtssuche und sensorische Fähigkeiten 2.2.6 Blutmahlzeit und Verdauung 2.2.7 Zeckenmikrobiom und Coxiella-like Endosymbionten 2.2.8 Zecken als Vektoren 2.2.8.1 Infektionserreger 2.2.8.2 Coxiella burnetii in Zecken 2.3 Fütterung von Zecken 2.3.1 Fütterungssysteme 2.3.1.1 Membranbasierte Fütterungssysteme 2.3.1.2 Fixierungsstimuli im Zeckenfütterungssystem 2.3.1.3 Experimentelle Infektionen im membranbasierten in-vitro-System 3 Veröffentlichungen 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.1.1 Publikation 1 3.2 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 3.2.2 Publikation 2 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Bilder der Zeckenfütterung 9 Danksagung

Es geht um die Verbesserung verschiedener Infektions- und Transfektionsprotokolle zur in vitro Arbeit mit Cryptosporidium parvum in der Zellkultur. Des weiteren wurden Mausdarmorganoide ohne Hilfe eines Mikroinjektors mit C. parvum Sporozoiten infiziert. Außerdem wurde ein Protein (Trap-C1) von C. parvum welches ein putativer Virulenzfaktor ist, molekularbiologisch untersucht.

Einleitung: Das kontrollierte Zusammenspiel zwischen glatter Muskulatur und enterischen Nervenzellen ist eine essentielle Voraussetzung für einen auf die Erfordernisse der Verdauungsprozesse angepassten Transport des Chymus im Magen-Darm-Kanal. Obwohl es zahlreiche Untersuchungen zu den einzelnen Komponenten dieses Zusammenspiels gibt, liegen nur wenige Erkenntnisse zur simultanen Steuerung der Zirkulär- (ZM) und Longitudinalmuskulatur (LM) durch nervale Komponenten vor. Aus meiner Diplomarbeit war für diesen Zweck ein neues Messsystem hervorgegangen, das simultane Motilitätsableitungen an den verschiedenen Muskelschichten im Darm ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: In der vorliegenden Arbeit sollte das neue Messystem zur funktionellen Charakterisierung intrinsischer nervaler Schaltkreise insbesondere im Hinblick auf die Beteiligung cholinerger und nitrerger enterischer Nervenzellen am porcinen Colon angewendet und evaluiert und mit der bisher verfügbaren, eindimensionalen Messmethode verglichen werden. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen erfolgten an Präparationen aus dem distalen Colon 21 adulter Schlachtschweine. Die Präparate bestanden aus ZM und LM und dem dazwischen liegenden myenterischen Plexus. Als Referenzmethode wurde die bisher standardmäßig eingesetzte eindimensionale Messmethode (Apparatur 1) angewendet. Diese beurteilte die Colonmotilität für ZM und LM getrennt voneinander, in je 2 Organbädern je Muskulaturrichtung, an Präparationen mit einer Größe von 1x3 cm. Mit dem neuen Messsystem (Apparatur 2) erfolgten simultane, zweidimensionale Motilitätsmessungen an je drei Messpunkten der ZM bzw. LM im Abstand von 2 cm innerhalb eines größeren Darmpräparates (5x5 cm). In beiden Messapparaturen wurden mittels elektrischer Feldstimulation (EFS) evozierte Nerv-Muskel-Antworten hervorgerufen. Diese EFS-Antworten setzten sich aus einer ON-Kontraktion (während der Stimulation) und einer OFF-Kontraktion (im unmittelbaren Anschluss an die Stimulation) zusammen. In Apparatur 2 erfolgte die EFS lokal an drei verschiedenen Positionen im Präparat. Es wurden in N=15 Versuchsansätzen vergleichende Untersuchungen zwischen Apparatur 1 und 2 zur Spontanmotilität sowie zu den nach EFS erzeugten Nerv-Muskel-Antworten gemacht. Um die Beteiligung intrinsischer cholinerger und nitrerger Komponenten in der Kontrolle der Darmmotilität zu untersuchen, wurden sowohl der Einfluss der cholinergen Antagonisten Atropin und Hexamethonium als auch eine Hemmung der NO- Synthese durch L-NAME (NG Nitro L arginine methylester Hydrochlorid) in je 3 Konzentrationsstufen und N=5 Versuchsansätzen je Hemmstoff erfasst. Für die statistische Analyse wurden nichtparametrischen Verfahren verwendet. Für Einstichprobentests wurde der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest genutzt und zur Testung nach Unterschieden innerhalb von Gruppen der Test nach Friedman und der Post-hoc Test nach Wilcoxon mit angepasstem Signifikanzniveau für Mehrfachvergleiche nach Bonferroni. Paarweise Vergleiche erfolgten durch den Wilcoxon-Test. Ergebnisse wurden als statistisch signifikant bezeichnet, wenn das Signifikanzniveau (p) < 0,05 war. Ergebnisse: Apparatur 1 und 2 lieferten unter Kontrollbedingungen qualitativ gleichwertige Messergebnisse sowohl für die Spontanmotilität als auch für die EFS-Antworten an ZM und LM. Die Spontanmotilität wurde in beiden Messapparaturen durch die Hemmstoffe kaum beeinflusst. Zwischen den Messmethoden bestanden insbesondere an der LM teils signifikante Unterschiede in der Hemmstoffwirkung. Alle drei Hemmstoffe hatten an der LM in Apparatur 1 einen erregenden Einfluss auf die Spontanmotilität sowie die OFF-Antworten, während mit Apparatur 2 ein hemmender Einfluss festgestellt wurde. Mit Apparatur 2 gelang es, lokal begrenzt im Abstand von 2 cm enterische Neurone durch EFS zu erregen und deren Muskel-Antworten am Ort der Stimulation wie auch an weiter entfernten Messorten oral und anal der Stimulationsstelle zu detektieren. Unter Kontrollbedingungen waren die OFF-Antworten der ZM signifikant vom Ort der Stimulation abhängig. Die OFF-Kontraktionen waren an anal zur Stimulationsstelle gelegenen Messpunkten signifikant niedriger ausgeprägt, während sie oral zum Stimulationsort signifikant stärker waren als am Stimulationsort selbst. Atropin und Hexamethonium führten an der ZM zu einer signifikanten Hemmung der OFF-Antworten, blockierten diese allerdings nicht komplett und waren unabhängig vom Ort der Stimulation. L-NAME demaskierte insbesondere direkt am Stimulationsort signifikant lokal erregende Anteile der EFS-Antworten. Schlussfolgerungen: Die Spontanmotilität unterliegt im porcinen Colon, unabhängig von der Messmethode, kaum cholinergen und nitrergen Einflüssen. Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Messmethoden an der LM unter Hemmstoffeinfluss könnten Folge des Größenunterschiedes zwischen den Darmpräparaten sein und auf unterschiedliche Projektionslängen cholinerger wie auch nitrerger Neurone hinweisen. Acetylcholin ist zwar ein wichtiger, aber nicht der einzige Transmitter aus myenterischen Nervenzellen, der Muskelkontraktionen am porcinen Colon induziert. Nitrerge hemmende Motoneurone haben kurze Projektionslängen (< 2 cm) und die entfernt vom Stimulationsort registrierten EFS-Antworten wurden eher durch nicht-nitrerge Interneurone oder nicht-nitrerge lang projizierende hemmende Motoneurone vermittelt. Cholinerge Interneurone sind an den EFS-Antworten beteiligt und spielen sowohl bei den lokalen als auch bei den weiter vom Stimulationsort entfernt registrierten EFS-Antworten eine Rolle. Es ist mit dieser Arbeit gelungen, neue Erkenntnisse zu cholinergen und nitrergen enterischen Schaltkreisen am porcinen Colon zu gewinnen und eine neue Messmethode für zukünftige Untersuchungen zum Zusammenspiel von ZM und LM zu evaluieren und etablieren. Aufgrund der qualitativen Vergleichbarkeit der Messergebisse zwischen beiden Messapparaturen kann in Folgeuntersuchungen mit Apparatur 2 auf bestehende Befunde aus eindimensionalen Untersuchungen zurückgegriffen werden. Vertiefend können durch die simultanen Motilitätsmessungen an ZM und LM sowohl Ausbreitungsrichtung als auch Zeitunterschiede zwischen den spontanen sowie evozierten Motilitätsmustern beider Muskelschichten bewertet werden.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Funktionen des porcinen Colons 2.2 Aufbau des Colons 2.2.1 Makroskopischer Aufbau 2.2.2 Mikroskopischer Aufbau 2.3 Darmmotilität 2.3.1 Myogene Mechanismen 2.3.2 Gastrointestinale Hormone 2.3.3 Enterisches Nervensystem (ENS) 2.3.4 Extrinsische Steuerung 2.3.5 Motilitätsmuster im Colon verschiedener Tierarten 2.3.6 Spezielle Motilitätsmuster im porcinen Colon 2.4 Untersuchungen der Darmmotilität 2.4.1 Untersuchungen in vivo 2.4.2 Untersuchungen in vitro 2.5 Bedeutung der Befunde für die vorliegende Arbeit 3 Material und Methoden 3.1 Versuchsvorbereitung 3.1.1 Gewinnung des Organmaterials 3.1.2 Gewebeaufbereitung 3.2 Versuchsanordnung 3.2.1 Apparatur: 1: eindimensionale Motilitätsmessung 3.2.2 Apparatur 2: zweidimensionale Motilitätsmessung 3.2.3 Elektrische Feldstimulation (EFS) 3.2.4 Hemmstoffe 3.3 Versuchsdurchführung 3.3.1 Voruntersuchungen 3.3.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 3.3.3 Datenauswertung und Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Voruntersuchungen 4.1.1 TTX-Sensitivität der EFS-induzierten Muskelantworten 4.1.2 Funktioneller Ausschluss einer direkten EFS-Wirkung außerhalb des Stimulationsortes 4.2 Funktionelle Charakterisierung enterischer Schaltkreise 4.2.1 Spontanmotilität 4.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach elektrischer Feldstimulation 5 Diskussion 5.1 Methodendiskussion 5.2 Diskussion der Messergebnisse von Apparatur 1 und 2 5.2.1 Spontanmotilität 5.2.2 Nerv-Muskel-Antworten nach Elektrischer Feldstimulation 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Danksagung

Einleitung: Reinigung und Desinfektion sind wichtige Instrumente zur Verhinderung der Ausbreitung von Krankheitserregern, insbesondere wenn es sich um multiresistente Bakterien handelt. MRSA und ESBL-produzierende Enterobacteriaceae kommen sowohl in der Human- wie auch in der Veterinärmedizin vor und sind teilweise zoonotisch. Um eine wirksame Desinfektion mit entsprechenden Handelspräparaten zu gewährleisten, gibt es standardisierte mehrschrittige Prüfverfahren, die vor einer Listung des Desinfektionsmittels erfolgreich durchlaufen werden müssen (z.B. Prüfverfahren der Deutschen Veterinär-medizinischen Gesellschaft e.V. (DVG) oder dem Verbund für angewandte Hygiene e.V. (VAH)). Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es zu ermitteln, inwieweit die zugrundeliegende Testmethode einen Einfluss auf die Aussage einer möglichen Desinfektionsmittel-Resistenz bei Bakterien hat. Außerdem sollten stammspezifische Unterschiede zwischen Antibiotika-sensiblen Prüfkeimen und (multi-)resistenten Stämmen untersucht werden. Ebenfalls wurde nach Unterschieden zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien in Bezug auf die Wirksamkeit des jeweiligen Desinfektionsmittels geschaut. Material und Methoden: Die Desinfektionsmittelprüfung wurde in einem dreistufigen Testverfahren bestehend aus: Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK), qualitativem Suspensionstest mit und ohne geringer organischer Belastung und Keimträgertest mit geringer organischer Belastung in Anlehnung an die Richtlinie der DVG von 2013 bzw. 2015 durchgeführt. Dabei wurden zwölf grampositive S. aureus-Stämme (zwei MSSA, neun MRSA und ein MRSA-QC Stamm) und 13 gramnegative Enerobacteriaceae (z.T. ESBL-positiv, drei 3MRGN) der Gattung E. coli, K. pneumoniae und S. Typhimurium getestet. Geprüft wurden fünf chemischen Grundsubstanzen, welche in gängigen Desinfektionsmitteln eingesetzt werden. Diese sind Benzalkoniumchlorid (BAC), Natriumhypochlorit (SHO), Peressigsäure (PA), Glutaraldehyd (GA) und Ethanol (ETH). Die Ergebnisse wurden anschließend verglichen und statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Es besteht eine große Varianz der Ergebnisse in Bezug auf den Vergleich der drei Prüfmethoden. So gab es beispielsweise deutliche Unterschiede im Vergleich der MHK-Werte und der Ergebnisse im Keimträgertest. Hier konnten im Praxistest höhere Konzentrationen wie am deutlichsten bei BAC (maximal 1.500-fach bei SA 2) zu sehen aber auch bei ETH, SHO (5 min) und PA (5 min) ermittelt werden. Andersherum reichten geringere Konzentrationen bei GA, SHO (30 min) und PA (30 min) zur Desinfektion im Keimträgertest aus. Beim Vergleich der (multi-)resistenten Erreger (MRE) gegenüber den entsprechenden Prüfstämmen gab es ebenfalls keine homogene Richtung. So waren die Antibiotika-sensiblen Prüfstämme häufig mit geringeren Desinfektionsmittel-Konzentrationen abzutöten, dennoch nicht immer (gleiche oder höhere Konzentrationen notwendig). Auch beim Vergleich der Sensibilität zwischen grampositiven und gramnegativen Stämmen ergab sich ein heterogenes Bild. So waren in Bezug auf die MHK-Werte die grampositiven Stämme signifikant sensibler gegenüber BAC und andererseits signifikant toleranter gegen-über ETH und SHO. Der Effekt einer Erhöhung der wirksamen Konzentration bei geringer organischer Belastung konnte bestätigt werden und war am deutlichsten bei BAC und SHO ausgeprägt mit einer Erhöhung der wirksamen Konzentration um das bis zu 50-fache. Zusammenfassend können wir mit unseren Ergebnissen keine per se vorhandene Desinfektionsmittel-Resistenz bei den getesteten MRE gegenüber den Antibiotika-sensiblen Prüfstämmen nachweisen. Schlussfolgerungen: Die Prüfmethode hat maßgebenden Einfluss auf das Ergebnis der Desinfektionsmittelprüfung und der damit verbundenen Einstufung eines Erregers als resistent bzw. tolerant gegenüber Desinfektionsmitteln. Praxisnahe Tests sollten dabei immer mit einbezogen werden. Für eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen Studien wäre eine weitere Vereinheitlichung der Prüfmethoden wünschenswert. Mit unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass bei einer korrekten Anwendung der Desinfektionsmittel keine zusätzlichen Maßnahmen für MRE getroffen werden müssen. Diese werden ebenfalls zuverlässig bei der Routinedesinfektion mit gelisteten Produkten bei handelsüblichen Gebrauchskonzentrationen abgetötete.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multiresistente Erreger (MRE) 2.1.1 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 2.1.2 Enterobacteriaceae 2.1.3 Vorkommen von MRE in der Veterinärmedizin, der Humanmedizin und im Lebensmittel 2.2 Biozidresistenz 2.3 Prüfrichtlinien 2.3.1 Prinzip der Desinfektionsmittelprüfung nach DVG 2.3.2 weitere Prüfrichtlinien/ Desinfektionsmittellisten 2.3.3 verwendete chemische Grundsubstanzen 2.3.4 Wirkungsweise von Desinfektionsmitteln 2.4 Beschreibung der ausgewählten Bakterienstämme 3 Veröffentlichung 3.1 Eigenanteil 3.2 Fremdanteil 3.3 veröffentlichter Zeitschriftenartikel 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary Literaturverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Danksagung

Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSCs) stellen nicht nur beim humanen Patienten, sondern auch in der Veterinärmedizin einen vielversprechenden Therapieansatz in der Behandlung erkrankter muskuloskelettaler Gewebe dar. Ziel der Behandlung ist dabei die Regeneration der betroffenen Strukturen im Vergleich zur Reparation nach konservativer Therapie. Vor allem im Bereich von Sehnenerkrankungen können nach MSC-Applikation vielversprechende Ergebnisse im Hinblick auf niedrigere Rezidivraten beobachtet werden. Dennoch sind noch nicht alle Umstände einer optimalen MSC-Anwendung geklärt. Hierbei sind unter anderem Fragen bezüglich der Herkunft und Gewinnung von MSCs offen, da Unterschiede von MSCs aufgrund ihrer Gewebezugehörigkeit bereits nachgewiesen wurden. Grundlegende umfassende Arbeiten zum Vergleich von equinen MSCs aus verschiedenen Quellen sowie deren mögliche Beeinflussung durch die Isolierung aus dem Gewebe lagen bislang noch nicht vor. Ziel dieser Studie war es daher, equine MSCs aus verschiedenen Quellen zu gewinnen und mögliche Unterschiede in vitro aufzuzeigen. Weiterhin sollten Unterschiede zwischen den Zelleigenschaften nach Anwendung verschiedener Isolationsprotokolle untersucht werden. In der hier vorliegenden Studie wurden MSCs aus Fett- und Sehnengewebe, Knochenmark, Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe von Pferden isoliert und vergleichend charakterisiert. Dabei wurden für die soliden Körpergewebe zwei unterschiedliche Isolationsmethoden, die Digestion und die Explantation, angewendet, um mögliche Einflüsse auf die gewonnen Zellen zu ermitteln. Die untersuchten Kriterien beinhalteten Zellertrag, Proliferation, Differenzierungspotenz und das Migrationsverhalten von MSCs. Hinblickend auf eine Anwendung von MSCs bei Sehnenerkrankungen wurde auch die Expression von Sehnenmarkern verglichen. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die MSCs aus verschiedenen Quellen hinsichtlich der Zellausbeute und ihres Wachstumspotentials unterschieden. Aus soliden Geweben konnten mittels Digestion im Vergleich zu Körperflüssigkeiten signifikant mehr MSCs isoliert werden (p < 0,001). Dabei erbrachte die Isolation von MSCs mittels Digestionsmethode einen deutlich höheren Zellertrag nach der Passage 0 im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Im weiteren Verlauf der Kultivierung zeigten MSCs aus Sehnengewebe und Fettgewebe ein signifikant besseres Proliferationsverhalten im Vergleich zu Knochenmark-MSCs und Nabelschnurblut-MSCs. Im Hinblick auf das Differenzierungspotential konnten signifikante Unterschiede zwischen den MSCs aus den verschiedenen Quellen beobachtet werden. MSCs aus Knochenmark zeigten eine sehr gute osteogene Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu MSCs aus den geburtsassoziierten Geweben (p < 0,05). Im Gegensatz dazu zeichneten sich diese MSCs durch eine deutlich bessere chondrogene Differenzierung im Vergleich zu Knochenmark-MSCs aus (p < 0,05). Im Hinblick auf die Isolationsmethode konnten keine Unterschiede im Differenzierungspotential beobachtet werden. Weitere Unterschiede aufgrund der Zellquelle lassen sich in der Genexpression der Sehnenmarker erkennen. MSCs aus Fettgewebe und Sehnengewebe exprimierten Kollagen 1A2 auf höchstem Niveau. Sklexaris hingegen wurde von MSCs aus Nabelschnurblut und Sehnengewebe am höchstem exprimiert. Dabei zeigten MSCs, die mittels Digestionsmethode isoliert worden waren, ein signifikant höheres Expressionslevel von Skleraxis im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen einen Einfluss der Zellquelle auf die Zellcharakteristika erkennen. MSCs aus Fettgewebe stellen dabei eine vielversprechende Alternative zu Knochenmark-MSCs dar. Allerdings scheint für eine klinische Anwendung von MSCs eine selektive Auswahl der Zellquelle entsprechend der vorliegenden Erkrankung von Vorteil zu sein. Dabei ist eine Isolierung von MSCs aus soliden Geweben mittels Digestionsverfahren zu empfehlen, da hier deutlich höhere Zellzahlen gewonnen werden können. Eine negative Beeinflussung der Zelleigenschaften durch die enzymatische Digestion lässt sich nach den vorliegenden Ergebnissen nicht vermuten. Inwiefern die beobachteten Unterschiede bei in-vivo-Anwendungen von Bedeutung sind, muss jedoch noch umfassend untersucht werden. / Not only in humans but also in veterinary medicine, multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are a promising treatment option in the therapy of injured musculoskeletal tissues. This is due to the improved tissue regeneration instead of the insufficient reparation following conventional therapies. With regard to an application of MSCs for treatment of tendinopathies in horses, lower rates of reinjury have been reported. However, further investigations to optimize the MSC treatment are still outstanding. Differences in MSCs from different origins have been already reported, but there are still remaining questions about the influence of origin and isolation procedures of MSCs. Fundamental research on equine MSCs derived from different sources and their potential impact due to the isolation process has not been published so far. The aim of this study was to isolate equine MSCs from different sources and to demonstrate potential differences in vitro. Furthermore, differences in cell features following different isolation methods were investigated. In the present study, MSCs from horses were isolated from adipose tissue, tendon tissue, bone marrow, umbilical cord blood and umbilical cord tissue and subsequently subjected to comparative characterization. In case of the solid tissues, two different isolation methods, digestion and explantation, were performed in order to analyze influences on obtained cells. Investigated cell features included cell yield, proliferation, differentiation and migration potential. Furthermore, expression of tendon markers was evaluated with regard to an application of MSCs in tendinopathies. In the present study it was shown that MSCs derived from different sources differ distinctly in cell yield and proliferation potential. In comparison to body fluids, significantly more MSCs could be isolated from solid tissues when using the digestion method (p < 0.001). Furthermore, the cell yield at first cell harvest was distinctly higher when performing the isolation by digestion in comparison to isolation by explantation (p < 0.05). With regard to further cultivation, MSCs derived from tendon tissue and adipose tissue displayed a significantly better proliferation potential compared to MSCs derived from other sources. Considering the differentiation potential, significant differences were obvious between the MSCs derived from different sources. Bone marrow-MSCs showed an excellent osteogenic differentiation capacity in comparison to MSCs derived from umbilical cord blood and tissue (p < 0.05). In contrast, the birth-associated MSCs displayed a distinctly better chondrogenic differentiation than MSCs derived from bone marrow (p < 0.05). No difference in the differentiation potential was noticeable following the different isolation procedures. Furthermore, differences in the gene expression of tendon markers were evident with regard to the cell source. MSCs derived from adipose tissue and tendon tissue expressed collagen 1A2 on the highest level. On the other hand, scleraxis was expressed highest in MSCs derived from umbilical cord blood and tendon tissue. In these cells, MSCs isolated by the digestion method showed a significantly higher expression level of scleraxis in comparison to MSCs isolated by explantation (p < 0.05). Based on the results obtained so far, a relevant impact of the source of MSCs on cell features was evident. MSCs derived from adipose tissue are a promising alternative to bone marrow-MSCs. However, with regard to a clinical application of MSCs, a selection of the MSC source depending on the respective intended use seems to be advantageous. For routine isolation of MSCs from solid tissues, the digestion method could be recommended due to the higher obtainable cell numbers. Furthermore, a negative influence of the enzymatic digestion on the cell features was not detectable. However, to what extent the observed differences in vitro are relevant for in-vivo-applications needs to be further investigated.