Die Inzidenz von neurodegenerativen Erkrankungen und Schlaganfällen steigt in Folge der Überalterung der westlichen Gesellschaft immer weiter an. Die Behand-lung von Schlaganfall-, Alzheimer und Parkinsonpatienten ist bisher aber meist unbefriedigend bzw. weitgehend erfolglos. Ein neues Modell in der Schlaganfallforschung wurde daher am Schaf entwickelt. In diesem wird auch der in den letzten zwei Jahrzehnten verstärkt verfolgte zelltherapeutische Ansatz untersucht (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). Neurale Vorläuferzellen gelten dabei, auf Grund ihrer wichtigen Rolle bei den endogenen Reparaturmechanismen nach einem Schlaganfall, als besonders vielversprechend. Die Gewinnung dieser Zellen für eine autologe Transplantation ist jedoch aufwendig und nur eingeschränkt möglich. Im Vergleich zu Nervengewebe stellt die Haut eine sowohl beim Tier als auch beim Menschen leicht zugängliche und in ausreichendem Maß verfügbare Quelle verschiedener Stamm- und Vorläuferzellen dar. Bei verschiedenen Spezies wurde die Isolation spezieller, dermaler Vorläuferzellen beschrieben, die als skin-derived precursor cells (SKPs) bezeichnet werden. SKPs wiesen dabei ein ähnliches Differenzierungspotential auf wie neurale Vorläuferzellen (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). Ein Einsatz der SKPs in der Schlaganfalltherapie wäre somit denkbar, muss aber zunächst im Schafmodell erforscht werden. SKPs wurden jedoch noch nicht bei der Spezies Schaf isoliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ein Isolationsprotokoll für SKPs aus der ovinen Dermis zu etablieren und diese morphologisch und immunzytologisch zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene in der Literatur beschriebene Isolati-onsverfahren an ovinen Hautproben getestet und modifiziert. Es wurden verschiedene Körperregionen auf ihre Eignung zur Probenentnahme und zur anschließenden Isolierung untersucht. Des Weiteren wurde der Effekt einer Rasur eine Woche vor Exzision des Hautareals auf die Sphäroidbildung überprüft. Der Einsatz von Enzymen in Kombinationslösungen oder singulär wurde variiert und eine unterschiedlich intensive mechanische Aufbereitung der Proben durchgeführt. Der Erfolg der zwei vielversprechendsten Isolationsprotokolle wurde statistisch validiert. Außerdem wurde der Effekt einer initialen Fibronektinbeschichtung analysiert. Die von den isolierten Zellen gebildeten sphärenartigen Zellaggregate wurden unter morphologischen Gesichtspunkten sechs und neun Wochen nach Isolation ausgewertet. Dabei wurden die Anzahl der Sphäroide/cm², die Größe und die Form berücksichtigt. Des Weiteren erfolgte eine immunzytologische Analyse der Sphäroide mit Fokus auf das in der Literatur beschriebene Expressionsmuster von SKPs und neuralen Vorläuferzellen. Für die Isolation von ovinen SKPs erwies sich die Regio nasofrontalis als das geeignetste Hautareal. Dabei war die Isolation eine Woche nach Rasur des beprobten Areals zuverlässiger als ohne diese. Bei vergleichender Betrachtung der Methoden erwies sich ein enzymatisch orientiertes Isolationsverfahren modifiziert nach FERNANDES und MILLER (2009) als zielführend. Neben einer hohen Anzahl an isolierten Zellen erfolgte in jedem Versuchsdurchgang eine Zusammenlagerung der Zellen in frei flotierenden Aggregaten. Diese waren im Median 70,97 µm groß. Auf Grund ihrer Geometrie ist es korrekter sie als Sphäroide und nicht, wie bei anderen Spezies üblich, als Sphären zu bezeichnen. Eine anfängliche Beschichtung der Zellkulturplatten mit Fibronektin hatte keinen fördernden Effekt auf die Bildung und die Größe der Sphäroide. Lediglich eine anfänglich höhere Proliferationsrate war bemerkbar. Immunzytologisch konnte gezeigt werden, dass in den Sphäroiden eine heterogene Zellpopulation vorlag. Die Sphäroide wurden überwiegend von Zellen gebildet, in denen neben mesenchymalen Markern auch klassische Vorläuferantigene wie Nestin und Sox2 nachgewiesen wurden. Das immunzytologische Expressionsmuster ist damit vergleichbar mit dem von SKPs anderer Spezies. Außerdem wurden in unterschiedlicher Ausprägung Antigene detektiert, die typischerweise in neuralen Vorläuferzellen der ventrikulären und subventrikulären Zone vorkommen. Dies konnte auch in den Positivkontrollen für das ovine Gehirn bestätigt werden. Die Anzahl proliferierender Zellen in den Sphäroiden war relativ gering und die Anzahl an kokultivierter Keratinozyten minimal. Die Zusammenfassung der heterogenen Vorläuferzellpopulation unter dem Begriff skin-derived precursor cells ist auf Grund ihres dermalen Ursprungs und ihrer morphologischen und immunzytologischen Eigenschaften gerechtfertigt. Somit ist es in dieser Arbeit gelungen, zum ersten Mal SKPs aus der ovinen Dermis zu isolieren und über neun Wochen zu kultivieren. Es wurde ein Isolationsprotokoll entwickelt, das eine Sphäroidbildung reproduzierbar ermöglicht und an die Gegebenheiten beim Schaf angepasst ist. Bevor eine autologe Transplantation von diesen SKPs etwa im Schlaganfallmodell am Schaf vorgenommen werden kann, ist eine intensivere Untersuchung der isolierten Zellen etwa mittels PCR durchzuführen und eine fluoreszenzbasierte Zellsortierung der heterogenen Vorläuferzellen zu entwickeln. / In consequence of the demographic changes in modern western society, the inci-dence of neurodegenerative diseases and stroke is increasing. Unfortunately, there is still no successful or at least satisfactory treatment available for patients who suffer from stroke Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Therefore, a new animal model in stroke research has been established in sheep (BOLTZE et al. 2011, DREYER et al. 2012). First cell therapy studies have already been performed in this model. Especially neural precursor cells seem to be promising as they play an important role in endogenous repair processes in the brain after stroke. However, the extraction of these cells prior to an autologous transplantation is elaborate and of limited success. Compared to neural tissue, skin is an easily accessible and sufficiently available source of a variety of stem and precursor cells in animals as well as in humans. Thus, the isolation of a specific type of dermal precursor cells, called skin-derived precursor cells (SKPs), seems to be easier compared to neural precursor cells and in vitro SKPs are capable of neural differentiation as well (TOMA et al. 2001, FERNANDES et al. 2006). According to these findings, a therapeutic application of SKPs after stroke seems to be promising. Prior to that, however, intensive studies in the ovine stroke model are necessary. Thus, SKPs have to be isolated from the dermis of sheep for an autologous transplantation. Therefore, the aim of this dissertation has been the establishment of an optimal isolation protocol for SKPs from the ovine dermis as well as the morphological and by immunocytochemical characterisation of those cells. Within this study, several previously described isolation protocols were modified for ovine skin. Skin samples were taken from several body regions to assess the local suitability for excision and isolation. Additionally, the effect of shaving the areas one week before sampling on spheroid forming was tested. A variety of enzymes was used alone and in combination. Furthermore, the effectiveness of an isolation protocol using enhanced mechanical treatment was analysed. The two most promising protocols were evaluated statistically and compared to each other. In these experiments, the influence of an initial fibronectin coating was determined as well. The isolated cells formed spheroids, which were assessed after six and nine weeks of cultivation considering the amount of spheroids per cm², their size and form. Moreover, immunocytochemical tests were conducted, focusing on expression patterns described for SKPs and neural precursor cells. According to these experiments, it is advisable to take skin samples from the naso-frontal region one week after shaving. Comparing all tested protocols, a predominantly enzymatic isolation protocol modified according to FERNANDES and MILLER (2009) was most successful. A high cell yield was achieved and free-floating spheroids formed spontaneously in all test runs. The median diameter of these spheroids was 70.97 µm. Due to their three-dimensional shape, it is more correct to use the term “spheroid” instead of the commonly used term “sphere”. Growing the isolated cells initially on fibronectin coated culture plates does not support both formation and size of the spheroids. Only a higher cell proliferation at the beginning of cultivation can be noticed. Immunocytochemical assays demonstrated that the formed spheroids consisted of a heterologous cell population. Besides mesenchymal antigens the cells in the spheroids expressed characteristic antigens of precursor cells, like Nestin and Sox2. Thus, the immunocytochemical expression pattern is comparable to SKPs isolated from other species. Furthermore, common markers of neural precursor cells of the ventricular and subventricular zone, whose existence in the ovine brain was also proven in this study, were detected in the spheroid forming cells. There were only a few proliferating cells and a minimal amount of keratinocytes in the spheroids. Due to the dermal origin and the given morphological and immunocytochemical characteristics, the heterogeneous cell population can be addressed by the term “skin-derived precursor cells”. In conclusion, in this study ovine SKPs were isolated for the first time and cultured successfully over nine weeks. An isolation protocol was established, which guarantees reproducible formation of spheroids in cell isolates from ovine dermis. Further intensive examinations of the isolated cells, for example using PCR, have to be conducted before SKPs can be applied in autologous transplantation in the ovine stroke model. Additionally, the usage of fluorescence-activated cell sorting of the heterogeneous precursor cells should be considered.

Die Untersuchung des externen Gehörkanals stellt beim Pferd, wie auch bei anderen Tieren, einen Teil der klinischen Untersuchung dar. Bis jetzt konnte die Untersuchung des equinen externen Gehörkanals, wenn überhaupt, nur sehr oberflächlich durch Adspektion und Palpation der Ohrmuschel erfolgen. Das lag unter anderem an der großen Sensibilität des Pferdeohrs und den damit verbundenen Abwehrreaktionen, sowie auch an den fehlenden anatomischen Informationen. Zu den selten beschriebenen Erkrankungen des equinen, externen Gehörkanals zählen: Otitis externa, Polypen, Neoplasien, Chondrosen, Stenosen und Parasitenbefall (Ohrmilben). Die Diagnose solcher Erkrankungen konnte bis jetzt nur durch die endoskopische Untersuchung oder computertomographische Untersuchung des Gehörkanals post mortem oder unter Allgemeinanästhesie gestellt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Studie wurden anatomische Präparationen an 15 Kadaverschädeln durchgeführt, um die genaue Innervation des equinen externen Gehörkanals darzustellen. Proben des Trommelfells, des N. auricularis magnus und des N. auricularis internus wurden histologisch aufbereitet. Durch die gewonnenen Informationen konnte eine Anästhesie des Gehörkanals durch lokale Infiltration des N. auricularis internus und N. auricularis magnus entwickelt werden. Im zweiten, klinischen Teil der Studie wurde die Anästhesie, nach ultrasonographischer Untersuchung der Region, an beiden Gehörkanälen von 23 Pferden durchgeführt. Die Lokalanästhesie war bei allen Pferden beidseits erfolgreich. Bei drei Pferden musste auf je einer Seite eine größere Menge Lokalanästhetikum verwendet werden, um eine vollständige Desensibilisierung zu erreichen. Dies waren die einzigen Fälle bei denen eine Komplikation durch die Anästhesie im Sinne einer temporären Facialisparese auftrat. Diese war damit klar auf die größere Menge des Lokalanästhetikums zurückzuführen. Durch die entwickelte Lokalanästhesie konnte die endoskopische Untersuchung des externen Gehörkanals bis hin zum Trommelfell am stehenden, sedierten Pferd möglich gemacht werden. Die Endoskopie wurde mit 2 verschiedenen flexiblen Endoskopen (mit 2 mm und 7 mm Durchmesser) durchgeführt. Im Rahmen der Endoskopie wurden die externen Gehörkanäle hinsichtlich ihrer Schleimhautbeschaffenheit, des Verschmutzungsgrades und auftretender Pathologien beurteilt. Der Verschmutzungsgrad variierte zwischen gering- und hochgradig (I-III). Zu den aufgetretenen Pathologien zählten zelluläre und zeruminale Akkumulationen, eine osteomähnliche Umfangsvermehrung, Granulome, Blutungen und Verengungen des externen Gehörkanals.

The ability to learn and change future behaviour based on past experiences is crucial for the life and survival of animals. For various behaviours exhibited by animals it is clear that in a seemingly homogeneous population not all individuals behave the same way, even in invertebrates. In crickets (Gryllus bimaculatus), a model system for the mechanisms of intra-specific aggression, agonistic experiences with the underlying impact of neuromodulators have been identified as a cause of inter-individual differences. For mammals and humans, the experience of adversity and stress can have detrimental effects on cognitive abilities and chronic defeat stress is used as a model for depression. In crickets the equivalent, the chronic social defeat stress paradigm, has been established. This thesis first sets out to construct a new model for measuring a conditioned response from multiple behavioural aspects and quantify learning in individual crickets. Video tracking of responses revealed behavioural variables that were included in a binary logistic regression analysis, whereas the resulting multi-variable model proves to be superior to other models constructed and can give the probability of an individual exhibiting a conditioned response. With this, learning indices can be calculated for each individual trained in a differential appetitive olfactory paradigm. With the method at hand, this thesis reveals that the experience of chronic social stress impairs learning in crickets, susceptible and resilient to defeat stress alike. The experience of multiple wins, however, does neither improve nor decrease learning abilities, but a long-term winner effect on aggression could be shown. Although inter-individual differences in learning are present, the aggressive state of crickets is not correlated to the learning indices. The application of serotonergic drugs that block receptors or act as re-uptake inhibitors reveal the influence of serotonin on learning within this paradigm. In addition to maintaining reduced aggressiveness, serotonin promotes the impairment of learning after the experience of chronic social defeat stress.:1 INTRODUCTION.....................................................................................................1 2 MATERIALS AND METHODS............................................................................... 8 2.1 Experimental animals...................................................................................... 8 2.2 Appetitive olfactory conditioning..................................................................... 8 2.2.1 Odour application and rewarding....................................................... 8 2.2.2 Absolute conditioning paradigm........................................................ 10 2.2.3 Differential conditioning paradigm.................................................... 11 2.3 Experimental setup for video-tracking.............................................................. 12 2.4 Binary logistic regression model....................................................................... 13 2.4.1 Binary groups for model building...................................................... 13 2.4.2 Variables of a behavioural response................................................... 14 2.4.3 Calculating a conditioned odour response probability (Presp) ............ 15 2.5 Evaluation of learning with the binary logistic model...................................... 17 2.6 Evaluation of aggression with a standardised fight.......................................... 18 2.7 Multiple agonistic experiences......................................................................... 19 2.7.1 Chronic social defeat stress................................................................ 19 2.7.2 Multiple wins..................................................................................... 20 2.8 Serotonin......................................................................................................... 20 2.8.1 Pharmacological treatments............................................................... 20 2.8.2 Methiothepin and ketanserin.............................................................. 21 2.8.3 Fluoxetine with non-chronic defeat................................................... 21 2.9 Additional data analysis and statistic................................................................ 22 3 RESULTS............................................................................................................ 23 3.1 Binary logistic regression model for quantifying learning............................... 23 3.1.1 Behavioural variables of a conditioned odour response.................... 23 3.1.2 Model building and selection............................................................. 29 3.1.3 Odour response probabilities (Presp)................................................... 31 3.1.4 Application of the regression model to assess the quantification of learning.................................................................................................... 34 3.2 The influence of agonistic experiences on aggression and learning................. 39 3.2.1 Chronic social defeat stress................................................................ 39 3.2.2 Multiple experiences of winning........................................................ 46 3.2.3 Correlation of aggression and learning............................................... 48 3.2.4 Summary of learning capacities – multiple experiences.................... 50 3.3 The influence of serotonergic drugs on learning after chronic defeat.............. 51 3.3.1 Methiothepin and ketanserin.............................................................. 51 3.3.2 Fluoxetine........................................................................................... 57 3.3.3 Summary of learning capacities – chronic defeat and serotonin........ 60 4 DISCUSSION....................................................................................................... 63 4.1 The semi-automated measurement of olfactory learning in individually assayed crickets................................................................................................................... 64 4.2 The influence of multiple agonistic experiences on learning........................... 71 4.3 The role of serotonin in chronic social defeat influenced learning................... 77 4.4 Overall conclusion and outlook........................................................................ 80 5 SUMMARY........................................................................................................... 82 6 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................ 87 7 REFERENCES.................................................................................................... 93 8 APPENDIX................................................................................................... 106 8.1 Figures and tables................................................................................... 106 8.2 Publications and published abstracts....................................................... 108 8.3 Curriculum vitae....................................................................................... 109 8.4 Acknowledgements.................................................................................. 111

Zusammenfassung Einleitung: Eimeria tenella ist ein obligat intrazellulärer Parasit und Erreger der Blinddarmkokzidiose beim Huhn. Aufgrund des verbreiteten Einsatzes von Antikokzidia sind seit langem Resistenzentwicklungen bekannt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind komplex und nicht genau bekannt. Für den Nachweis von Resistenz gilt der Tierversuch als „Goldstandard“, er ist aber aufwändig, zeitraubend und ethisch problematisch. Ziele der Arbeit: Es sollte ein für die Erstellung von Sensitivitätsprofilen und Wirksamkeitsprüfungen geeignetes In-vitro-Modell für E. tenella entwickelt und validiert werden. Weiterhin sollte auf mit Antikokzidiaresistenz assoziierte Änderungen im Proteom von Kokzidien untersucht werden. Material, und Methoden: Monolayer von MDBK (Madin-Darby bovine kidney cells) dienten zur Kultivierung von E. tenella für den in vitro ASA (anticoccidial sensitivity assay). Als Parameter wurden die Inhibition (%ISIA, %IRIA) der Invasion durch Sporozoiten (SIA = sporozoite invasion inhibition assay) und der Erregerreproduktion (RIA = reproduction inhibition assay) mittels quantitativer PCR (qPCR) für E. tenella beurteilt. Die minimale Hemmkonzentration (MIC = minimal inhibitory concentration) wurde anhand einer Referenz (sensitiver Laborstamm Houghton, Ref-1) für Monensin (Mon), Salinomycin (Sal), Maduramicin (Mad), Lasalocid (Las) und Toltrazuril (Tol) bestimmt. Auf dieser Basis wurden ein zweiter Laborstamm (Wisconsin, Ref-2) und vier Feldstämme (T-376, FS-1, FS-2 und FS-3) im SIA und RIA getestet. 1.0 × 105 (SIA) und 5.0 × 104 (RIA) Sporozoiten/Well wurden verwendet. Die in vitro Ergebnisse wurden mit den in vivo Daten verglichen. Alle in vitro Versuche wurden in vier Replikaten durchgeführt. Insgesamt wurden 420 Hühner (1. Lebenstag: LT, Cobb-500) in fünf Tierversuche verwendet, um die Empfindlichkeit der E. tenella-Stämme gegen verschiedene Antikokzidia zu untersuchen. In jedem Tierversuch wurden 84 Tiere (12. LT) in 7 Gruppe (n = 12) eingeteilt. Hühner wurden mit 7,5 × 104 Oozysten je Tier am 14. LT infiziert. Die Wirksamkeitsprüfung für den alternativen Naturstoff Allicin erfolgte mittels RIA am Stamm Ref-1. Kontinuierlich in vitro als Tachyzoiten kultivierte T. gondii des RH-Stammes (Sen-RH) wurden unter ansteigenden Mon-Dosen in HFF-Zellen (human foreskin fibroblasts) über 8 Monate auf Resistenz (MonR-RH) selektiert. Es erfolgte eine stabile Isotopenmarkierung (SILAC). Für E. tenella wurden die sensitivenReferenzstämme ebenso wie die Feldstämme variabler Sensitivität isoabarisch-chemisch markiert (Tandem-Massenmarkierung, TMT). Die quantitativen Proteomanalysen erfolgten mit dem nanoUPLC-MS/MS. Ergebnisse: Für Ref-1 betrugen die MIC95 (MIC für eine 95%ige Inhibition) 0,25 (Mon), 0,5 (Sal), 1,0 (Mad), 0,5 (Las) und 5,0 (Tol) μg/ml. Die in vitro Sensitivitätsprofile für Ref-2, FS-1, FS-2, und FS-3 stimmten für die Ionophoren mit den Ergebnissen des Tierversuchs gut überein, für Tol war das aber nicht der Fall. Signifikante Korrelationen wurden für die %IRIA-Werte mit dem Oozystenindex (OI, r = 0,290-0,507; p < 0,05), dem lesion score (LS, r = 0,279-0,345; p < 0.05, für Ref-1, Ref-2 und FS-1) und der Gewichtszunahme im Tierversuch (WGNNC, r = 0.284-0.419; p < 0.05, für Ref-1 und FS-1) festgestellt. Allicin in einer Konzentration von 1,8 mg/ml ergab einen %IRIA von 99,0%, was einer guten Wirkung entspricht. Mittels SILAC wurden 1820 Proteine identifiziert, von denen 1024 Proteine in mehr als vier biologischen Replikaten quantifizierbar waren. Bei 52 Proteinen wurden signifikante Unterschiede zwischen Sen-RH und MonR-RH festgestellt (p < 0,05). Actin, beta-Tubulin cofactor D, Perforin-like Protein 1 (PLP1), und kleine GTPase-vermittelte Signaltransduktionsproteine (GTPases) wurden in T. gondii MonR-RH hochreguliert (p < 0,05). Insgesamt waren 42 Proteine bei der resistenten Mutante MonR-RH hochreguliert. Für E. tenella wurden 97 Proteine identifiziert und 25 Proteine wurden in allen drei biologischen Replikaten quantifiziert. Mon-resistente E. tenella zeigten signifikant hochreguliertes Actin (p < 0,05). Mikronemenproteine wurden in resistenten Toxoplasma (MIC8) und Eimeria (MIC4) herunter reguliert. Schlussfolgerungen: Das entwickelte In-vitro-Verfahren in Kombination mit der qPCR eignet sich zur Bewertung der Sensitivität von E. tenella gegenüber ionophoren Antikokzidia und erbringt Ergebnisse, die mit dem Tierversuch korrelieren. Das Modell kann Tierversuche zum Screening von Wirkstoffen reduzieren, aber nicht vollständig ersetzen, vor allem, wenn die Wirkung (auch) späte Entwicklungsstadien im Zyklus von E. tenella betrifft. Letzteres könnte die mangelnde Aussagekraft für Tol erklären. In T. gondii lässt sich Resistenz in vitro induzieren. Die Proteom-Analyse zeigte eine Verminderung der Invasion (↑ Actin, ↓ MIC8) und des Austritts (↓ PLP1), und eine Aktivierung der Replikation (↑ Actin, ↑ beta-Tubulin cofactor D, und ↑ GTPases proteine). Mon führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Na+ gefolgt von einer Erhöhung der Ca++ Konzentrationen. Die Reduzierung der Expression von Proteinen in MonR-RH, die mit Invasion- und Austrittsaktivitäten zusammenhängen, zeigt an, dass dieser Stamm höhere Konzentrationen von Mon verträgt, indem er die ktitische Schwelle der zytosolischen Ca++ Konzentration erhöht ist, die erforderlich ist, um diese Prozesse zu provozieren.

Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin ist das Vorhofflimmern (VF) eine der am häufigsten vorkommenden, klinisch signifikanten Arrhythmien. Die Folgen und Auswirkungen der Erkrankung sind vielfältig und für die Behandlung entscheidend. Die auf molekularbiologischer Ebene ablaufenden Mechanismen sind trotz jahrelanger Forschung noch weitgehend unbekannt. Studien an menschlichem Gewebe sind selten. Vergleichende Aspekte zwischen Tier und Mensch sind in der Literatur nicht beschrieben. Ziel der Arbeit war es, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowie ROS-induzierte und –assoziierte zelluläre Mechanismen bei Patienten mit VF zu analysieren. ROS werden sowohl während des physiologischen oxidativen Metabolismus der Mitochondrien als auch in zellulärer Reaktion auf pathogene Agenzien gebildet. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob das Thioredoxin-System (TRX-System), das als ROS-Scavenger fungiert, ein neuer Ansatzpunkt für eine medikamentöse Therapie sein könnte. Bereits vorhandene tierexperimentelle und humane Studien zum atrialen Remodeling (AR) und VF wurden besonders berücksichtigt und hinsichtlich ihrer Übertragbarkeit, sowie Vergleichbarkeit zwischen Tier und Mensch diskutiert. Im Rahmen der Arbeit wurden 30 linke Herzohrgewebeproben von humanen Patienten mit VF (n = 15) und von Patienten mit Sinusrhythmus (SR) (n = 15) untersucht. Die Enzymaktivitäten der NADPH-Oxidase (NOX), Xanthin-Oxidase (XO), Superoxiddismutase (SOD) und Katalase wurden mithilfe von photometrischen Absorptionsmessungen und die mitochondriale Schädigung anhand des Auftretens einer 4977 Basenpaardeletion (bp-Deletion) untersucht. Die Freisetzung des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) und von Cytochrom C ins Zytosol sowie die Veränderungen des TRX-Systems wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Western Blot analysiert. Die Signifikanz von Unterschieden zwischen den Versuchsgruppen wurde mithilfe des T-Tests bei unabhängigen Stichproben analysiert. Als Signifikanzniveau wurde ein p-Wert von ≤ 0,05 definiert. Der Levene-Test wurde angewandt, um Varianzgleichheiten zu prüfen. Der Anteil der männlichen Patienten in der VF-Gruppe war größer als der Anteil der weiblichen Patienten (11 von 15 Patienten). Das durchschnittliche Alter der VF- und SR-Patienten war vergleichbar (65,9 Jahre). Weder die Aktivität der ROS-produzierenden Enzyme NOX und XO, noch die antioxidativ wirkenden Enzyme SOD und Katalase unterschieden sich signifikant zwischen Patienten mit und ohne VF. Die Literaturrecherche ergab insbesondere in von VF geschädigten Herzohren vom Schwein erhöhte Enzymaktivitäten der NOX und XO. Die zytosolische Freisetzung von AIF und Cytochrom C bei VF- und SR-Patienten waren ebenso wie das TRX-System vergleichbar. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den VF- und SR-Patienten konnte nicht nachgewiesen werden. Die in dieser Studie untersuchte 4977 bp-Deletion war seltener bei VF-Patienten als bei SR-Patienten nachweisbar (p = 0,028). Das statistisch signifikante, häufigere Auftreten der 4977 bp-Deletion in der SR-Gruppe könnte dem Umstand der im Allgemeinen in die Studie inkludierten kranken Patienten geschuldet sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag auf der Suche nach einer adäquaten Therapie der Erkrankung des VF sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin, denn es konnte gezeigt werden, dass ROS-induzierte und -assoziierte zelluläre Mechanismen vermutlich keine große Rolle in der Pathophysiologie dieser Erkrankung spielen. Nichtsdestotrotz sind sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin weitere Studien nötig, um eine adäquate Behandlung des VF zu gewährleisten und die Lebensqualität Betroffener zu verbessern.:1 Einführung 1.1 VF in der Humanmedizin 1.2 VF in der Veterinärmedizin 1.3 Pathophysiologie des VF 1.4 Oxidativer Stress und dessen Rolle in der Pathogenese des VF 1.5 Biomarker des oxidativen Stress 1.6 Apoptose und Hypoxie im Rahmen des VF 1.7 ROS- und DNA-Schäden 1.8 Einfluss des Thioredoxin-Systems bei oxidativem Stress 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Geräte 3.2 Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien 3.3 Chemikalien und Reagenzien 3.4 Herzohrproben 3.4.1 Proteinextraktion Herzohrproben 3.4.2 Proteinkonzentrationsbestimmung der Herzohrgewebelysate 3.5 Bestimmung der Enzymaktivitäten 3.5.1 NOX-Aktivität 3.5.2 XO-Aktivität 3.5.3 SOD-Aktivität 3.5.4 Katalase-Aktivität 3.6 ELISA 3.6.1 AIF 3.6.2 Cytochrom C 3.6.3 HIF-1α 3.7 PCR 3.7.1 Isolierung der mtDNA 3.7.2 Bestimmung von Reinheit und Konzentration der mtDNA 3.7.3 Durchführung der PCR 3.7.4 Agarose-Gelelektrophorese 3.7.5 Isolierung der nucDNA 3.8. RT-PCR 3.9 SDS-PAGE und Western Blot 3.9.1 SDS-PAGE 3.9.2 Western Blot 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Gruppencharakteristika 4.2 Enzymkinetik 4.2.1 NOX-Aktivität 4.2.2 XO-Aktivität 4.2.3 SOD-Aktivität 4.2.4 Katalase-Aktivität 4.3 Quantifizierung der AIF-, Cytochrom C- und HIF-1α-Konzentrationen mittels ELISA 4.3.1 AIF 4.3.2 Cytochrom C 4.3.3 HIF-1α 4.4 Nachweis der 4977 bp-Deletion in der humanen mtDNA mittels PCR 4.5 Quantifizierung des realtiven mtDNA-Gehaltes mittels RT-PCR 4.6 Proteinexpressionsmessungen von TRX 1, TXNIP und ITCH mittels Western Blot 4.6.1 TRX1 4.6.2 TXNIP 4.6.3 ITCH 5 Diskussion 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis

Einleitung Streptococcus (S.) suis ist weltweit in Schweinepopulationen verbreitet. S. suis verursacht hohe wirtschaftliche Verluste durch das Auftreten von Meningitis, Arthritis, Serositis und Endokarditis und stellt als Zoonoseerreger gleichzeitig ein Risiko für den Menschen dar. Im Zusammenhang mit Infektionen in europäischen Schweinebetrieben werden Serotyp 2, 7 und 9 am häufigsten nachgewiesen. Die Bakteriämie spielt eine Schlüsselrolle in der invasiven S. suis Erkrankung und die Interaktion der Streptokokken mit den Immunzellen des Wirts im Blut ist entscheidend für den Ausgang der Infektion. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Arbeit, war die Untersuchung der Fähigkeit von porzinen Immunzellen S. suis durch Phagozytose und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu töten. Dabei wurden vor allem die Bedeutung von IgM und des Komplementsystems beleuchtet. In diesem Sinne, wurde auch die Arbeitshypothese untersucht, dass eine Modifizierung der bakteriellen Zellwand durch D-Alanylierung von Lipoteichonsäuren (LTAs) S. suis hilft, angeborene Immunfunktionen zu umgehen, wie z. B. die Opsonisierung mit Komplementfaktoren, sowie dass diese Zellwandveränderung die Interaktion von S. suis mit Leukozyten beeinflusst. Material und Methoden Die Bestimmung von ROS und dem Überleben der Streptokokken wurde in vivo im Blut zweier mit S. suis-infizierter Ferkel und in vitro in einem rekonstituierten Blutmodel durchgeführt. Die ROS-Messung erfolgte unter Zugabe von Dihydrorhodamine 123 mittels Durchflusszytometrie in Granulozyten. Verschiedene Inhibitoren wurden dabei eingesetzt: Apocynin um die NADPH Oxidase und damit die ROS-Bildung zu hemmen, Vaccinia Virus Complement Control Protein (VCP) für die Inaktivierung der Komplementkaskade und IdeSsuis um porzines IgM zu spalten. Mithilfe eines thermosensitiven Vektors wurde eine isogene Deletionsmutante des dltA Gens erstellt, um den Einfluss der D-Alanylierung von LTAs zu untersuchen. Die Sequenzierung des entsprechenden Genabschnitts und ein Southern Blot dienten der genetischen Verifizierung der Mutante. Weiterhin wurden Wachstumsverhalten, Hydrophobie und Ladung der Oberfläche sowie minimale Hemmkonzentrationen einer Reihe antimikrobieller Peptide für die dltA Mutante untersucht. Die Assoziation von Blutleukozyten mit S. suis wurde mithilfe von Far Red markierten Bakterien in der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zytokin-Messung erfolgte mit kommerziell erhältlichen Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)-Kits. Ergebnisse S. suis Stämme der Serotypen 2, 7 und 9 zeigten sich hochsensibel gegenüber Wasserstoffperoxid. Eine Hemmung der Bildung von ROS in rekonstituierten Blutproben führte selbst in Anwesenheit einer hohen Konzentration von S. suis-spezifischen Antikörpern zu einem signifikanten Anstieg des bakteriellen Überlebens. Die Induktion von ROS durch S. suis in Granulozyten wurde durch spezifische Antikörper verstärkt und hing partiell von der Anwesenheit funktionellen Komplements ab. In der Abwesenheit von IgG reduzierte die Spaltung von IgM oder die Inaktivierung von Komplement die ROS Produktion um mehr als das Dreifache, was in einem Anstieg des bakteriellen Überlebens resultierte. Der Mechanismus von S. suis D-Alanin in seine LTAs einzulagern, erhöhte die Hydrophobie der bakteriellen Oberfläche und reduzierte die Opsonisierung mit Komplementfaktor C3b, sowie die Phagozytose durch Granulozyten in Vollblut und die Assoziation von S. suis mit Monozyten and Lymphozyten. Trotzdem wurde das Überleben der Streptokokken in Blut, welches S. suis-spezifische Antikörper enthielt, nicht signifikant durch diese Zellwandmodifikation gesteigert. Allerdings war der durch die dltA Mutante induzierte Gehalt an IL-1β im Blut signifikant geringer als der durch den Wildtyp induzierte. Hohe Antikörperspiegel verursachten einen hochsignifikanten Anstieg der Interaktion von S. suis mit Monozyten, was bei diesen zum inflammatorischen Zelltod mit einer starken Sekretion von IL-1β und TNF-α führte. Schlussfolgerung Trotz einer Vielzahl an Abwehrmechanismen von S. suis gegen oxidativen Stress, stellen Phagozytose und ROS einen sehr effektiven Mechanismus des Immunsystems dar, um die eingedrungenen Streptokokken zu töten. Die Induktion von ROS durch S. suis hängt dabei stark von der Anwesenheit spezifischer Antikörper und teilweise von aktivem Komplement ab. Die Fähigkeit von S. suis D-Alanin in seine LTAs einzulagern, verändert Eigenschaften der bakteriellen Zellwand und vermittelt dabei Schutz vor angeborenen Immunmechanismen, wie antimikrobiellen Peptiden und dem Komplementsystem, aber sie sorgt nicht für ein besseres Überleben der Streptokokken, in der Anwesenheit von spezifischen Immunglobulinen. Sie reduziert die Assoziation von S. suis mit Monozyten, was etwas in Diskrepanz zu einer 2000 postulierten modifizierten „Trojanisches Pferd“-Theorie steht. Die durch LTA D-Alanylierung gesteigerte IL 1β Sekretion im Vollblut, führt zu der Schlussfolgerung, dass S. suis durch diese Zellwandmodifikation Entzündungsprozesse im Wirt beeinflusst.:Contents 1 Introduction 2 Literature 2.1 Streptococcus suis 2.1.1 Characteristics and classification 2.1.2 Epidemiology and Pathology 2.1.3 Pathogenesis of S. suis infection 2.1.4 Cell wall modifications of S. suis 2.2 Selected aspects of the porcine blood immune system 2.2.1 Characteristics and components of porcine blood 2.2.2 Innate immunity 2.2.2.1 Cellular innate immunity in blood 2.2.2.2 Humoral innate immunity in blood 2.2.3 Adaptive immunity 2.2.3.1 Cellular adaptive immunity in blood 2.2.3.2 Humoral adaptive immunity in blood 2.3 Interaction of S. suis with the blood immune system 2.3.1 Immune evasion strategies against blood leukocytes 2.3.2 Complement evasion and S. suis cell wall modifications 3 Publications 3.1 Survival of Streptococcus suis in Porcine Blood Is Limited by the Antibody- and Complement-Dependent Oxidative Burst Response of Granulocytes 3.2 D-Alanylation of Lipoteichoic Acids in Streptococcus suis Reduces Association with Leukocytes in Porcine Blood 4 Discussion 4.1 Phagocytosis and oxidative burst in porcine blood 4.2 Interaction of S. suis with blood monocytes and lymphocytes 4.3 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 Presentations given during the development of this thesis / Introduction Streptococcus (S.) suis is a widespread pathobiont in the porcine population. It is reason for high economic losses in the swine industry by causing meningitis, arthritis, serositis, and endocarditis, but also poses a threat to human health as a zoonotic pathogen. Serotype 2, 7 and 9 play an important role in European disease cases on pig farms. Bacteremia is a hallmark of invasive S. suis infections and the interaction of the streptococci with blood immune cells is crucial for the outcome of infection. Aim of the study The objective of this thesis was to investigate the ability of porcine blood immune cells to kill S. suis by phagocytosis and oxidative burst and the importance of IgM and the complement system in the killing process. In this context, I investigated the working hypothesis that modifying its cell wall by D-alanylation of lipoteichoic acids (LTAs) aids S. suis to evade certain functions of innate immunity, like opsonization with complement components, and influences the interaction of S. suis with blood leukocytes. Materials and Methods The investigation of reactive oxygen species (ROS) and colony forming units (CFU) was performed in vivo in the blood of two S. suis-infected piglets and in vitro in a reconstituted blood model. ROS were measured by addition of dihydrorhodamine 123 and flow cytometry analysis of granulocytes. To analyze the influence of immunological components, different inhibitors were used: apocynin inhibits the NADPH oxidase and therefore the ROS production, vaccinia virus complement control protein (VCP) inhibits the complement cascade and IdeSsuis cleaves porcine IgM. To investigate the role of D-alanylation of S. suis-LTA an isogenic in-frame deletion mutant of the dltA gene, ΔdltA, was generated by using a thermosensitive shuttle vector. It was genetically verified by sequencing of the respective gene sequence and southern blotting. Phenotypical characterization included growth behavior, evaluation of surface hydrophobicity and electric charge and minimal inhibitory concentrations of a number of antimicrobial peptides. The association of blood leukocytes with S. suis was investigated by flow cytometry, using Far Red-labeled S. suis stocks. Cytokines were detected by commercially available Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Results S. suis strains of serotype 2, 7 and 9 were shown to be highly susceptible to oxidative burst intermediate hydrogen peroxide and inhibition of oxidative burst in reconstituted blood samples led to a significant increase of bacterial survival, even in the presence of high S. suis-specific antibody levels. The induction of ROS in granulocytes in response to S. suis was enhanced by specific antibodies and partially depended on the presence of functional complement. In the absence of IgG, IgM cleavage or complement inactivation both reduced the ROS production more than 3-fold and resulted in increased bacterial survival in accordance with an IgM-complement-oxidative burst axis. The mechanism of S. suis to introduce D-alanine into its LTAs increased the hydrophobicity of its surface, reduced opsonization with complement factor C3b, reduced phagocytosis by granulocytes in whole blood and association with monocytes and lymphocytes in isolated peripheral blood mononuclear cells. Nevertheless, in whole blood containing S. suis-specific antibodies, survival of the streptococci was not significantly increased by this cell wall modification, but levels of IL-1β induced by ΔdltA were significantly lower than those induced by the wt. High antibody levels caused a highly significant increase in the interaction of S. suis with monocytes in isolated PBMCs leading to an inflammatory cell death associated with the secretion of high levels of IL-1β and TNF-α. Conclusion Despite numerous described defense mechanisms of S. suis against oxidative stress, phagocytosis and ROS represent a very effective way of the porcine immune system to kill the invading streptococci. The induction of ROS by S. suis is highly dependent on the presence of specific antibodies and partially depends on active complement. The ability of S. suis to D-alanylate its LTAs changes surface properties of S. suis and provides protection from innate host defenses like antimicrobial peptides and the complement system, but does not help the bacteria to survive in the presence of specific immunoglobulins. It reduces the association with monocytes, in contradiction to a proposed “modified trojan horse theory”. The increased IL-1β production in response to S. suis, due to LTA D-alanylation, leads to the suggestion that this surface modification influences inflammatory processes is the host.:Contents 1 Introduction 2 Literature 2.1 Streptococcus suis 2.1.1 Characteristics and classification 2.1.2 Epidemiology and Pathology 2.1.3 Pathogenesis of S. suis infection 2.1.4 Cell wall modifications of S. suis 2.2 Selected aspects of the porcine blood immune system 2.2.1 Characteristics and components of porcine blood 2.2.2 Innate immunity 2.2.2.1 Cellular innate immunity in blood 2.2.2.2 Humoral innate immunity in blood 2.2.3 Adaptive immunity 2.2.3.1 Cellular adaptive immunity in blood 2.2.3.2 Humoral adaptive immunity in blood 2.3 Interaction of S. suis with the blood immune system 2.3.1 Immune evasion strategies against blood leukocytes 2.3.2 Complement evasion and S. suis cell wall modifications 3 Publications 3.1 Survival of Streptococcus suis in Porcine Blood Is Limited by the Antibody- and Complement-Dependent Oxidative Burst Response of Granulocytes 3.2 D-Alanylation of Lipoteichoic Acids in Streptococcus suis Reduces Association with Leukocytes in Porcine Blood 4 Discussion 4.1 Phagocytosis and oxidative burst in porcine blood 4.2 Interaction of S. suis with blood monocytes and lymphocytes 4.3 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 Presentations given during the development of this thesis

Einleitung: Die Steroid-responsive Meningitis Arteriitis (SRMA) ist eine der häufigsten entzündlichen Erkrankungen des zentralen Nervensystems des Hundes. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es Rasse- und Geschlechtsprädispositionen anhand der Gesamtpopulation in Deutschland sowie epidemiologische und klinische Faktoren hinsichtlich der Rezidivrate von SRMA-Patienten zu untersuchen und zu beschreiben. Material und Methoden: Im Rahmen der ersten Teilstudie werden die Daten von 74 Hunden mit SRMA retrospektiv erhoben und einer von drei Gruppen zugeordnet: (1) ohne Rezidiv; (2) mindestens ein Rezidiv und (3) unbekannter Rezidivstatus. Die folgenden Parameter werden für die ersten beiden Gruppen beschrieben: Geschlecht, Alter, Rasse, Körpergewicht, Analyse des Liquor cerebrospinalis (Proteinkonzentration, Anzahl der kernhaltigen Zellen, Prozentsatz an Neutrophilen, Immunglobulin A (IgA) und C-reaktives Protein (CRP) bei Erstvorstellung), IgA und CRP im Serum bei Erstvorstellung sowie die Anzahl der kernhaltigen Zellen und CRP im Liquor cerebrospinalis und CRP im Serum bei der Kontrolluntersuchung nach drei Monaten. In der zweiten Teilstudie werden die Daten von 153 Hunden mit Steroid-responsiver Meningitis-Arteriitis retrospektiv in einer Multicenterstudie analysiert. In dieser Studie wird untersucht, ob einzelne erkrankte Hunderassen (n ≥ 5) überproportional häufig, im Vergleich zur Rasseverteilung in der Gesamtpopulation der Hunde in Deutschland, vertreten sind. Als Datengrundlage wird die Welpenstatistik des Verbandes für das deutsche Hundewesen (VDH) des Jahres 2016 und die Anzahl der im Haustierregister Tasso e. V. (Stand 2018) gemeldeten Hunde verwendet. Des Weiteren wird der Einfluss des Geschlechts in Hinsicht auf die Erkrankungsrate von SRMA-Patienten untersucht. Bezüglich des Auftretens eines oder mehrerer Rezidive werden folgende mögliche Einflussfaktoren untersucht: Geschlecht, Gewicht, Alter bei Erstvorstellung, zeitlicher Abstand zur letzten Impfung, Zeitspanne zwischen Symptombeginn und Erstvorstellung, Symptome (reduziertes Allgemeinbefinden, zervikale Dolenz, Fieber, neurologische Defizite), Ergebnisse der Analyse des Liquor cerebrospinalis bei Erstvorstellung (Anzahl kernhaltiger Zellen und deren Differenzierung, Eiweißkonzentration), Konzentrationen von IgA und CRP in Serum und Liquor cerebrospinalis bei Erstvorstellung, angewandte Immunsuppressiva, Ansprechen auf die Therapie und die Nachbeobachtungszeit sowie die Todesrate infolge der Erkrankung oder ihrer Therapie oder der daraus folgenden Euthanasie. Ergebnisse: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass in Hinblick auf die Rasse ein signifikanter Einfluss auf die Entstehung von SRMA (p < 0,05) besteht. Beagle und Boxer erkranken in Relation zur Gesamtpopulation in Deutschland häufiger als andere Hunderassen. Rezidive treten bei ungefähr einem Drittel der Hunde in beiden Teilstudien auf. Männliche Hunde haben ein signifikant höheres Risiko an SRMA zu erkranken (p < 0,005). Im Gegensatz dazu erleiden weibliche Hunde signifikant häufiger ein Rezidiv (p = 0,02). In der ersten Teilstudie erleiden 62,5 % einen Rückfall, 25,0 % zwei Rückfälle, 8,3 % drei Rückfälle, 4,2 % vier Rückfälle. 55,4 % der Patienten waren rezidivfrei und bei 12,2 % war der Rückfallstatus unbekannt. Patienten mit einer Prednisolon-Monotherapie erleiden seltener ein Rezidiv als bei einer Kombination von Prednisolon und Azathioprin (p < 0,05). Sowohl jüngere SRMA-Patienten bei Erstvorstellung (p = 0,071) als auch eine niedrigere Konzentration des CRP im Serum (p = 0,081) bei Erstvorstellung scheinen mit einer Tendenz des Auftretens von Rezidiven assoziiert zu sein. Bei Hunden ohne Rezidiv war das CRP in Serum bei 100 % und Liquor cerebrospinalis bei 90 % der Hunde zur Kontrolle nach drei Monaten normal. Aber auch bei Rezidivpatienten war das CRP zu diesem Zeitpunkt bei 80 % der Hunde im Serum und bei 75 % im Liquor cerebrospinalis normal. Somit erfordert ein erhöhtes CRP im Serum oder Liquor eine Fortsetzung der Therapie, während ein normales CRP im Serum oder Liquor zum Therapieende einen zukünftigen Rückfall nicht ausschließt und damit als Indikator für ein mögliches Rezidiv ungeeignet ist. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse dieser Untersuchung ermöglichen eine bessere Besitzeraufklärung über den möglichen weiteren klinischen Verlauf erkrankter Hunde und das Risiko eines späteren Rezidivs. Die ermittelten Rasse- und Geschlechtsprädispositionen erleichtern die Diagnosestellung einer Steroid-responsiven Meningitis-Arteriitis und untermauern teilweise die Ergebnisse vorangegangene Studien.

Direkter Tierkontakt gehört zu den wirkungsvollsten Elementen des Besuchererlebnisses in Zoologischen Gärten. In Streichelzoos hat der Zoobesucher unkontrollierten und unmittelbaren Kontakt mit kleinen Wiederkäuern und insbesondere mit Ziegen. Diese Anlagen können ein Zoonoserisiko darstellen, da Ziegen asymptomatische Träger von verschiedenen zoonotischen Krankheitserregern sein können und in der Vergangenheit bereits Übertragungen auf den Menschen nach Kontakt mit Streicheltieren nachgewiesen wurden. Es sollte das Vorkommen ausgewählter zoonotischer Pathogene (Shigatoxin-produzierende Escherichia coli (STEC), Coxiella burnetii, Campylobacter spp., Arcobacter spp., Salmonella spp., Yersinia spp., Enterobacteriaceae mit beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum (ESBL), Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Dermatophyten) bei klinisch gesunden Ziegen in Streichelzoos Zoologischer Gärten in Deutschland untersucht werden. Aus 21 Herden in 14 tiergärtnerischen Einrichtungen in Deutschland wurden 300 klinisch gesunde Ziegen im Rahmen tierärztlicher Routineuntersuchungen beprobt. Der Nachweis von STEC und Salmonella spp. wurde aus Rektaltupfern über die Anzucht auf GCG-Agar versucht. Für Escherichia coli verdächtige Kulturen wurden auf Blutagar überführt und auf ausgewählte Virulenzgene per PCR untersucht. In der Folge wurde eine Serotypisierung vorgenommen. Nach Coxiella burnetii wurde in Vaginaltupfern der 230 weiblichen Tieren der Studie mittels einer real-time PCR (qPCR) gesucht. Campylobacter spp. und Arcobacter spp. aus Rektaltupfern wurden nach Isolation über Selektivnährböden unter mirkoaerophilen Bedingungen jeweils per Multiplex-PCR und qPCR auf Artebene bestimmt. Rektaltupfer wurden nach einer Kälteanreicherung mit folgender Anzucht auf Selektivnährböden auf Yersinia spp. untersucht. Nach Anzucht über einen ESBL-Selektivagar auf Basis von Rektaltupfern wurden verdächtige Kolonien mit einem VITEK-System artbestimmt und auf mögliche Antibiotikaresistenzen untersucht. Beta-Lactamase-Gene wurden mittels PCR identifiziert. Das aus Nasentupfern stammende Untersuchungsmaterial zum MRSA-Nachweis wurde nach Anreicherung einer Kultur auf einem Selektivnährboden zugeführt. Eventuelle Kolonien wurden auf einen Blutagar transferriert und danach per MALDI-TOF massenspektrometrisch untersucht. Positive Proben wurden durch PCR-Microarray untersucht. Mit einer modifizierten Mackenzie-Brush- Methode gewonnene Hautschuppen wurden über einen Pilzagar und einen selektiven Dermatophytenagar untersucht. Demographische Korrelationen zum Auftreten von Campylobacter spp. wurden mit einem exakten Test nach Fisher evaluiert. Campylobacter spp. wurden bei 22,7 %, STEC bei 20,0 % und Arcobacter spp. bei 1,7 % der 300 getesteten Ziegen nach der Kultur aus Rektaltupfern und der folgenden PCR nachgewiesen. Die Prävalenz von Campylobacter spp. war bei juvenilen höher als bei adulten Tieren (53,0 % gegenüber 14.1 %; p<0,0001). Ein Isolat der Art Escherichia fergusonii trug phänotypisch Hinweise auf eine ESBL, die durch den Nachweis des Gens blaCTX-M-1 bestätigt wurde. Aus den Nasentupfern von 20,7 % der beprobten Ziegen konnte Staphylococcus aureus kultiviert werden, darunter auch ein mecC-positiver MRSA. Weder Salmonella spp. noch Yersinia spp. fanden sich in der Stichprobe und auch der Nachweis von Dermatophyten gelang bei einer häufigen Überwucherung durch ubiquitäre Pilze (19,3 %) nicht. Unter den 230 weiblichen Ziegen der Studie gab es bei zwei Tieren positive PCR- Signale für Coxiella burnetii, die nach ausgiebiger Nachbeprobung und epidemiologischer Prüfung als falsch-positiv gewertet werden mussten. Grundsätzlich muss vom Vorhandensein einiger Zoonoseerreger in Ziegenbeständen in Streichelzoos ausgegangen werden, da Campylobacter spp. und STEC regelmäßig in der Stichprobe auftraten. Damit sollte das Risiko der Übertragung zoonotischer Bakterien von Ziegen auf Zoobesucher beim Betrieb entsprechender Anlagen Berücksichtigung finden. Angemessene Informationen und Einrichtungen zum Waschen der Hände und zur Handdesinfektion sollten in jedem Fall zur Verfügung gestellt werden. Zum genaueren Verständnis des vermehrten Auftretens von Campylobacter spp. bei jungen Ziegen sind weitere Untersuchungen notwendig. Die Identifikation von asymptomatischen Ziegen mit einer Dermatophyteninfektion bedarf einer modifizierten Technik.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Geschichte und tiergärtnerische Bedeutung des Streichelzoos 3 2.2 Ausgewählte Zoonoseerreger bei Ziegen 4 2.2.1 Shigatoxin-bildende Escherichia coli 4 2.2.1.1 Erreger 4 2.2.1.2 Bedeutung bei der Ziege 5 2.2.1.3 Bedeutung beim Menschen 5 2.2.2 Coxiella burnetii 5 2.2.2.1 Erreger 5 2.2.2.2 Bedeutung bei der Ziege 6 2.2.2.3 Bedeutung beim Menschen 7 2.2.3 Campylobacter spp. 7 2.2.3.1 Erreger 7 2.2.3.2 Bedeutung bei der Ziege 8 2.2.3.3 Bedeutung beim Menschen 8 2.2.4 Arcobacter spp. 9 2.2.4.1 Erreger 9 2.2.4.2 Bedeutung bei der Ziege 9 2.2.4.3 Bedeutung beim Menschen 10 2.2.5 Salmonella spp. 10 2.2.5.1 Erreger 10 2.2.5.2 Bedeutung bei der Ziege 11 2.2.5.3 Bedeutung beim Menschen 11 2.2.6 Yersinia spp. 12 2.2.6.1 Erreger 12 2.2.6.2 Bedeutung bei der Ziege 12 2.2.6.3 Bedeutung beim Menschen 13 2.2.7 beta-Laktamasen mit breitem Wirkungsspektrum 13 2.2.7.1 Erreger 13 2.2.7.2 Bedeutung bei der Ziege 14 2.2.7.3 Bedeutung beim Menschen 14 2.2.8 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus 15 2.2.8.1 Erreger 15 2.2.8.2 Bedeutung bei der Ziege 15 2.2.8.3 Bedeutung beim Menschen 16 2.2.9 Dermatophyten 16 2.2.9.1 Erreger 16 2.2.9.2 Bedeutung bei der Ziege 17 2.2.9.3 Bedeutung beim Menschen 17 3 Veröffentlichung 19 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten an der Publikation 19 3.2 Publikation 20 4 Diskussion 31 5 Zusammenfassung 35 6 Summary 37 7 Literaturverzeichnis 39 8 Danksagung

Kleinsäuger sind als Wirte ein wichtiger Teil des Lebenszyklus von Zecken, besonders für subadulte Stadien. Sowohl Kleinsäuger als auch Zecken sind von gesundheitlicher Relevanz, da sie Reservoire und Vektoren für mehrere durch Zeckenübertragene-Pathogene sind. Ziele der Studie waren: (i) die Abundanz von Nagern, ihren Zecken und Zecken aus der Umgebung festzustellen; (ii) die Prävalenz von Anaplasma phagocytophilum, Neoehrlichia mikurensis, Rickettsia spp., Bartonella spp., Borrelia burgdorferi (s.l)., Babesia spp. und Hepatozoon spp. in den Nagern und Zecken zu bestimmen; (iii) Die Ergebnisse mit denen, der vergangener Studien, in einem zeitlichen Zusammenhang zu vergleichen, um möglicherweise einen Trend in der Ausbreitung und Verteilung der zoonotischen Krankheitserreger aufzuzeigen.

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